 Advances in Environmental Protection 环境保护前沿, 2013, 3, 54-58 doi:10.4236/aep.2013.31B012 Published Online March 2013 (http://www.hanspub.org/journal/aep.html) Study on Content and Antimutagenic Effect of Lentinas Edodes Polysaccharides Haixing Ruan, Hong Yu, Jia Liu Guizhou Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China Email: haixingruan@yahoo.com.cn Received 2013 Abstract: Objective: To analyze the content of polysaccharides in lentinas edodes and investigate the effect on an- timutation of polysaccharides, so as to provide the reference for exploitation and utilization of lentinas edodes. Meth- ods: Lentinas edodes polysaccharides were measured by sulfuric acid-phenol test. Ames assay, micronucleus formation assay and testicle cells chromosome aberration test were used to analyze the antimutagenic activities of Lentinas edodes polysaccharides. Results: The content of lentinas edodes polysaccharides ranged from 0.236 mg/g (dry weight) to 0.268 mg/g (dry weight). In four treatment groups (added S9 or not), the lentinas edodes polysaccharides in TA98 and TA100 could effectively inhibit revertant colonies induced by Dexon, MMS and 2-AAF, and the inhibitory rates were 37.7%, 69.8%, 70.3%, 78.1%, 39.0%, 78.1%, 83.0% and 88.6%, respectively. The lentinas edodes polysaccharides could inhibit cyclophosphamide-induced micronucleus formation of polychromatic erythrocytes of mice bone in treatment groups with the inhibitory rate of 31.80%, 52.80% and 63.10%, respectively. The lentinas edodes polysaccharides could mark- edly reduce the rate of chromosome aberration in mice testicle cells induced by mitomycin C, and the inhibitory rates were 13.9%, 23.3% and 77.9%, respectively. Conclusions: The polysaccharide of lentinas edodes has certain ability of antimutation. Keywords: Lentinas Edodes; Content of Polysaccharides; Antimutation 香菇多糖成分测定及抗突变作用的研究 阮海星，俞 红，刘 佳 贵州省疾病预防控制中心 550004 Email: haixingruanyahoo.com.cn 收稿日期：2013 摘 要：目的: 本研究通过分析香菇中的多糖及其抗突变作用，为香菇的开发和利用提供科学依据。