 World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2013, 3, 38-43 http://dx.doi.org/10.12677/wjcr.2013.34007 Published Online October 2013 (http://www.hanspub.org/journal/wjcr.html) The Effects of RNA Interference Targeting ID-1 on the Growth of Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Nude Mice Chunkang Su1, Fuli Su1, Hongyu Zheng1, Ji andan Zhang1, Enjie Hu1, Jiajian Ye2, Quanming Wu3 1Yongding Hospital in Fujian, Longyan 2Fujian Geriatric Hospital, Fuzhou 3Fujian Center for Clinical Laboratory, Fuzhou Email: suchunkang@126.com Received: Sep. 10th, 2013; revised: Sep. 20th, 2013; accepted: Oct. 9th, 2013 Copyright © 2013 Chunkang Su et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits un- restricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Objective: To investigate the inhibition effects of RNA interference targeting ID-1(si-RNA-ID-1) on the growth of Hepatocellular Carcinoma(HCC) in nude mice and the potential mechanism of ID-1 in the development of HCC. Methods: HCC xenografts were developed by injecting HepG2 cells into BALB/C-nu nude mice. The tumor- bearing mice were randomly divided into 3 groups, including blank control group, control-siRNA group and siRNA-ID- 1 group. Each group was treated by isovolumetric normal saline, control-siRNA or siRNA-ID-1 on day 1, 4, 7, 10 and 13, respectively. The growth curves of HCC xenografts were made by the tumor sizes, which were measured per week. The nude mice were executed on day 28. The tumor tissue was prepared for the HE staining. Results: The tumor sizes in siRNA-ID-1 group were significantly smaller than that in control groups (P < 0.05). The apoptotic cells observed in siRNA-ID-1 group were increased in HE slides. Conclusions: The growth of HCC xenografts could be inhibited by si-RNA-ID-1 injection. Both proliferation inhibition and apoptosis induction play important roles in this progress. The results implied that ID-1 might be a potential target for the therapeutic strategy of HCC. Keywords: RNA Interference; ID-1; Hepatocellular Carcinoma; Transfection; Inhibition Tumor SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 苏春康 1，苏富丽 1，郑洪裕 1，张建丹 1，胡恩杰 1，叶加建 2，吴泉明 3 1福建省永定县医院，龙岩 2福建省老年医院，福州 3福建省临床检验中心，福州 Email: suchunkang@126.com 收稿日期：2013 年9月10 日；修回日期：2013 年9月20 日；录用日期：2013 年10 月9日 摘 要：目的：观察以 RNA 干扰技术沉默 ID-1表达对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用，探 讨抑制 ID-1 表达对肝癌可能存在的抑癌作用。