 Material Sciences 材料科学, 2013, 3, 252-256 http://dx.doi.org/10.12677/ms.2013.36046 Published Online November 2013 (http://www.hanspub.org/journal/ms.html) The Cytocompatibility of Silk Fibroin/Poly(ε-caprolactone) Electrospun Fibers* Weichao Yang1, Zhenran Xia1,2, Caili Ma1, Xiufang Li1, Mingzhong Li1# 1School of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 2School of Mechanical Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu Email: #mzli@suda.edu.cn Received: Nov. 1st, 2013; revised: Nov. 14th, 2013; accepted: Nov. 19th, 2013 Copyright © 2013 Weichao Yang et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: In order to develop a new degradable biomaterial with both good biocompatibility and mechanical pro- perties, blended fibers composed of silk fibroin (SF) and poly(ε-caprolactone) (PCL) were fabricated by electrospining technique in this study. Confocal laser scanning microscope, scanning electron microscopy, cell adhesion rate and MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) assay were used to analyse the cytocompatibility of SF/PCL electrospun fibers, and to study the influence of the SF/PCL blend ratio on L-929 cell adhere and proliferate. The results showed that cells on the SF/PCL electrospun fibers surface can adhere and proliferate, and the cell number increased with the prolongation of the culturing time. The rate of cell adhesion and proliferation cultured on the SF/PCL electrospun fibers with the ratio of 70/30 and 50/50 was higher than other SF/PCL blend ratio electrospun fibers. Keywords: Electrospinning; Silk Fibroin; Poly(ε-caprolactone); Cytocompatibility 丝素/聚己内酯静电纺纤维的细胞相容性* 杨伟超 1，夏震然 1,2，麻彩丽 1，李秀芳 1，李明忠 1# 1苏州大学纺织与服装工程学院，苏州 2常熟理工学院机械工程学院，常熟 Email: #mzli@suda.edu.cn 收稿日期：2013 年11月1日；修回日期：2013年11 月14 日；录用日期：2013年11 月19 日 摘 要：用蚕丝丝素(SF)和聚己内酯(PCL)共混进行静电纺丝，可以制备一种新的既具有良好生物相容性又具有 良好力学性能的可降解性生物材料。