 Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2013, 3, 17-22 http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2013.33004 Published Online July 2013 (http://www.hanspub.org/journal/hjbm.html) Rapid Detection of Respiratory Bocavirus by Loop Mediated Isothermal Amplification Zheming Yan1, Yun Xiang2, Shike Hu1, Jiayun Zhang2, Xingchun Tang1*, Hongwu Ai2* 1College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 2Department of Laboratory Medicine, Wuhan Children’s Hospital, Wuhan Email: *tangxingchun@hubu.edu.cn, *ahw066@126.com Received: Apr. 16th, 2013; revised: Apr. 25th, 2013; accepted: May. 9th, 2013 Copyright © 2013 Zheming Yan et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Objective: To Build a method (LAMP, Loop mediated isothermal amplification) for detecting Human Bocavirus. Methods: By designing 4 LAMP primers specified for 6 sites in NP1 gene sequence of Bocavirus, we built a system to detect Human Bocavirus. And we detected 60 oropharyngeal swab samples by using this system and realtime fluores-cence quantitative PCR to check whether this system works well at the same time. Results: We found that we can get the production through the LAMP amplification and the gel electrophoresis results of the 60 samples, in which we found 8 positive samples, are consensus between the realtime fluores-cence quantitative PCR and the LAMP system. Conclusion: LAMP, a kind of quick, simple, specific, sensitive and low cost method in detecting the nucleic acids of virus, is an ideal alternative for quick screening assay and clinical detection in medical institutions because of the experimental instruments and requirements are not high. Keywords: LAMP—Loop Mediated Isothermal Amplification; Human Bocavirus; Realtime Fluores-Cence Quantitative PCR 环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒 闫明哲 1，向 贇2，胡适可 1，张家云 2，汤行春 1*，艾洪武 2* 1湖北大学，生命科学学院，武汉 2武汉市儿童医院，检验科，武汉 Email: *tangxingchun@hubu.edu.cn, *ahw066@126.com 收稿日期：2013 年4月16 日；修回日期：2013年4月25 日；录用日期：2013 年5月9日 摘 要：目的：建立一种检测呼吸道博卡病毒的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法：通过博卡病毒 NP1 基因 特异性序列的 6个位点设计 4条LAMP 引物，建立 LAMP 检测体系。并对60 例疑感染者的咽试子,同时采用实 时荧光定量 PCR 和LAMP 方法进行博卡病毒核酸的检测。结果：通过凝胶电泳能观察到 LAMP 方法扩增引物 的存在，且采用此体系的检测 60 份咽试子中 8份阳性反应和实时荧光定量 PCR 检测结果一致。结论：博卡病 毒核酸的LAMP 检测方法快速、简单、特异、灵敏、成本低，对实验仪器设备要求不高，适用于基层医疗机构 临床检测和现场快速诊断。 关键词：环介导等温扩增技术；博卡病毒；实时荧光定量 PCR 1. 引言 人博卡病毒(human bocavirus, HBoV)是2005 年瑞 典科学家 Allander 等[1]对呼吸道感染患儿鼻咽分泌物 进行检测时，在鼻咽分泌物中发现的一种新病毒。 