方法：向BALB/C-nu 系雄性裸鼠皮下注射HepG2细胞建立裸鼠 荷瘤模型，成瘤后随机将裸鼠分为空白组、转染对照组和 siRNA-ID-1 处理组，在第 1、4、7、10 和13 d分别 注射等量的生理盐水、control-siRNA 和甲基化的siRNA-ID -1。每周测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。于第 28 d处死裸鼠，取肿瘤组织行常规 HE染色。结果：siRNA-ID-1 处理组裸鼠肿瘤体积较空白组和转染对照组的体 积小(P < 0.05)；转染后癌细胞凋亡增多，空白组及转染对照组瘤细胞排列密集，细胞界限不清，生长活跃，核 大深染，有较多核分裂象。结论：以siRNA 技术沉默肝癌移植瘤组织中的 ID-1表达可抑制肿瘤的生长，ID-1 具有促肿瘤生长作用。 Copyright © 2013 Hanspub 38  SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 Copyright © 2013 Hanspub 39 关键词：siRNA；ID-1；肝癌细胞；转染；肿瘤抑制 1. 引言 肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是我国最常 见的恶性肿瘤之一，预后差，寻找有效的生物学指标 对肝癌的早期诊断及防治有重要的意义。而近期研究 发现 DNA 结合/分化抑制蛋白-1(inhibitor of differen- tiation/DNA binding-1，ID-1)在肝癌组织中存在过度表 达[1]，其在促进肝癌发生发展的过程中发挥了广泛的 生物学作用。目前尚缺乏利用 RNA 干扰技术沉默 ID-1 表达对人肝癌细胞的抑制作用的研究，所以本文力求 通过观察甲基化的 siRNA-ID-1 对肝癌细胞系 HepG2 细胞裸鼠皮下移植瘤增殖的影响并检测相关增殖、凋 亡基因和蛋白的表达，综合分析 ID-1 在HCC 中的作 用机制，进一步明确 ID-1基因在促进 HCC 发生发展 过程中的可能途径，为寻找从mRNA 水平作用ID-1 靶点，进而减缓 HCC 生长，以及降低其恶性生物学 行为提供参考。 2. 材料与方法 2.1. 材料 人肝癌细胞株HepG2细胞(上海科学院细胞中 心)；清洁级 BALB/C-nu 系裸鼠，雄性，5周龄，14~18 克(上海肿瘤动物研究中心，于福建医科大学实验动物 中心 SPF级饲养合格证书号：SYXK(闽)2008-0001)。 2.2. 主要试剂 RPMI 1640培养基/FBS/胰酶(Hyclone Co., USA)； 青霉素和链霉素(碧云天生物技术研究所，中国)； DMSO (Sigma Co., USA)；siRNA-ID -1/试剂 control- siRNA(NContro1, 05815)(广州锐博生物公司)；无 RNAase 的ddH2O(Gibco Co., USA)。 2.3. 分组 随机将裸鼠分为三组，每组 5只，即空白对照组； 转染对照组；siRNA-ID-1 处理组。 2.4. 方法 2.4.1. HepG2细胞培养 人肝癌细胞株HepG2细胞复苏后，常规培养于含 10%FBS、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基，37˚C、5%CO2浓度下，于恒湿培 养箱中培养。 2.4.2. 细胞传代 待细胞生长至约 80%融合后传代，吸去旧培养 液，PBS 洗涤 2遍；每一培养瓶中加入 0.25%胰蛋白 酶-EDTA1mL，室温消化2~5 分钟；倒置显微镜下观 察，当细胞回缩，细胞间隙增大时，加入含10%FBS 的RPMI1640 培养基(按每 1 mL胰酶加入3 mL培养 基比例)终止消化；收集细胞悬液于离心管中，离心 1000 rpm，5 min，弃上清，再向管中加入含 10%FBS 的RPMI1640 培养液使细胞重新悬浮，并吹散成单个 细胞悬液，以105/mL 的细胞密度接种于新培养瓶中。 常规 1~2 天换液一次，3~4天传代一次。 2.4.3. 裸鼠肝癌模型的建立 取处于对数生长期的 HepG2细胞，用含10%FBS 的RPMI1640 培养液将其轻轻吹打成均匀的细胞悬 液，并将 HepG2细胞浓度调至 5 × 106/mL。安尔碘局 部消毒裸鼠皮肤，于裸鼠右侧腋窝处皮下注射 HepG2 细胞悬液0.2 mL。接种约5天，裸鼠接种部位出现 3 mm~4 mm 的白色硬结，成瘤率为 100%。 