方法: 采 用硫酸-苯酚法测定香菇多糖；通过鼠伤寒沙门氏菌/微粒体酶试验(Ames) 、小鼠骨髓细胞微核试验和睾丸生殖 细胞染色体分析方法对香菇提取液(多糖部分) 进行了抗突变试验。结果: 香菇中多糖含量为 0.252 ± 0.016 mg/g(干品计) ；香菇多糖提取液的 4个剂量组在加与不加微粒体酶活化系统(S9)的条件下, 均能抑制由敌克松 ( Dexon)、甲基甲烷磺酸酯( MMS)和2-乙酰氨基芴(2- AAF)所引起的 TA98、TA100 回变菌落数的增加；抑制率 分别为 37.7%、69.8%、70.3%、78.1%、39.0%、78.1%、83.0%和88.6%。香菇多糖提取液能抑制由环磷酰胺（40.0 mg）引起的小鼠微核率的增加,抑制率分别为 31.8%、52.8%和63.1%；同时也抑制由丝裂霉素-C（2.0 mg）引起 的小鼠的睾丸生殖细胞染色体畸变率的增加，抑制率分别为13.9%、23.3%和77.9%。结论：香菇具有一定的抗 突变作用。 关键词：香菇；多糖含量；抗突变 *基金项目：贵州省卫生厅科技基金课题( 20030163) Copyright © 2013 Hanspub 54  香菇多糖成分测定及抗突变作用的研究 Copyright © 2013 Hanspub 55 1 引言 香菇( Lentinas edodes) , 在我国素有“山珍之称” , 它不仅味美，肉鲜嫩可口，而且含有多糖、蛋白质、 氨基酸、脂肪、碳水化活物、维生素和微量元素。有 资料表明: 常食香菇, 有预防佝偻病、感冒、降低血 压、血脂、提高免疫、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激 干扰素形成的功能[1] 。为进一步分析香菇中的多糖含 量及抗突变作用的功能, 我们对香菇进行了多糖成分 测定和抗突变试验研究, 旨在为香菇的开发和利用提 供科学依据。 2 材料与方法 2.1 方法 采用硫酸-苯酚法测定多糖; 依照卫生部保健食 品功能学评价程序和方法[4] , 对香菇进行多抗突变试 验。 2.2 实验器材 1）样品收购:香菇购于贵阳新发食品有限公司生 产的干品, 生产基地位于贵州省黔东南地区。 2）样品多糖部分的制备 :按文献[2] 方法 进行 , 将 香菇干品置 60℃,2~3 h, 粉碎成粗粉, 用蒸馏水浸泡 2 h, 加热煮沸, 控制温度继续加热 30 min。冷却后用 双层纱布过滤, 压榨, 重复 1 次, 合并 2 次虑液于 80 ℃水浴减压浓( 1 ml = 0.5 g 干品) 。浓缩液中加入 等量的95%乙醇, 混匀, 沉淀后离心, 沉淀物为糖部 分( 受试物) 备用。 3）多糖的精制:按文献[3] 方法进行, 精确吸取上 述试液 10 ml, 加入4 倍( 40 ml) 95%乙醇, 于60 ℃水 浴上密封提取 1 h, 弃上清, 沉淀用 5 ml 95%乙醇洗 3 次。沉淀物加入 50 ml 水, 在80℃水浴中加热溶解 30 min, 过滤,残渣用 5 ml 热水洗 3次, 与滤液合并, 冷 却后移至 100 ml 容量瓶中, 定容, 备用。 4）试验菌株:所采用的指示菌为鼠伤寒沙门氏菌 组氨酸缺陷型 TA98、TA100 经生物学鉴定合格后进 行试验。 5）试验动物:昆明种成年小鼠, 由贵阳医学院实 验动物中心提供,体重 25~30 g , 合格证号: SCXK ( 黔) 2002- 0001 ( 实验动物合格证号) 。 6）仪器 723 型分光光度计( 上海分析仪器厂生 产) 。 2.3 实验方法 1）香菇中多糖含量测定 按2.2 的3)多糖的精制 的阐述, 精确吸取。 2）所得待测样品液 2.0 ml 于10 ml 容量瓶中定 容, 再吸取 2.0 ml 于10 ml 试管中, 并做平行样( n = 4), 同时做空白实验。用硫酸! 苯酚法测定多糖的含 量。 3）鼠伤寒沙门氏菌/微粒体酶(Ames) 试验：按方 法[4] 进行试验, 采TA98、TA100 合格菌株, 用平板 掺入法的预培养法试验。设剂量组2.5 mg/ 0.1 mL + 阳性物、5.0 mg/0.1 mL + 阳性物、10.0 mg/ 0.1 mL + 阳性物、20.0 mg/ 0.1 mL + 阳性物, 共4 个组。