用激光共聚焦显微镜、扫描电镜、细胞粘附率和四甲基偶氮唑盐比色法对 SF/PCL 共混纤维的细胞相容性进行检测和分析，研究了SF/PCL 共混比例对 L-929 细胞粘附和生长的影响。结 果表明，细胞在SF/PCL 静电纺丝网表面能够正常粘附和增殖且形态正常，随着培养时间的延长细胞数量逐渐 增多，当SF/PCL 共混比例为70/30 和50/50 时，细胞粘附率和增殖率明显高于其他比例的静电纺丝网。 关键词：静电纺丝；蚕丝丝素；聚己内酯；细胞相容性 1. 引言 蚕丝丝素（SF）是一种天然的蛋白质，无毒性， 具有良好的生物相容性和可控的生物降解性[1-3]。以丝 素为原料采用静电纺丝法制得的纤维有利于细胞的 粘附、分化和增殖，但其在力学性能方面往往存在韧 性不足、断裂伸长率较小的缺点。聚己内酯(PCL) 是 一种人工合成的高聚物，在体内可被降解，无毒副作 *感谢国家自然科学基金项目(批准号：31370968)，江苏省基础研究 计划(编号：BK20131177)和江苏省高校自然科学项目(批准号： 12KJA430003)的资助。 #通讯作者。 Open Access 252  丝素/聚己内酯静电纺纤维的细胞相容性 用，断裂伸长率较大，柔韧性较好，但其亲水性不足， 对细胞的亲和性有待提高[4,5]。为了研制既具备良好生 物相容性又具备良好力学性能的可降解纤维材料，用 于组织工程支架等生物医学领域，本文采用静电纺丝 法制备 SF/PCL 共混纤维，研究共混比例对细胞粘附 和增殖的影响。 2. 实验部分 2.1. 主要原料与试剂 家蚕生丝：购自浙江省；六氟异丙醇(HFIP)：购 于美国杜邦公司；聚己内酯(PCL)：购自上海 Sigma 公司；小鼠胚胎成纤维细胞(L-929)：由苏州大学医学 院提供；DMEM (Dulbeccu’s Modified Eagle Medium)、 硫酸链霉素(Streptomgein)、氨苄基青霉素(Ampicillin)、 CM-DiI 荧光蛋白、MTT 粉末：均购自上海西巴斯生 物技术有限公司。 2.2. 丝素蛋白固体的制备 将家蚕生丝于沸腾的 0.02 mol/L Na2CO3溶液中 煮30 min，然后用蒸馏水冲洗，重复 3次，脱去家蚕 生丝中的丝胶，在 60℃烘箱中干燥后得到丝素蛋白纤 维。将丝素蛋白纤维于65℃溶解于9.3 mol/L的LiBr 溶液中 1 h，然后透析3 d 得到丝素蛋白溶液。丝素蛋 白溶液经流延法成膜，室温干燥后得到丝素蛋白固 体。 2.3. SF/PCL共混纤维的制备 将丝素蛋白固体与 PCL 以不同SF/PCL 比例 (100/0、70/30、50/50 、30/70、0/100)于HFIP 溶液中 恒温(26℃)振荡水浴溶解 3天，制得浓度为 6%的 SF/PCL 纺丝液。将纺丝液填充到 注射 器中 ，在 浓度 为6%，电压为 12 kV，接收距离为10 cm，推注速度 为1.0 ml/h的条件下进行静电纺丝，得到不同比例的 SF/PCL 共混静电纺丝网。静电纺丝网用 80%乙醇处 理30 分钟，诱导 β-折叠构象转变，使其不溶于水。 静电纺丝网浸渍于去离子水中1 d 以除去其中的乙 醇。 2.4. SF/PCL共混纤维的细胞相容性 在37℃、5% CO2条件下，用 DMEM培养基(含 10%小牛血清，1%的双抗)培养小鼠胚胎成纤维细胞 (L-929)。静电纺丝网剪成24 孔板大小的圆片状，置 于24 孔细胞培养板中，浸泡在75%乙醇中灭菌 2小 时，再浸泡在三蒸水中 7天除去乙醇。静电纺丝网用 无菌 PBS洗涤 3次，并转移到 24 孔细胞培养板。细 胞接种到静电纺丝网之前，静电纺丝网 37℃条件下浸 在1 ml 的细胞培养基中过夜，提高细胞粘附能力。将 细胞浓度为 5 × 104 cell/ml的细胞接种于静电纺丝网 表面，待细胞贴壁后添加 1 ml 培养基继续培养。 细胞形态的观察：用活细胞示踪剂CM-DiI 标记 的L-929 细胞接种于静电纺丝网和空白细胞培养板， 在37℃、5% CO2条件下培养箱中孵化 4 h，待 细胞贴 壁后添加 1 ml培养基继续培养，激光共聚焦显微镜 (CLSM)下观察细胞的生长状态以及细胞与材料的结 合情况。4℃条件下用浓度为 2.5%的戊二醛将静电纺 丝网上的细胞固定，PBS 洗涤两遍。之后冷冻干燥机 干燥 36 h，得到干燥的样品，喷金后用日本 S-4800 扫描电子显微镜(SEM)观察细胞的生 长情况 。