 Botanical Research 植物学研究, 2013, 2, 109-112 http://dx.doi.org/10.12677/br.2013.24019 Published Online September 2013 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) Study on Pollen Viability and Stigma Receptivity of Pinellia ternata Xuesi Jia 1, Xue Wang2, Yuqing W ang1 1Shanxi Agricultural University, Jinzhong 2Yangquan Jinfeng planting Co. Ltd., Yangquan Email: glsyjxs@163.com Received: Jun. 24th, 2013; revised: Jul. 8th, 2013; accepted: Jul. 20th, 2013 Copyright © 2013 Xuesi Jia et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: This paper studied on the pollen viability and stigma receptivity of Pinellia ternate for the first time, as to provide a scientific basis for sexual reproduction and breeding of new varieties. In the three de- termination methods of P. ternata pollen activity, the staining effect of TTC was not ideal. The staining effect of MTT was best, which was beneficial to identify pollen viability, because it made pollen come out three kinds of color reaction of purple, faint red and colorless. Its dyeing rate was 86.59%. The staining effect of methylene blue was bette r, but the dyeing rate was highe r th an MT T, which was 89.62%. The opening time of P. ternata’s female flower was slightly earlier than male flower in a day. There were 48 - 72 h to make an appointment between pollen and stigma receptivity. Pollen scattering was concentrated on the third and fourth days of flower opening. During this period of time, the number of pollen was larger and the pollen ac- tivity was kept between 85.15% - 94.11%. The stigma receptivity was high during the former day, the very day and the second day of bloo ming. Artificially control pollination cou ld improve the seeds setting percent- age and seed number of P. ternata. Keywords: Pinellia ternata; Pollen Viability; Stigma Receptivity 半夏花粉活性和柱头可授性测定研究 贾学思 1，王 雪2，王玉庆 1 1山西农业大学，晋中 2阳泉市锦丰种植有限公司，阳泉 Email: glsyjxs@163.com 收稿日期：2013年6月24日；修回日期：2013年7月8日；录用日期：2013年7月20 日 摘 要：本文首次对半夏的花粉活性和柱头可授性进行了研究，以期为半夏的有性繁殖和育种研究提 供科学依据。在 3种测定半夏花粉活力的方法中，TTC 染色法的染色效果不理想；MTT 染色法最优， 使花粉出现紫色、淡红色、无色三种颜色反应，利于观察，其染色率为 86.59%；次甲基蓝染色法的染 色效果次之，但染色率略高于 TTC 染色法，为 89.62%；半夏雌花在一天中的开放时间略早于雄花， 其花粉活力与柱头可授性相遇时间为 48~72 h；散粉集中于开花第 3、4天，此时花粉数较多，花粉活 力维持在 85.15%~94.11%；而于开花前一天、开花当天和开花第 2天的柱头活性较强；人工控制授粉 可提高半夏的结实率和种子数量。 