HBoV 属于细小病毒科(parvoviridae)，细小病毒亚科， *通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 17  环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒 博卡病毒属，是单链DNA 病毒，会引起急性呼吸道 感染。HBoV在儿童中，特别是<3 岁的婴幼儿有很高 的感染率以及共感染，但 HBoV 在成人中很少检测到 [2,3]。环介导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP) ，是指在一种具有链置换活性 的DNA 聚合酶的协助下使用 2对引物对模板的 6个 位点在恒温(60℃~65℃之间)条件下，1 h内即可完成 反应[4]。目前 LAMP 已经被广泛的应用于各种样品的 DNA 和RNA 检测中。Poon等利用 LAMP 技术建立 了严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)的检测 方法[5]。也有人将此方法用于胚胎性别鉴定和不同病 原体的检测[6]。 因此，本文建立了一种操作简便、灵敏度较高以 及特异性较强的检测 HBoV 的LAMP方法。 2. 材料与方法 2.1. 标本的采集 根据“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 科技重大专项传染病监测技术平台项目中的“发热呼 吸道症候群监测方案”进行操作。收集 2012 年5~7 月武汉市儿童医院检测儿童的咽试子。将咽试子样本 加入一定量缓冲液PBS 充分振荡，然后 8000 rpm离 心5 min，吸取上清液加入到冻存管中保存到−80℃备 用。 2.2. 仪器与试剂 仪器：PCR 仪器(applied biosystems)，核酸提取 试剂盒(Roche)，LighCycler 实时荧光定量 RT-PCR仪 器(Roche)，电泳仪(Biometra)等。 试剂：BstDNA 聚合酶、MgSO4、10×Buffer、 MgCl2、dNTP、Taq 酶、SYBER Green I 等。 2.3. HBoV 病毒DNA提取和 HBoV 病毒 实时荧光定量 PCR检测 用核酸提取试剂盒提取DNA[7]。再通过以下程序 进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增，Pre-Incubation：95℃ (5 min)，1个循环；Amplification：95℃(10 s)，55℃ (15 s)，72℃(10 s)，40 个循环；Melting Curve：95℃ (1 min)，65℃(10 s)，1个循环；Coo ling：40℃(10 s), 1 个循环。 正向引物：5’-GGCTCCTGCTCTAGGAAATAAA GAG-3’ 反向引物：5’-CCTGCTGTTAGGTCGTTGTTGTA T GT-3’ 2.4. LAMP 引物的设计 通过在线的LAMP引物设计软件 Primer Explorer V4 设计 2对引物，包括 1对外引物(F3 和B3)、1对 内引物(FIP 和BIP)，其中要注意 FIC 和BIC 的5’端ΔG 的绝对值要>4，其它的3’端ΔG值 > 4；引物在设计 时使其 GC 含量介于40%~65%之间，但是当引物的 GC 含量介于 50%~60%时，引物的质量相对较好；F2 区段的 5’端到 B2 区段的 5’端(LAMP 反应扩增的区域) 之间的距离建议是 120~180 bp；F3区段的 3’端到 F2 区段的 5’端之间的距离是 0~20 bp。同理 B2 和B3 之 间的距离是 0~20 bp。F2 区段的5’端到 F1 区段的 5’ 端之间的距离是40~60 bp[8]。 外引物： F3 5’-ATCAGCCACCTATCGTCT-3’ B3 5’-CAATGCGAGTAGAGTGCC-3’ 内引物： FIP 5’-ATTGTCTTTTTTCCCCGATGTACTCCAC TGCTTCGAAGACCTC-3’ BIP 5’-TCCATACACTGTATTCAGTCAACACAG TAGAACCCACACCACC-3’ 2.5. LAMP 检测方法的建立 LAMP 的反应体系中包括：内引物、外引物、Bst 聚合酶、Thermopol Buffer、MgSO4、dNTPs、DEPC 水、模板、MLV 酶。其中要对内外引物浓度的比值、 MgSO4浓度、dNTPs 浓度、Thermopol Buffer浓度和 反应时间以及反应温度对 LAMP 反应的影响进行优 化试验，获得最好的反应条件，从而建立 HBoV 的 LAMP 检测体系。 2.6. LAMP 扩增产物的电泳检测和染料检测 取6 μL LAMP 扩增产物，于2%琼脂糖凝胶上进 行电泳检测。扩增反应结束后，加入0.1 μL的10,000 × SYBR Green I染料，观察 LAMP 反应是否发生颜色 变化。 Copyright © 2013 Hanspub 18  环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒 2.7. LAMP 检测HBoV 的灵敏度 选取一份通过实时荧光定量 PCR 检测出来的阳 性样本，提取核酸后进行常规PCR，电泳检测后回收 目的条带。经浓度检测后进行10 倍递进稀释，得到 1.0 × 109~1.0 × 10−1 copies/μL的共 11个稀释度，并用 SYBR Green I 染料进行检测LAMP 扩增结果。 2.8. LAMP 的特异性检测 提取甲型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病 毒以及腺病毒的病毒核酸，按照所建立的HBoV 检测 方法进行特异性试验，以ddH2O作为阴性对照，待反 应结束后于各反应试管中加入0.1 μL SYBR Green I 观察颜色变化。 