2.4.4. siRNA-ID-1瘤内给药 试剂配制：取20 nmol的siRNA-ID-1 及control- siRNA 冻干粉离心集中至 Ep 管底，将其溶解于 500 µL 的Rnase-free 水，制成终浓度为 40 µM的贮存液，−20 ℃条件下保存。瘤内给药：空白对照组，瘤内注射 100 µL 的生理盐水；转染对照组，瘤内注射 100 µL control- siRNA，给药量为 4 nmol；siRNA-ID-1 处理组，瘤内 注射 100 µL的siRNA-ID-1试剂，给药量为 4 nmol。 以给药第一天算起，第1天，第4天，第7天，第 10 天，第 13 天如此按以上给药方案重复 5次给药。 2.5. 疗效观察 观察动物的一般生长状况，如精神状况、活动状 况、饮食状况等，同时测量裸鼠体重、皮下肿瘤体积 和重量。每周用游标卡尺测量肿瘤最长径及最短径， 体积按如下公式计算：肿瘤体积(mm3) = 1/2 × A ×  SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 B2(A、B分别为肿瘤的最大径和最小径)。制作肿瘤体 积生长曲线，观察不同时间 siRNA-ID-1 对肿瘤生长 的影响，抑瘤率(Inhibitory，IR)按如下公式计算：肿 瘤体积抑制率(IR) = (1 − Vt/Vt’) × 100%。，Vt和Vt’ 分别代表同一观察时间点 siRNA-ID-1 处理组和空白 对照组裸鼠皮下肿瘤的平均体积。取转染 siRNA-ID-1 后对裸鼠抑瘤率最大的周龄，采用颈椎脱臼法处死裸 鼠，分离肿瘤，浸入生理盐水漂洗后，快速切除肿瘤， 检查肿瘤外观、坏死部位，取部分放入液氮瓶中保存， 供RT-PCR及免疫组化检测，另一部分以10%的中性 甲醛固定肝癌组织，24 hrs 后作常规病理检查。 2.6. 统计学处理 采用 SPSS(11.5) (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)分析。计数资料均以均数±标准差(x ¯ ± s)表示， 方差齐性资料各组间采用单因素方差分析(analysis of variance, One-Way ANOVA)，以 α = 0.05 为检验标准， P < 0.05有统计学意义。 3. 结果 3.1. 裸鼠肝癌模型的建立 于裸鼠右腋皮下注射人肝癌细胞 HepG2后约 3 天，可在皮下触到直径约 3 mm~4 mm肿瘤结节，致 瘤成功率 100%，成瘤后观察移植瘤生长情 况， 测量 荷瘤裸鼠的体重及皮下移植瘤的体积和重量。治疗前 后，各组裸鼠存活良好，无一例出现死亡。见图 1。 3.2. 裸鼠的一般状况 荷瘤裸鼠行动活跃，饮食饮水正常，随着种植侧 瘤结节逐渐长大，裸鼠皮下脂肪慢慢消耗，并出现精 神不振，饮食饮水较前明显减少，行动稍迟缓；而 siRNA-ID-1处理裸鼠后，种植侧瘤结节较对照组相 比，生长速度缓慢，荷瘤裸鼠饮食饮水稍减少，行动 活跃如初。 3.3. 荷瘤裸鼠的体重变化 分别于第0，1，2，3，4 w 末，称量并记录荷瘤 裸鼠的体重变化。结果显示，从siRNA-ID-1 处理第 2 周起，处理组荷瘤裸鼠体重增长速度减缓，与对照组 相比肿瘤体重差别有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。 3.4. 裸鼠皮下移植瘤的体积 选择治疗前(即0 w)与治疗结束后的第1，2，3， 4 w末，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，测量肿瘤体积， 计算肿瘤体积抑制率。剥离皮肤与肿瘤组织，称重， 比较各组肿瘤质量。结果显示，空白对照组及转染对 照组皮下肿瘤体积逐渐增大，siRNA-ID-1 处理组皮下 肿瘤体积增长速度明显减缓，从处理 2周起，与对照 组相比肿瘤体积差别有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。 3.5. 裸鼠皮下肿瘤体积抑制率 见表 3。 3.6. 皮下移植瘤的重量 见表 4。 Figure 1. Subcut aneous carcinoma model 图1. 裸鼠皮下肝癌模型的建立 Table 1. siRNA-ID-1 treated mice in each group of weight (x ¯ ± s, n = 5, g) 表1. siRNA-ID-1处理后各组裸鼠的体重(x ¯ ± s, n = 5, g) 组别 0 w 1 w 2 w 3 w 4 w 空白对照组 19.01 ± 2.80 22.46 ± 2.85 22.97 ± 2.31 25.76 ± 3.56 27.64 ± 2.87 转染对照组 18.96 ± 2.69 21.57 ± 3.55 22.78 ± 2.86 24.91 ± 3.08 26.24 ± 0.80 siRNA-ID-1处理组 19.13 ± 3.06 21.75 ± 3.88 21.94 ± 2.61* 22.24 ± 3.15* 23.46 ± 2.10* 注：siRNA-ID-1 处理前各组荷瘤裸鼠体重无统计学差异(P > 0.05)。