用细 胞 计数板测定悬浮的细胞数表征细胞粘附率。用四甲基 偶氮唑盐比色法（MTT）表征细胞的活性。用酶标仪 测定溶液的吸光度(OD)，选定波长为490 nm。用 SPSS16.0 软件进行统计学分析。P < 0.05为有显著性 差异。 3. 结果与讨论 3.1. 激光共聚焦显微镜 从图 1中可以看出，L-929 细胞在 SF/PCL 共混纤 维表面进行培养，第一天时，细胞均匀地分散在材料 表面，细胞形态多呈圆形；到第三天时，不同比例 SF/PCL 共混纤维上的细胞数量增多，细胞呈梭形。 培养至第五天及第七天时的激光共聚焦显微镜结果 (图片略)显示，材料上的细胞数量明显增多，远多于 第一天及第三天在材料上所看到的细胞数，且大部分 细胞都为梭形。其中 SF/PCL 比例为 70/30 和50/50 的 静电纺丝网表面的细胞增殖数量明显高于其他的静 电纺丝网。以上说明各种比例的SF/PCL 材料都能够 较好地支持L-929 细胞的生长和增殖，具有良好的细 胞相容性，且 SF/PCL 共混纤维与SF 纤维或 PCL 纤 维相比更有利于L-929 细胞的生长。随着培养天数的 延长，各比例的SF/PCL 静电纺丝网上的细胞数量逐 Open Access 253  丝素/聚己内酯静电纺纤维的细胞相容性 Open Access 254 Figure 1. The CLSM images of L-929 cells cultured on the SF/PCL electrospun fibers surface; (A) SF; (B) SF/PCL = 70/30; (C) SF/PCL = 50/50; (D) SF/PCL = 30/70; (E) PCL. 1—cell culture 1 d; 3—cell culture 3 d 图1. L-929 细胞在 SF/PCL 静电纺丝网表面培养的激光共聚焦显微镜图片；(A) SF；(B) SF/PCL = 70/30；(C) SF/PCL = 50/50；(D) SF/PCL = 30/70；(E) PCL.1—细胞培养 1 d；3—细胞培养 3 d 渐增多，其中 SF/PCL 比例为 70/30 和50/50的静电纺 丝网表面的细胞形态优于其他比例的材料，细胞增殖 速度也高于其他材料。研究表明，采用不同聚合物共 混的方法制备的支架材料，可以改善单纯使用一种材 料的适应性[6]。SF 和PCL混合纺出的静电纺丝网， 既具有亲水性质又具有疏水性质，满足了细胞粘附对 材料亲疏水性的要求，从而使得细胞能够更快的粘附 与增殖；且 SF/PCL 比例为70/30 和50/50 时，纺丝过 程中纤维平均直径较细，能够产生更多的纳米级纤 维，有效促进了细胞的粘附与增殖。 的形态和结构与天然细胞外基质有一定的相似性，为 细胞的粘附和生长提供了较好的微环境。 3.3. 细胞粘附率 由图 3可见，培养时间为1、3、5 h时，细胞在 SF/PCL 比例为 70/30和50/50 的静电纺丝网表面的粘 附率明显高于其他SF/PCL 比例的静电纺丝网，这主 要是由于SF/PCL 比例为 70/30 和50/50的静电纺丝网 上纳米级纤维多，有助于细胞的粘附，同时存在微米 级纤维，纳米级纤维和微米级纤维交错存在，为细胞 的粘附提供了粘附的附着点，更有助于细胞的粘附。 2 h以及 4 h后，L-929 细胞在不同比例的SF/PCL 静 电纺丝网表面的粘附率均有所增加，SF/PCL 比例为 70/30 和50/50的静电纺丝网的细胞粘附率同样高于 其他 SF/PCL比例的静电纺丝网，有显著差异(P < 0.05)。 3.2. 扫描电子显微镜 从图 2中可以看出，随着培养时间的延长，各静 电纺丝网表面的细胞数量都逐渐增多且细胞分泌的 细胞外基质也逐渐在纺丝网上沉积。培养一天后， L-929 细胞在各比例 SF/PCL 静电纺丝网表面粘附并 开始生长；培养三天后，SF/PCL 比例为 70/30 和50/50 的静电纺丝网表面的细胞增殖数量明显增多，而且表 面细胞外基质的沉积面积比较大。培养至第五天时(图 片略)，各组静电纺丝网表面的细胞大量增殖，静电纺 丝网表面完全被细胞分泌的细胞外基质所覆盖。说明 L-929 细胞在五种不同比例 SF/PCL 的静电纺丝网表 面都可以粘附和生长，且 L-929细胞在比例为 70/30 和50/50的静电纺丝网表面的细胞增殖速度较快， SF/PCL 比例为 70/30和50/50 的静电纺丝网对细胞的 增殖明显高于其他比例下的静电纺丝网。