2.9. 博卡病毒临床样本的 LAMP 检测 从武汉市儿童医院选取 60份儿童咽试子，分批 次进行核酸提取，然后分别进行实时荧光定量PCR 和LAMP 检测。 3. 实验结果 3.1. LAMP 检测方法的建立 通过对内外引物浓度的比值、MgSO4浓度、dNTPs 浓度、Thermopol Buffer浓度和反应时间以及反应温 度对 LAMP 的影响，确定最佳反应体系为 25 μL：Bst 链置换聚合酶8 U(1 μL)、模板(2 μL)、DEPC 水(9.5 μL)、10 × ThermopoI(2.5 μL)、Mg SO4 10 mM(1.5 μL)、 dNTPs 1.5 mM(3.5 μL)、F3/B3(1 μL/1 μL)、FIP/BIP(1 μL/1 μL)、MLV酶 10 U(1 μL)。反应条件为：65℃ 1 h；80℃ 3 min[8-10]。 3.1.1. MgSO4浓度优化 图1表明，MgS O 4浓度在 8~12 mM范围时，LA MP 扩增效率无明显差异；4 mM 浓度无 LAMP 反应发生， 6 mM浓度时扩增效率较低。因此，最终确定MgSO4 的最佳浓度为10 mM。 3.1.2. dNTPs 浓度优化 图2表明，dNTPs 浓度在1.5~2.0 mM 时，LAMP 扩增效率无明显差异。当 dNTPs 浓度为0.5 mM 时， 无LAMP 扩增反应；dNTPs 浓度为 1.0 mM 时，浓度 过低，LAMP 反应微弱，而 dNTPs浓度为2.5 mM 时， 浓度过高会阻碍LAMP 扩增效率，最终选择 1.5 mM 作为本试验的最佳 dNTP反应浓度。 3.1.3. Bst DNA 链置换聚合酶浓度优化 图3表明，Bst DNA 链置换聚合酶浓度在 4~10 U 范围时，均有 LAMP 反应发生。而 4 U的酶浓度扩增 效率低，最终选择的最佳酶浓度为8 U。 M: DL2000 Marker；1. ddH2O; 2. 4 mM; 3. 6 mM; 4. 8 mM; 5. 10 mM; 6. 12 mM. Figure 1. The optimized results of MgSO4 concentration in LAMP reaction 图1. LAMP 反应 MgSO4浓度优化结果 M: DL2000 Marker; 1. ddH2O; 2. 0.5 mM; 3. 1 mM; 4. 1.5 mM; 5. 2 mM; 6. 2.5 mM Figure 2. The optimized results of dNTP concentration in LAMP reaction 图2. LAMP 反应 dNTPs 浓度优化结果 M: DL2000 Marker; 1. ddH2O; 2. 2 U; 3. 4 U; 4. 6 U; 5. 8 U; 6. 10 U Figure 3. The optimized results of Bst DNA polymerase concentration in LAMP reaction 图3. LAMP 反应 Bst DNA 链置换聚合酶浓度优化结果 Copyright © 2013 Hanspub 19  环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒 3.1.4. MLV酶浓度优化结果 图4表明，MLV酶浓度在 6~14 U范围时，均有 LAMP 反应发生。浓度为 4 U时没有 LAMP 反应发生。 最终确定MLV 酶的最佳浓度为 10 U。 3.1.5. 反应温度优化结果 反应温度在 60℃~66℃范围内时，均有 LAMP反 应发生。当温度在 65℃时条带最亮，因此，最终确定 最佳反应温度为65℃(图5)。 1. 14 U; 2. 12 U; 3. 10 U; 4. 8 U; 5. 6 U; 6. 4 U; 7.negative control; M. marker Figure 4. The optimized results of MLV enzyme concentration in LAMP reaction 图4. LAMP 反应 MLV 酶浓度优化结果 1. 60℃; 2. 61℃; 3. 62℃; 4. 63℃; 5. 64℃; 6. 65℃; 7. 66℃; 8. negative control; M. marker Figure 5. The optimized results of reaction temperature in LAMP reaction 图5. LAMP 反应温度优化结果 3.1.6. 反应时间优化结果 当反应时间在 45 min~120 min 范围内，均有 LAMP 反应发生，时间在 45 min时条带较暗，而在 60~120 min 时间范围时条带亮度较亮且无明显区别。 因此最终确定LAMP 最佳反应时间为 60 min(图6)。 3.2. LAMP 扩增产物的电泳检测和染料检测 LAMP 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，阳性管 有特异性的梯状条带，阴性对照则无条带出现(图7)。 加入 SYBR Green I后，阳性的样本肉眼观察为黄绿 色，阴性则观察不到颜色或者为淡橙色(图8)。 1. 45 min; 2. 60 min; 3. 75 min; 4. 90 min; 5. 105 min; 6. 