另设 阴性蒸馏水、二甲亚砜溶剂( DMSO) 与致突变阳性物 ( Dexon、MMS、2-AAF) 用二甲亚砜配制。试验采用 方法 A: 受试物直接灭活致突变物加与不加 S9; 方法 B: 受试物间接灭活致突变物加与不加S9; 2种方法进 行。37℃ 培养 48 h, 计数菌落数。 4）小鼠骨髓细胞微核试验：按[ 4] 中所述方法 进行试验, 受试物试验设1.5 g/ kg BW; 3.0 g/ kg BW; 6.0 g/kg BW 3 个剂量组, 另设阻性( 蒸馏水) 及致突 变物( CP40.0 mg / kg BW) 对照组。采用 25 ~ 30 g 健 康雌性小鼠, 阴性与致突变物对照组均给予同等量的 蒸馏水, 试验组分别给予受试物, 经口连续给予 30 d, 在试验第 30 d 和第 31 d 经口给予致突变物( CP40.0 mg/ kg BW) , 于末次给予致突变物后 6 h 颈椎脱臼处 死动物, 取胸骨骨髓制片、镜检。每只小鼠镜检分析 1 000个嗜多染红细胞( PCE) 微核(MCN) 数, 以千分 率表示。 5）小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验：按[ 4] 中所述方法进行试验, 受试物试验设 1.5 g/ kg BW; 3.0 g/ kg BW; 6.0 g/kg BW 3 个剂量组, 另设阻性( 蒸 馏水) 及致突变物( CP40.0 mg / kg BW) 对照组。采用 25~30 g 健康雄性小鼠, 阴性与致突变物对照组均给 予同等量的蒸馏水, 试验组分别给予受试物, 经口连 续给予 30 d, 在试验第 30 d 和第31 d 腹腔注射给予 致突变物丝裂霉素-C( MMC2.0 mg/ kg BW) ,12 d颈椎 脱臼处死动物, 取睾丸制片、镜检。每只小鼠镜检分 析100 个中期相细胞,计算细胞的畸变率及抑制率以  香菇多糖成分测定及抗突变作用的研究 千分率表示。 2.4 统计学方法 多糖的含量根据所得吸光度值, 由回归方程计算 样品中的多糖含量。Ames 试验数据用方差分析统计。 计算其抑制率[ 5] 。小鼠骨髓细胞微核试验数据采用 泊松分布进行 U检验。小鼠睾丸初级精母细胞染色体 畸变试验采用卡方 X2进行统计。 3 结果 3.1 多糖含量的测定 按2.3 的1）香菇中多糖含量测定中所测的多糖 吸光度值结果, 并计算出多糖的含量，见表 1。 样品号 1 2 3 4 x吸光度 1.964 1.925 1.931 1.956 1.944 多糖含量 0.256 0.250 0.252 0.254 0.252。 3.2 Ames试验结果 方法 A 和方法 B, 在加与不加 S9 的条件下, 受 试物对 TA98、TA100 的拮抗作用, 表现在受试物直 接灭活(方法A) 致突变物与受试物间接灭活(方法 B) 致突变物的试验中, 均有不同成度抑制由Dexon、 MMS、2-AAF 引起的 TA98、TA100 回变菌落数的增 加,且抑制率随受试物剂量增加而 增加, TA98 高达 78%、TA100 高达 88.6%。各受试物剂量组与致突变 物组相比,经统计处理差异有统计学意义( P < 0.05; P < 0.01)。有剂量-反应关系。见表3。 Table 1. lentinas edodes content determine(mg/g various) 表1. 香菇中多糖的含量测定结果(mg/g 干品计) 样品号 1 2 3 4 X S 吸光度 1.964 1.925 1.931 1.956 1.944 0.016 多糖含量 0.256 0.250 0.252 0.254 0.252 0.002 Table 2. Ames test TA98、TA100、spontaneous back to variable colony and mutagenic colon 表2. 