关键词：半夏；花粉活性；柱头可授性 Copyright © 2013 Hanspub 109  半夏花粉活性和柱头可授性测定研究 Copyright © 2013 Hanspub 110 1. 引言 半夏(Pinellia ternata)为天南星科半夏属多年生 草本植物，以块茎入药，为大宗常用紧销中药材，人 工栽培历史较短。半夏在野生状态和栽培生产上，无 性繁殖的数量远比有性繁殖多，多代无性繁殖造成半 夏品种退化，病虫害严重，产量和品质明显降低，使 种半夏的经济效益降低，使半夏栽培的推广受限。而 半夏种子繁殖具有简便、经济、繁殖系数大的特点， 其种源较大，利于发展生产。随着国家大力推进中药 现代化，对中药材生产实施 GAP 管理，优良品种的 选育应该作为一个首要课题来研究[1]。目前，尚无对 半夏花粉活性和柱头可授性研究的报道，通过对半夏 花粉活性和柱头可授性的研究，为半夏的有性繁殖研 究奠定基础。在植物有性繁殖过程中，雄蕊与雌蕊之 间的传粉是基础，传粉过程始于花药开裂和成熟花粉 的散出，携带着雄配子体或其前体的花粉粒被暴露在 干燥条件下，必须在具有活力时到达适宜的接受柱 头，才能完成授粉[2]。花粉是种子植物的雄配子体， 在有性繁殖中发挥着重要作用[3]。因此，花粉活性与 柱头可授性是人工辅助授粉成败的关键因素。近几 年，花粉生活力与寿命及柱头的可授性研究已经引起 不少学者的重视，并开展了大量的工作[4,5]。通过对半 夏不同开花天数的花粉活力、柱头可授性的测定研 究，确定采集花粉和授粉的最佳时期，以期为半夏的 人工授粉、有性繁殖及育种研究提供理论依据。 2. 材料与方法 2.1. 材料采集与处理 材料取自山西农业大学药用植物种植园的半夏。 试验时间为 2009 年6月中旬(半夏盛花期)，采集开花 第1天、第 2天、第3天、第 4天、第 5天、第6天 的花各 5朵，收集各不同开花天数的花粉，立即通过 TTC(氯化三苯基四氮唑)、MTT(四甲基偶氮唑蓝)、亚 甲基蓝分别染色、制片，在 Olympus 光学显微镜下观 察、计数、照相。每种染色方法均观察 3个制片，每 个制片取 5个视野，计数染色和未染色的花粉粒数， 统计花粉染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。 有活力花粉的比例 = 染色花粉数/观察花粉总数 × 100%。 2.2. 试验方法 2.2.1. 花粉活力的测定 TTC 染色法：将花粉粒置于载玻片上，用浓度 0.5%TTC染液进行染色，在 35℃的温箱中放置 15~30 min 后，置光学显微镜下观察。被染成红色(活力较强) 和淡红色(活力较弱)的为有活力花粉，无色的则为无 活力花粉。 亚甲基蓝染色法：将花粉放在载玻片上，加 l滴 0.1%亚甲基蓝溶液，用镊子搅拌均匀，然后盖片、镜 下观察。凡被染成蓝色的花粉表示有生活力，没有着 色或着色过浅者为丧失生活力的花粉。 MTT 染色法：称取 0.1 g MTT，溶解于 5 ml配制 好的 50 g/L蔗糖溶液中，摇匀置于冰箱中避光保存。 取少量花粉置于载玻片上，加1~2 滴MTT溶液，盖 上盖玻片；将制片在室温条件下放置 10 min，然后在 光学显微镜下观察。凡被染成紫色的花粉，其生活力 较强。淡红色次之，无色者为不具生活力的花粉或不 育花粉。 2.2.2. 柱头可授性的测定 开花前去雄处理。分别采集开花前一天、开花当 天、开花第2 d、开花第 3 d、开花第 4 d、开花第 5 d 各10 朵花，将不同发育时期的新鲜柱头完全浸泡在 上述配制好的 MTT 溶液中，在解剖镜下观察并计数， 柱头周围染成紫红色，表明该柱头有活性；若无色或 染色太浅者无活性。 3. 结果与分析 3.1. 花粉活力及数量测定结果 3.1.1. TTC染色法测定结果 光学显微镜下，所观察的视野内花粉粒均为淡红 色，染色不明显(见图1(a))，与对照蒸馏水处理的花 粉差别甚微(见图 1 CK)，不能有效地观测花粉活性的 有无。因此，该方法不适合检测半夏的花粉活力。 3.1.2. 次甲基蓝和 MTT 染色法测定结果 通过显微观测，发现半夏花粉粒呈浅橙黄色，圆 球形，饱满。次甲基蓝染色法测得平均花粉活力为 89.62%，略高于 MTT 染色法测得的结果：86.59%。 这是由于次甲基蓝亦能使衰老和死亡的花粉着色，使  半夏花粉活性和柱头可授性测定研究 (a) (b) (c) CK (a)：TTC 染色，(b)：次甲基蓝染色，(c)：MTT 染色，CK：蒸馏水处理 Figure 1. P. ternata pollen of different staining methods 图1. 不同方法染色的花粉粒 得花粉活力的测定值偏高[6]。MTT染色法能将花粉染 成紫色、浅红色和无色，染色效果较理想(见图 1)。 3.1.3. 不同开花天数对花粉活力和花粉数量的影响 开花第 1天，半夏一般不散粉；开花第 2天进入 散粉初期，花粉活力最高，为 97 .68% ，但花粉数量很 少，在显微镜下，每个视野的平均花粉粒数仅 21 粒； 随着散粉的进行，花粉数量明显增加，但花粉活力逐 渐减弱(图2)；开花第 3、4天，散粉进入盛期，花粉 数量达到最大，每个视野的平均花粉粒数达 137 粒， 花粉活力维持在 85.15%~94.11%，此期适宜进行花粉 的采集。