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Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2013, 2, 73-77
http://dx.doi.org/10.12677/hjfns.2013.24014 Published Online November 2013 (http://www.hanspub.org/journal/hjfns.html)
Determination of Methylene Blue Drug Residues in Import
and Export Aquatic Products by Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry*
Juyi Y in1, Jie Chen1, Haiqing Tang2, Yanxi a Mo2, Xia o j un Gu1, Meizhen Chen1, Weie r W u1, Weimin He1
1Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center, Ningbo City
2Import Food Testing Service Center of Ningbo Free Trade Zone, Ningbo City
Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn
Received: Aug. 30th, 2013; revised: Sep. 28th, 2013; accepted: Oct. 11th, 2013
Copyright © 2013 Juyi Yin et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre-
stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract: In this study, a HPLC-ESI(+)-MS/MS methodology is used for the high sensitive determination of drug resi-
due of methylene blue (MB) in import and export aquatic products. The sample was extracted by the acetonitrile and
operated with a neutral alumina column solid-phase extraction column. After elution, it was evaporated to dryness. The
residue was dissolved by constant volume liquid and was filtered through 0.45-µm membrane. The sample solution was
for determination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The liquid chromatography tandem mass spec-
trometry was operated in the positive ion mode, using multiple reaction monitoring (MRM) for qualitative and quantita-
tive analysis according to the calibration curve and the external standard method. Samples were detected with a ESI
positive mode detector at MRM: m/z 285.1/269.1 and m/z 285.1/241.0. In the line of quality assurance, the stated LOQ
of methylene blue residues in the negative sample was at the level of 0.1 µg/kg. The response for methylene blue was
linear in the range of 0.5 - 50.0 μg/L, and the correlation coefficient is excellent 0.999. The average recovery range of
this method was 87.6% - 111.2%, and the range of RSD was 4.0% - 10.2%.