鼠伤寒沙门氏菌 TA98、TA100 自发回变菌落数与致突变物菌落数( ± s) TA98 TA100 菌液量(0.1 mL) - S9 + S9 - S9 + S9 自发回变数 A 37.0 ± 6.0** 41.0 ± 7.0** 134.0 ± 19.0** 124.0 ± 8.0** B 38.0 ± 7.0** 33.0 ± 3.0** 147.0 ± 12.0** 139.0 ± 29.0* 诱发回变数 A 1344.0 ± 66.0 2793.0 ± 250.0 2981.0 ± 532.0 3510.0 ± 61.0 B 1052.0 ± 120.0 1169.0 ± 303.0 3523.0 ± 153.0 624.0 ± 56.0 注: - S9: 致突变物TA98 Dexon (30 μg/0.1 mL) 、MM S ( 1.0 μ L/0.1 mL)、+ S9: 2- AAF ( 40.0 μg/0.1 mL)**: P < 0.01; *: P < 0.05。 A: 方法 A, B: 方法 B。 Table 3. lentinas extract and mutagenic tingsTA98、TA100 colony ( ± s )and inhibition rate 表3. 香菇提取物 + 致突变物对 TA98、TA100 菌落形成数( ± s 个) 与抑制率( × 10- 2) TA98 TA100 受试物剂量 (mg/0.1mL) - S9 抑制率 + S9 抑制率 - S9 抑制率 + S9 抑制率 2.5 A 887.0 ± 175.0 37.7 1880.0 ± 87.037.7 1705.0 ± 545.044.8 2182.0 ± 778.0 39.0 B 945.0 ± 260.0 10.8 1041.0 ± 178.011.1 2736.0 ± 3 76.023.3 4070.0 ± 167.0 39.1 5.0 A 424.0 ± 50.0 69.8 1546.0 ± 604.045.3 1546.0 ± 206.056.9 1087.0 ± 746.0 78.1 B 1071.0 ± 481.0 2.9 1010.0 ± 64.014.0 1761.0 ± 685.052.2 551.0 ± 94.0 6.6 10.0 A 418.0 ± 42.0 70.3 1705.0 ± 544.041.2 1066.0 ± 109.067.3 683.0 ± 214.0 83.0 B 449.0 ± 48.0 59.4 894.0 ± 310.024.0 3140.0 ± 569.062.8 511.0 ± 81.0 15.6 20.0 A 316.0 ± 83.0 78.1 814.0 ± 127.039.1 954.01 ± 124.081.5 521.0 ± 128.0 88.6 B 767.0 ± 209.0 28.1 826.0 3 ± 38.030.5 1335.0 ± 458.064.2 531.0 ± 131.0 11.1 Copyright © 2013 Hanspub 56  香菇多糖成分测定及抗突变作用的研究 3.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 随受试物剂量增加, 各受试物剂量组与致突变物 组相比, 微核数明显减少。3个剂量组随剂量增加而 出现的微核数有所减少, 抑制率增加，其抑制率分别 为: 31.8%、52. 8%、63.1%。差异均有统计学意义( P < 0.01) 。有剂量反应-关系。见表 4。 3.4 小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验结果 随受试物剂量增加, 各受试物剂量组与致突变物 组相比, 片段、环状体畸变细胞明显减少, 抑制率增 加，常染色体单价体及性染色体单价体细胞数明显减 少，畸变率降低。3个剂量组出现生殖细胞畸变率分 别为：34.3%、32. 3%、20.5% 。随剂量增加而出现的 畸变细胞数有所减少, 抑制率有所增加, 抑制率分别 为差异均有统计学意义( P < 0.05, P < 0.01)。有剂量反 应-关系，见表5。 4 讨论 据资料[1] 报道香菇多糖具有较好的生理活性及 功效。多糖是由单糖连接而成的多聚物, 现代研究证 明, 香菇中所含的多糖主要为甘露醇, 海藻糖、菌糖、 葡萄糖、戊聚糖和甲基戊聚糖等6 种多糖体[1] 。这 些多糖及糖复合物参与和介导细胞各种生命现象的 调节, 参与人体免疫功能调节和 T 淋巴细胞活性, 可 降低甲基类化合物诱发肿瘤的能力, 对癌细胞有较强 的抑制作用[6]。经试验表明, 对小白鼠肉瘤 180 的抑 制率为 97.5%, 对艾氏癌的抑制率为 80%。香菇中还 含有双链核糖核酸, 能诱导产生干扰素,具有抗病毒 的能力[6], 从而对提高机体免疫起着积极的保护作 用。