120 min; 7. negative control; M. marker Figure 6. The optimized results of reaction time in LAMP reaction 图6. LAMP 反应时间优化结果 1. negative control; 2-7. HBoV positive sample; M. marker Figure 7. Analysis of LAMP reaction production using agarose gel electrophoresis 图7. LAMP 反应产物的琼脂糖凝胶分析 1. negative control; 2-7. HBoV positive sample; M. marker Figure 8. The results of LAMP amplification (SYBR Green 1 staining) 图8. LAMP 扩增结果(SYBR Green 1 染色) Copyright © 2013 Hanspub 20  环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒 3.3. LAMP 反应的灵敏性检测 目的条带回收后的产物浓度进行10 倍递进稀释 得到 1.0 × 109~1.0 × 10−1 copies/μL共11 个稀释度， LAMP 扩增后用SYBR Green I 进行检测，当模板浓度 在1.0 × 109~1.0 × 100 copies/μL之间显绿色，当模板 含量在 1.0 × 10−1 copies/μL时显淡橙色，阴性对照也 是如此(图9)。表明所建立的LAMP 检测方法有很高 的检测灵敏性，检测最低可达到 1拷贝数。而实时荧 光定量 PCR 检测方法最低检测浓度为 100 copies/μL， 由此可见LAMP 检测方法相对于实时荧光定量 PCR， 不仅反应时间更快，而且对模板检测也更加灵敏。 3.4. LAMP 反应的特异性检测 用所建立的方法对 FluA、PIV、RSV 和AdV 检 测结果均为阴性(图10)。表明所建立的 LAMP方法具 有良好的特异性。 3.5. 实时荧光定量 PCR 和LAMP 检测临床样本 对2012 年5~7 月间武汉市儿童医院检测儿童的 60 份咽试子样本，同时用实时荧光定量 PCR 和LAMP 方法进行检测，都检测出 8份HBoV 阳性样本，二种 检测方法的检测结果一致。 4. 讨论 自1985 年发明聚合酶链式反应方法[11]已经广泛 应用于生物学检测，由高温变性、低温退火以及延伸 等几个步骤，使目的 DNA 迅速扩增。直到 2000 年， 日本科学家 Notmoi 等[4]发明了环介导等温扩增方法 (LAMP)，在Bst 链式聚合酶的作用下快速完成对靶序 列的信号放大。该反应中对引物的设计具有特异性， 因此检测方法的特异较高，整个检测过程在65℃等温 条件下只需 1 h 就可完成。 对LAMP 扩增产物进行检测时，反应体系中会出 现肉眼可视的扩增反应副产物即白色焦磷酸镁沉淀， 但由于对Mg2+和引物浓度进行了优化，实验并没有大 量的白色沉淀。只有在体系中加入 SYBR Green I 染料 再观察 LAMP 扩增产物，结果就较为明显了。 在对临床儿童咽试子检测，同时用了实时荧光定 量PCR和LAMP检测方法，比较发现，两种检测方 法的检出率相同。但进行灵敏度检测时，发现 LAMP 1. 1.0 × 109 copies/Μl; 2. 1.0 × 108 copies/μL; 3. 1.0 × 107 copies/μL; 4. 1.0 × 106 copies/μL; 5. 1.0 × 105 copies/μL; 6. 1.0 × 104 copies/μL; 7. 1.0 × 103 copies/μL; 8. 1.0 × 102 copies/μL; 9. 1.0 × 101 copies/μL; 10. 1.0 × 100 copies/μL; 11. 1.0 × 10−1 copies/μL; 12. negative control Figure 9. The sensitivity of LAMP reaction (SYBR Green 1 staining) 图9. LAMP 反应的灵敏性检测 1. HBoV; 2. ddH2O; 3. FluA; 4. PIV; 5. RSV; 6. AdV Figure 10. The specificity of LAMP reaction(SYBR Green 1 staining) 图10. LAMP 反应的特异性检测 检测方法要比 PCR 检测方法灵敏度高很多[12]。使用 LAMP 方法检测病毒核酸有很好的便捷性、特异性以 及灵敏度。基于操作性、检测时间和对设备要求等方 面，LAMP 检测方法都优于 PCR 检测方法，更适合在 基层医疗检测中推广。 5. 致谢 感谢国家科技重大专项“湖北及周边省传染病病 原谱流行规律研究”(2009ZX10004207; 2012ZX10004 207)的支持。 参考文献 (References) [1] T. Allander, M. T. Tammi, M. Eriksson, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(36): 12891-12896. [2] X. Ma, R. Endo, N. Ishiguro, et al. Detection of human boca- virus in Japanese children with lower respiratory tract infections. Journal of Clinical Microbiology, 2006, 44(3): 1132-1134. [3] J. Lindner, S. Modrow. Human bocavirus—A novel parvovirus to infect human. Intervirology, 2008, 51(2): 116-122. [4] T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. 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