开花第 5、6天，花粉主要粘附在佛焰苞上， 花粉活力降低到 53.80%以下，且花粉数量明显减少， 散粉结束(表1)。 3.2. 柱头可授性测定结果 将开花不同天数的花朵柱头浸入 MTT染色液中， 十分钟后，结果发现，开花前一天、开花当天和开花 第2天的柱头均被染成紫红色，柱头活性 100%，柱 头活性强；而开花第 3天的柱头活性虽然为 100%， 但染色较浅，说明柱头活性已降低；开花第 4天和第 5天的大部分柱头经染色后，大部分柱头为无色，柱 头活性平均仅 9.21%(表2)，即一个雌花序中，有活性 柱头仅 1~5 个。 4. 结论与讨论 Figure 2. Pollen number and activity in different days of blooming 图2. 不同开花天数的花粉活力和花粉数量 多，如 I2-KI 染色法、醋酸洋红染色法和荧光素二醋 酸酯染色法[7]等，是否有更适合测定半夏花粉活力的 方法，还有待于进一步研究。 在半夏的生殖生长过程中，雌花在一天中的开放 时间略早于雄花，何亚平[8]等人认为雌花先熟是一种 保证异花授粉和促进基因交流的对策，具有进化意 义。半夏于开花第 2~3 天开始散粉，第4天进入散粉 盛期后，大约持续 25 h；而柱头于散粉前期已具有活 性，开花后柱头活性可持续约 48 h，说明半夏雌花与 雄花花期相遇，相遇时间为 48~72 h，在时间与空间 上完成授粉的可能性是相当大的。但半夏的有性结实 率较低，种子数量较少。王祖秀[9]等人对半夏雄配子 败育的原因进行了报道。其结果显示：半夏的减数分 裂异常，减数分裂的各时期都存在遗传物质不均衡分 离的异常结构，染色体结构变异是半夏雄配子败育的 主要原因；成熟花粉粒中可育花粉不足 1%，三核期 是其雄配子败育的时期。对于是否存在其它原因使得 半夏的有性结实率降低，以及半夏的花粉萌发率、花 粉管的生长状况还有待于进一步研究。 在本试验采用的 3种测定花粉活力的方法中， MTT 染色法最优，次甲基蓝染色法次之，TTC 染色 法不适宜测定半夏的花粉活力。TTC 染色效果不明显 的原因可能是半夏花粉粒的结构特殊或是试验条件 不够适合，需进一步研究。而测定花粉活力的方法很 花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育 的能力，在常规育种中，尤其是在杂交育种工作中， Copyright © 2013 Hanspub 111  半夏花粉活性和柱头可授性测定研究 Table 1. Pollen number and activity in different days of blooming 表1. 不同开花天数的花粉数量与花粉活力 开花天数(d) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 每视野花粉数量(粒) 0 21 97 137 86 30 次甲基蓝花粉活力(%) 0 98.22 95.46 88.32 56.97 43.63 MTT 花粉活力(%) 0 97.14 92.75 82.03 50.63 37.96 平均花粉活力(%) 0 97.68 94.11 85.18 53.80 40.79 Table 2. Stigma activity in different days of blooming 表2. 不同开花天数的柱头活性 开花天数(d) 前1天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 柱头活性(%) 100 100 100 100 15.63 2.78 常进行人工辅助授粉或杂交授粉，研究花粉的生活力 和育性是必不可少的基础性工作[10]。柱头可授期是花 朵成熟过程中的一个重要时期，它能在很大程度上 影响自花传粉率、开花不同阶段的传粉成功率、雄 性和雌性功能之间的相互干扰等[11]。花粉具有活 力、同时柱头具有可授性是完成受精的必要条件。 半夏于开花第 2~3天，花粉数量多，花粉活力较强， 维持在 90%以上，适宜于采集花粉；而雌蕊柱头于开 花前一天、开花第 1天和第 2天可授性较高，适宜进 行授粉工作。通过人工控制授粉，可提高半夏的结实 率和种子数量。 参考文献 (References) [1] 蔺海明, 主编. 中药材生产质量管理规范教程[M]. 中国农业 出版社, 2008: 94-95. [2] 红雨, 刘强, 韩岚. 芍药花粉活力和柱头可授性的研究[J]. 广西植物, 2003, 23(1): 90-92. [3] 牛东玲, 宋玉霞, 郭生虎等. 肉苁蓉花粉生活力测定研究[J]. 中草药, 2004, 35(6): 679-682. [4] 刘林德, 张萍, 张丽等. 锦带花花粉活力、柱头可授性及传粉 者的观察[J]. 西北植物学报, 2004, 24(8): 1431-1434. [5] W. G. Yi, S. E. Law, D. McCoy, et al. 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