此外, 香菇中含有 16 种氨基酸, 其中7 种是人 体必需氨基酸和钙、铁、锌、锰、镁、磷，硒等必需 矿物元素。所含氨基酸对维持人体生命健康基础起着 积极的作用。而矿物元素对参与人体代谢, 维持机体 自身稳定性有着十分重要的作用[10]。故认为, 香菇提 取物对可引起的染色体断裂剂(CP) DNA分子的损伤 和伤害起到了一定的预防作用。 在本试验研究中, 用硫酸! 苯酚法测定多糖的含 量。在抗突变试验研究中即体现了体外、体内细胞相 结合的评价的原则, 对香菇的功效成分进行了抗突变 作用的验证,并提供了科学依据。建议进一步开发香菇 Table 4. lentinas extract mutagenic tings mice micronucleus cells influence and inhibition rate 表4. 香菇提取物对致突变物引起的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响( × 10-3 )及抑制率( × 10-2 ) 受试物剂量(g/kg/BW) 嗜多染红细胞数(个)核率细胞数(个) 微核率( ± s%) 抑制率(%) 0.0 10000 14 1.40 ± 0.97 （+） 10000 209 20.9 ± 3.84 1.5 10000 147 14.7 ± 2.58* 31.80 3.0 10000 106 10.6 ± 2.07** 52.80 6.0 10000 86.8 8.60 ± 2.22** 63.10 注: 0.0: 阴性( 蒸馏水) 对照组、( + ) : CP ( 40 0 mg/kgBW) 。*: P < 0.05; **: P < 0.01。 Table5. lentinas extract mutagenic tings mice testicular chromosome distortion rate influence and inhibition rate 表5. 香菇提取物对致突变物引起的小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变率的影响及抑制率 受试物剂量(g/kg/BW) 观察细胞数(个) 畸变细胞细胞数(个)未畸变细胞数 畸变率( ± s%) 抑制率(%) 0.0 800 102 698 12.75 ± 9.0 （+） 800 298 502 37.25 ± 3.84 1.5 800 274 526 34.25 ± 5.17* 13.95 3.0 800 258 542 32.25 ± 5.18** 23.25 6.0 800 164 636 20.05 ± 9.53** 77.90 注: 0.0: 阴性( 生理盐水) 、对照组、( + ) : MMC ( 2.0 mg/kgBW) 。*: P < 0.05; **: P < 0.01。 Copyright © 2013 Hanspub 57  香菇多糖成分测定及抗突变作用的研究 的深加工技术,对保健食品进行有效剂型的研究, 以 提高人体利用度, 使香菇的有效成分, 成为保健食品 的功效因子。为香菇的保健作用开辟更广阔的应用前 景。 参考文献 (References) [1] Chinara. G. 香菇多糖免疫药理作用[J]. 国外医学植物学分册, 1993, 8 ( 4) : 165- 166. [2] 中国医学科学院药物研究所. 中药有效成分的研究[M] . 北 京: 人民出版社, 1972：227-228. [3] 佘晓雷, 张可, 郑旭霞. 芦荟中多糖含量测定方法的探讨[J] . 营养学报, 2003, 25（2）: 149-152. [4] 卫生部监督司, 保健食品功能学评价程序和方法[S ] . 1996： 63-66. [5] 赵素娟, 王淑惠, 邓雪, 等. 盐藻素抗突变作用的初探[J].卫 生毒理学杂志, 2003, 17: 65-66. [6] 陈冠敏, 林升清, 黄宗秀, 等. 香菇抗突变作用的研 究[J] .癌 变、畸变、突变, 2000, 12 ( 2) : 105-108. [7] Y. He. Effects of Carotenids on aflatoxin B- induced mutagene- sis in Styphimurium TA98 and TA100. Nutr Cancer, 1990, 13 （4）: 243- 247 Copyright © 2013 Hanspub 58 |