空白对照组与转染对照组相比无统计学差异(P > 0.05)。 *与空白组相比有统计学差异(P < 0.05)。 Copyright © 2013 Hanspub 40  SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 Table 2. siRNA-ID-1 nude mice in each group after treatment of tumor volume change (x ¯ ± s, mm3) 表2. siRNA-ID-1处理后各组裸鼠皮下肿瘤的体积变化(x ¯ ± s, mm3) 组别 0 w 1 w 2 w 3 w 4 w 空白组 67.86 ± 19.52 125.81 ± 57.83 701.32 ± 72.15 1601.42 ± 146.08 2526.44 ± 168.91 转染对照组 72.35 ± 20.19 124.78 ± 61.37 698.64 ± 83.21 1598.75 ± 125.52 2591.39 ± 187.62 siRNA-ID-1 69.25 ± 24.38 116.93 ± 63.54 425.45 ± 74.67* 991.27 ± 113.85* 1576.19 ± 133.27* 注：siRNA-ID-1 处理前各组荷瘤裸鼠皮下肿瘤体积无统计学差异(P > 0.05)。空白对照组与转染对照组相比无统计学差异(P > 0.05)。治疗第2 w起，*与空白组 相比有统计学差异(P < 0.05)。 Table 3. siRNA-ID-1 nude mice after treatment changes in tumor volume inhibition rate (IR, %) 表3. siRNA-ID-1处理后裸鼠皮下肿瘤体积抑制率的变化(IR, %) IR(%) 分组 1 w 2 w 3 w 4 w siRNA-ID-1处理组 7.1 39.3 38.1 37.6 Table 4. siRNA-ID-1 in each group after subcutaneous tumor weight (x ¯ ± s, g) 表4. siRNA-ID-1处理后各组裸鼠皮下肿瘤的重量(x ¯ ± s, g) 组别 0 w 1 w 2 w 3 w 4 w 空白组 2.86 ± 0.52 3.91 ± 0.83 5.32 ± 0.15 7.47 ± 0.48 10.04 ± 0.91 转染对照组 2.55 ± 0.19 3.78 ± 0.37 4.94 ± 0.21 6.98 ± 0.52 9.91 ± 0.62 siRNA-ID-1处理组 2.65 ± 0.38 2.93 ± 0.54 3.45 ± 0.67* 4.97 ± 0.85* 6.68 ± 0.27* 注：siRNA-ID-1 处理前各组荷瘤裸鼠皮下肿瘤重量无统计学差异(P > 0.05)。空白对照组与转染对照组相比无统计学差异(P > 0.05)。治疗第2 w起，*与空白组 相比有统计学差异(P < 0.05)。 3.7. 皮下肿瘤组织HE 染色镜检 见图 2。空白对照及转染对照组见肿瘤细胞呈多 角形，聚集成团，核大深染，核分裂象较多。siRNA-ID- 1处理组见片状变性坏死，多数胞核完全溶解，细胞 结构消失，可见多量凋亡细胞，胞质浓缩，胞核深染 固缩，染色体成团块状。周围肿瘤细胞与对照组相比 残留较少，可见间质炎性反应增多、淋巴细胞浸润明 显。 4. 讨论 HCC 是在国内发病率高，预后差，寻找有效的生 物学指标对肝癌的早期诊断及防治有重要的意义。近 期DNA结合/分化抑制蛋白-1(inhibitor of differentia- tion/DNA binding-1, ID-1)在肝癌组织中存在过度表 达[1]的发现为促进肝癌的诊治水平提供了新的思路， 有研究认为，ID-1 过度表达可影响乙型肝炎相关肝细 胞癌的预后，可将其作为一项潜在的恶变风险评估手 段[2]及治疗靶点。 ID 蛋白属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH) 中的一类，具有ID-1、ID-2、ID-3 及ID-4共4个亚 型，这类蛋白能够抑制 bHLH 转录因子活性[3]，具备 广泛的生物学功能[4]，如抑制细胞分化、促进细胞增 殖，其中 ID-1 具有 ID类蛋白典型的特点和作用。目 前的多数研究认为，ID-1 是细胞周期调控和肿瘤血管 发生的关键分子，其通过加快细胞周期[5]、促进血管 生成[5-7]在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要角色。我 们先前的研究发现，ID-1在手术切除HCC 标本的癌 旁组织中(病理显示肝硬化组织共16 例)存在过度表 达，提示 ID-1 可能参与了肝癌发生的早期阶段，但其 在HCC发生早期所起的作用如何尚有待深入研究。 RNA 干扰技术是一种高效的基因沉默手段，外源 性小分子双链干扰 RNA 通过介导同源靶基因 mRNA 的特异性降解，导致转录后基因沉默(post-transcrip- tional gene silencing, PTGS)。