Keywords: Aquatic Products; Methylene Blue (MB); LC-ESI(+)-MS/MS; Residues
液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留*
殷居易 1,陈 杰1,汤海青 2,莫燕霞 2,顾晓俊 1,陈梅珍 1,吴维尔 1,何卫敏 1
1宁波出入境检验检疫局技术中心,宁波
2宁波保税区进口食品检测服务中心,宁波
Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn
收稿日期:2013 年8月30 日;修回日期:2013年9月28日;录用日期:2013 年10 月11日
摘 要:运用高效液相色谱–电喷雾电离源串联四极杆质谱(HPLC-ESI(+)-MS/MS)法对进出口水产品中亚甲基
蓝药物残留进行高灵敏分析。样品经过乙腈溶剂提取后,用中性氧化铝柱固相萃取柱化,洗脱收集后蒸干,残
留用定容液溶解并过0.45 µm 滤膜过滤,样品溶液供液相色谱–串联质谱仪测定。用HPLC-MS/MS 在正离子模
式下进行多反应监测(MRM)测定,根据校准曲线和外标法定量。电喷雾电离源正离子MRM 模式检测:m/z 285.1/
269.1;285.1/241.0。方法测定低限(LOQ, S/N > 10)为0.1 μg/kg;线性范围:0.5~50 μg/L 内峰面积与浓度成良好
线性(R2 > 0.999)。方法平均回收率范围在87.6 %~111.2%,RSD 范围在 4.0%~10.2%。
*基金项目:浙江省科技厅项目,项目编号:2011C37064。
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液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留
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关键词:水产品;亚甲基蓝;液相色谱–串联质谱法;残留
1. 引言
亚甲基蓝[1-3](Methylene Blue,缩写 MB)属噻嗪类
碱性化合物抗菌染料,英文名称为:methylene blue;
化学名称为:氯化-3,7-双(二甲胺基)吩噻咛-5-鎓三水
化合物;分子式:C16H18C1N3S(见图 1);分子量:373.90。
亚甲基蓝又称亚甲蓝、次甲基蓝、美蓝、品蓝、甲烯
蓝、瑞士蓝(Swiss Blue)等;国际非专利药品名称(INN)
中又称为 Methylthioninium Chloride。MB 是一种芳香
杂环化合物,水溶液在氧化性环境中蓝色,但遇锌、
氨水等还原剂会被还原成无色形态。一般被用作化学
指示剂、染料、生物染色剂和药物使用;兽医治疗中
被批准用作消毒剂与解毒剂。由于其对防治淡水鱼的
水霉病、红嘴病、小瓜虫病等有较好疗效[4],自从孔
雀石绿、结晶紫等三苯甲烷类染料被广泛关注并禁用
于水产养殖后,亚甲基蓝成了一种潜在替代品。国外
研究发现,该染料及代谢物有致畸作用。
Figure 1. Chemical molecular structure of methylene blue
图1. 亚甲基蓝化学分子结构
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
Agilent 1200RRLC 高效液相色谱仪串接 API5000
质谱仪;电子天平(感量0.1 mg和0.01 g);冷冻离心
机(Sigma 3K30,西格马公司);氮吹仪(Organomation
Associates,美国 Jnc.公司);台式分散仪(PT-MR2100
型,瑞士);空旋转浓缩仪(BüCHI公司,瑞士);纯水
器MILLI-Q (MILLI PORECO 公司,美国);超声波清
洗器(250LH 型,KUDOS 公司);多功能食品粉碎机
(HL-2070 型);旋涡混合仪(Votexgenie-2型,德国)。
乙腈(色谱纯);5冰醋酸(色谱纯);甲 酸 (色谱纯);
正己烷(色谱纯);乙酸乙酯(色谱纯);中性氧化铝(分
析纯);无水硫酸钠(分析纯)。
近年国内外同类分析研究不多[5-18],综合分析国
内外现有文献本方法,现有动物产品中亚甲基蓝的残
留研究基本采用色谱法或色谱–串联质谱法测定。吴
艳兵等(2008 年)和王媛等(2013 年)建立了高效液相色
谱法检测水产品中亚甲基蓝残留,定量限分别为 0.01
mg/kg (检出限 2.7 μg/kg)和5.0 μg/kg;钱疆等(2008 年)
建立了液相色谱安培检测养殖用水中亚甲基蓝及其
代谢物,定量限为 0.5 μg/L ;行业而标准SN/T
1974~2007、Jin-Zhong Xu等(2009年)、杨方等(2009
年)、Ying-Jiang Xu等(2012 年)以及崔瑾等(2013 年)
都建立了液相色谱–串联质谱检测亚甲基蓝及其代
谢物残留的方法,定量下限分别为 0.5 μg/kg、0.5