静电纺丝网 3.4. 细胞活力 从图 4可以看出，细胞在各组材料上第一天的增 殖情况较为相近，未表现出显著的差异。培养至第三 天，各种材料的OD 值均有所增大，细胞活力增大、 细胞增殖率提高。SF/PCL 比例为 70/30 和50/50 的静 电纺丝网上细胞活力均比其他SF/PCL 比例的纳米纤 维上的高，有显著差异(P < 0.05)。第五天各组材料的 OD 值增加，他们之间仍存在差异，差异也具有统计 意义(P < 0.05)。第七天各组材料的 OD值增加，而 学  丝素/聚己内酯静电纺纤维的细胞相容性 Figure 2. The SEM images of L-929 cells cultured on the SF/PCL electrospun fibers surface; (A) SF; (B) SF/PCL = 70/30; (C) SF/PCL = 50/50; (D) SF/PCL = 30/70; (E) PCL. 1—cell culture 1 d; 3—cell culture 3 d 图2. L-929 细胞在 SF/PCL 静电纺丝网表面培养的扫描电镜图片；(A) SF；(B) SF/PCL = 70/30；(C) SF/PCL = 50/50；(D) SF/PCL = 30/70； (E) PCL.1—细胞培养 1 d；3—细胞培养 3 d Figure 3. The cell adhesion rate of L-929 cells cultured on the SF/PCL electrospun fibers surface 图3. L-929 细胞在 SF/PCL 静电纺丝网表面培养的细胞粘附率 Figure 4. The cell proliferation activity of L-929 cells cultured on the SF/PCL electrospun fibers surface 图4. SF/PCL 静电纺丝网表面的 L-929 细胞增殖活力 SF/PCL 比例为 70/30和50/50 的静电纺丝网更充分的 显示出其有利于细胞增殖和分化的能力，与其他各组 材料的差异非常明显，与纯SF 及纯 PCL 组之间都具 有极显著的差异(P < 0.01)。到了第九天，细胞在各组 材料表面的增殖趋于平缓，没有较大的增加，此时细 胞受生长空间的限制，各组材料之间的差异与第七天 类似。用 MTT 法测定得到的 OD 值反映了细胞活力 和细胞增殖率，图 4的结果表明，各种比例的 SF/PCL 静电纺丝网都可以支持细胞的生长和增殖，而各组材 料之间的细胞活力、细胞增殖率也有显著差异，细胞 在SF/PCL共混比例为 70/30 和50/50 的静电纺丝网表 面的增殖率明显高于其他各组材料，尤其是显著高于 纯SF 及纯 PCL 组材料。 4. 结论 激光共聚焦显微镜和扫描电镜的观察结果表明， L-929 细胞能够在 SF/PCL比例为100/0、70/30、50/50、 30/70 和0/100 的静电纺丝网表面充分伸展，细胞形态 正常。随着培养时间的延长，细胞数量增加，细胞外 基质沉积明显增多。而细胞在 SF/PCL共混比例为 70/30 和50/50的静电纺丝网表面的粘附率和增殖率 明显高于其他SF/PCL 比例的纤维网，SF/PCL 共混比 例为 70/30 和50/50 的静电纺丝网具有良好的细胞亲 和性。 参考文献 (References) [1] Vepari, C. and Kaplan, D.L. (2007) Silk as a biomaterial. Pro- gress in Polymer Science, 32, 991-1007. [2] Altman, G.H., Diaz, F., Jakuba, C., et al. (2003) Silk-based bio- Open Access 255  丝素/聚己内酯静电纺纤维的细胞相容性 materials. Biomaterials, 24, 401-416. [3] You, R., Zhang, Y., Liu, Y., Liu, G. and Li, M. 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