小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是一种双链RNA 分子，通过 设计针对靶基因的特异 siRNA，可有效沉默目标基因， Copyright © 2013 Hanspub 41  SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 空白对照组 转染对照组 siRNA-ID-1处理组 Figure 2. Endoscopic tumor models in each group ( 100×) 图2. 各组肿瘤模型镜下表现(100×) 而正常基因不受影响。作为一种简便、特异而又高效 特异的抑制靶基因表达的新技术，RNA 干扰技术已被 广泛应用于基因功能、遗传规律、生长发育、信号转 导及抗肿瘤等多领域的研究[8]，其中在多种肿瘤治疗 研究中取得了明显的效果。 本实验成功构建了裸鼠皮下荷瘤肝癌模型，肿瘤 组织的 HE染色镜检也证实了这一点。荷瘤裸鼠随着 种植侧瘤结节逐渐长大，裸鼠皮下脂肪慢慢消耗，并 出现精神不振，饮食饮水较前明显减少，行动稍迟缓； siRNA-ID-1 处理裸鼠后，种植侧瘤结节较对照组相 比，生长速度缓慢，荷瘤裸鼠饮食饮水稍减少，行动 活跃如初；裸鼠体重增长速度减缓，与对照组相比肿 瘤体积小(P < 0.05)；肿瘤体积抑制率逐渐增大，肿瘤 组织的重量明显较空白组、转染对照组小(P < 0.05)。 处理组见片状变性坏死，多数胞核完全溶解，细胞结 构消失，可见多量凋亡细胞，胞质浓缩，胞核深染固 缩，染色体成团块状，周围肿瘤细胞与对照组相比残 留较少，可见间质炎性反应增多、淋巴细胞浸润明显。 以上现象说明，siRNA-ID-1 处理后能够明显抑制 肝癌细胞的生长，并在第 2周到达抑制高峰，由于 siRNA 瞬时转染作用，随着时间推移，RNAi 作用消 失，皮下肿瘤生长较前相比抑制作用并不明显，我们 认为，siRNA-ID-1处理前后 HCC 生长的差别与ID-1 的作用有关，ID-1 参与了肝癌细胞生长过程，发挥着 促癌作用。由于ID-1 在不同肿瘤细胞中的作用机制不 同，且前期针对食管鳞癌的研究显示，ID-1并非促进 食管鳞癌增殖的主要因素，那么，HCC 中ID-1的作 用究竟以促肿瘤细胞增殖为主还是抑制细胞凋亡为 主或是二者皆有作用需要进一步进行研究。 已明确 siRNA-ID-1可通过抑制细胞增殖水平发 挥抑制移植瘤生长的作用，其是否也参与了HepG2细 胞凋亡的诱导？Cheung 等[8]通过对鼻咽癌的研究发 现，ID-1 能够介导 Raf/MEK 信号途径，从而抑制细 胞凋亡。我们的结果显示，siRNA-ID-1 处理组组织切 片有明显的细胞凋亡的特征，提示抑制细胞凋亡亦是 ID-1 参与HCC癌变进展的机制之一。本研究结果支 持siRNA-ID-1诱导 HCC细胞凋亡的作用，其与抑制 细胞增殖共同参与了 siRNA-ID-1对裸鼠皮下移植瘤 的抑瘤效应。 ID-1 通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡等参与肿 瘤生长过程，在 HCC 发生发展过程中发挥多种潜在 的作用。我们认为，ID-1的过表达可作为 HCC预后 不良的参考指标，而利用siRNA-ID-1 沉默 ID-1 基因 的靶向治疗可能是一项有效的降低 HCC恶性生物学 行为的预防策略。 参考文献 (References) [1] 刘豫瑞, 方明霞, 曾达武. 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Cancer Letters, 2010, Copyright © 2013 Hanspub 42  SiRNA-ID-1 对人肝癌细胞 HepG2裸鼠皮下移植瘤生长的影响 298(2): 264-272. [7] M. K. Maw, J. Fujimoto and T. Tamaya. Expression of the in- hibitor of DNA-binding (ID)-1 protein as an angiogenic media- tor in tumour advancement of uterine cervical cancers. British Journal of Cancer, 2008, 99(10): 1557-1563. [8] R. Zhao, X. Q. Liu, X. P. Wu, Y. F. Liu, Z. Y. Zhang, G. Y. Yang, S. Guo, J. Niu, J. Y. Wang and K. S. Xu. Vascular endothelial growth factor (VEGF) enhances gastric carcinoma invasiveness via integrin alpha(v)beta6. Cancer Letters, 2010, 287(2): 150- 156. Copyright © 2013 Hanspub 43 |