μg/kg、0.5 μg/kg、0.3 µg/kg 以及 2.0 µg/kg。由于在日
本与美国该物质未被允许用于水产养殖,该禁止使用
药物的最低执行限量(MRPLs)要求将更加苛刻。因此,
进一步研究和监控其在国际水产品贸易中是否存在
违法添加使用,并从提高检测灵敏度和保持定性定量
准确度分析的角度进行优化测定十分迫切。
2.2. 标准溶液和试样制备保存
准确称取 10.00 ± 0.01 mg 标准物质,用甲醇溶解
于10 mL棕色容量瓶中 (可放置于超声波清洗器数分
钟促进溶解),定容后配成为1.0 mg/mL 浓度的标准储
备液;将储备液置于−0℃冰箱中保存备用。使用时用
乙腈稀释至所需浓度,临用临配。
水产品的肉类组织(可食肌肉组织,去除几丁质壳
及内脏等)取样约 100 g~250 g,必要时将试样样品用
四分法进行缩分;用多功能食品粉碎机绞碎,装入洁
净容器作为试样,密封,并标明标记。将试样于−20℃
冰柜保存备用。
2.3. 样品前处理
提取和称取约5.0 g左右(精确至0.1 g)的水产品
组织样品于50 mL 离心管中,依次加入无水硫酸钠1
g、中性氧化铝 2 g,用 20 mL 乙腈经台式分散仪打浆
处理;旋涡混合仪充分混匀2 min,放入高速冷冻离
心机离心(时间 10 min,转 速5000 rpm);吸取有机层;
重复操作一次,合并提取液,于旋转蒸发仪浓缩至 3
液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留
mL 左右用中性氧化铝层析柱净化(先用 5 mL乙腈活
化,上样后用 3 mL 乙腈洗脱),收集至 15 mL 离心管
中,于氮吹仪氮吹挥干,加入1 mL流动相,充分旋
涡混合,经 0.45 µm滤膜过滤,直接 LC-MS/MS 分析。
2.4. 色谱条件及测定
2.4.1. 色谱条件
色谱柱:Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5
m);流动相:乙腈:20 mM 乙酸铵混合;流速:0.8
mL/ m i n;进样量:50 L;温度:30℃(表1)。
2.4.2. 质谱仪器条件参数
1) 离子源:电喷雾离子源(ESI);
2) 离子模式:正离子化(+);
3) 离子源雾化温度(TEM) 475℃;
4) 流动相入源分流比 3:7(或使用辅助干燥气);
5) 各检测定量离子对及定性离子对及其他质谱
条件参数见下表2。
3. 结果与讨论
3.1. 色谱分离条件研究
LC-MS/MS 实验流动相一般是甲酸、乙酸水溶液
以及乙酸铵(挥发性盐)或者低浓度的乙酸铵盐溶液、
乙酸–乙酸铵离子对缓冲盐(需要时调节 pH)等。对于
多数正离子模式下的分析,一般需要少量的酸[H]+离
子,利于正离子化和[M + H]+准分子离子峰的生成;
而即便在负离子电离模式下,低浓度的乙酸铵盐溶液
能够起到参与增强和活化离子化过程作用。因此本次
试验选用了20 mM 乙酸铵水溶液和乙腈混合洗脱。另
外,色谱柱技术的发展和功能细化,已经远远超出前
期的应用;同样碳十八柱系列柱的键合功能团和特异
保留技术已经有了很多新技术。Agilent TC-C18 (250
mm × 4.6 mm, 5 m)色谱柱对多数极性化合物和非极
性化合物保留都比较合适,尤其适合碱性化合物分
析。实验首选了该柱,并对 UG120、MG-II 以及Waters
Atlantics-dC18 柱等实验室现有储备柱进行了比较。
Agilent TC-C18 在相同流动相条件下,结果的保留时
Table 1. Mobile phase conditions
表1. 流动相条件
Step Total Time
(min)
Flow Rate
(µL/min)
B
(%)
C
(%)
D
(%)
0 800 5.0 15.0 80.0
10 800 5.0 15.0 80.0
Table 2. The key parameters of mass spectrometry conditions
表2. 质谱条件关键参数
被测物
名称
保留时间
(min)
定性离子对
(m/z)
定量离子对
(m/z)
碰撞气能量
(CE)
亚甲基蓝 6.05 285.1/269.1
285.1/269.1
285.1/241.0
→47
→46
间、响应峰的尖锐程度(信噪比 S/N)以及分离度更优
异、适合。
3.2. 质谱测定条件的优化
三重四极杆质谱分析适合于极性化合物离子化
测定,通过调节仪器内部四极杆检测器(Q1)处于全扫
描模式(Full Scan),碰撞室(Q2)处于碰撞碎裂模式(碎
裂能量可调),进而通过四极杆检测器(Q3)监视由母离
子打碎后的特征基团碎片(子离子)。根据离子化原理
和待分析化合物分子结构等信息,通过全扫描模式寻
找到符合离子化的母离子碎片,即:母离子扫描(Parent
Ion Scan);找到符合离子化规则(如:[M + H]+,[M +
NH4]+等)的目标母离子后作子离子扫描(Pruduct Ion
Scan),通过调节碰撞碎裂能量的大小找到符合目标母
离子的特征子离子,并选取较高敏度的特征子离子作
为定性定量子离子。根据上述原理,首先采用 1 mg/L
的亚甲基蓝化合物的标准溶液分别以流动注射的方
式在正/负离子模式下分别进行母离子全扫描。
经试验确定:在正离子模式下亚甲基蓝的准分子
离子峰响应信号更优越;以亚甲基蓝正离子模式下的
准分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描,选取
丰度较强、干扰较小的子离子对为定性离子;其中响
应强度最高子离子为定量离子(见图 2)。
3.3. 样品基质效应的消除
电喷雾电离离子源(ESI)易受样品基质的影响。试
验中发现,样品基质对离子化有一定抑制作用。为消
除样品基质效应,实验以阴性组织样品提取液作为标
准溶液的稀释溶液,可使标准和样品溶液具有同样的
离子化条件,从而消除或较大降低样品基质效应影
响。
3.4. 样品提取和净化条件的选择
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液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留
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水产品肉类组织样品中脂肪含量相对不高,质谱
测定又具有较高的抗干扰能力,所以样品提取和净化
适用于简单快捷传统的方式。加入适当无水硫酸钠粉
末、中性氧化铝粉末调节提取液和组织液电解平衡
后,直接用适当乙腈打浆提取;涡旋后离心,取上层
有机试剂提取层;重复操作,合并提取液,于旋蒸仪
浓缩并过中性氧化铝SPE 柱净化,收集淋出液再次浓
Figure 2. The characteristic ion mass spectrometry analysis chromatogram of methylene blue
图2. 亚甲基蓝特征离子质谱分析谱图
缩定容后上样测试。分析结果显示回收效率良好。由
于处理步骤简捷、经济,比较适合基层检测部门和研
究院校采用。
3.5. 方法检测低限
经测定,本方法对亚甲基蓝的测定低限均可以达
到0.1 µg/kg (LOQ, S/N > 10);线性范围:0.5~50 μg/L
内峰面积与浓度成良好线性(R2 > 0.999) (图3)。
3.6. 方法特异性、回收率和精密度
以不含目标物质残留的进出口水产品(鱼、蟹、虾
及鱿等)的肌肉组织以及鱼籽、虾籽、鱼头软组织等可
食性动物源性样品为基质,分别进行了添加回收率试
验。方法平均回收率范围在 87.6%~111.2%,RSD 范
围在 4.0%~10.2%。
4. 结论
采用本方法对进出口水产品的食用部分样品为
基质进行分析,目标化合物亚甲基蓝出峰位置没有杂
质峰干扰测定,分析技术指标均符合食品农兽药残留
分析相关规定。
本次研究水产品中亚甲基蓝的测定低限优于现
有公开发表文献资料所述,分析方法满足目前国际上
Figure 3. Characteristics ion mass spectrometry chromatograms and
SNR diagram under low limit determined by adding matrix liquid (0.25
ng/ML)
图3. 添加基质液测定低限下特征离子质谱分析谱图及信噪比示意图
(0.25 ng/ML)
对该禁止使用药物的MRPLs 要求。由于分析仪器高
灵敏度、特异性和稳定性极大提升,用于色谱–串联
质谱法测定时对前处理的要求降低,也使得本方法秦
安处理过程更加简简洁,可满足快速、准确、方便的
测试需求。
液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留
参考文献 (References)
[1] Ziv, G. and Heavner, J.E. (1984) Permeability of the blood-milk
barrier to methylene blue in cows and goats. Journal of Veteri-
nary Pharmacology and Therapeutics, 7, 55-59.
[2] 李悦悦, 林云萍, 林诗燕 等 (1998) 孔雀绿、福尔马林、亚
甲基蓝对河蟹离体胚胎真菌病防治效果的比较.
水产科技情
报
, 2, 77-81.
[3] 朱其太, 于维军, 颜景堂 (2003) 密切关注欧盟禁用抗生素
规定 确保动物源性食品出口安全.
山东家禽
, 4, 43-46.
[4] 农业部《新编渔药手册》编撰委员会 (2005) 新编渔药手册.
中国农业出版社, 北京.
[5] Rengelshausen, J., Burhenne, J., Frohlich, M., Tayrouz, Y., et a1.
(2004) Pharmacokinetic interaction of chloroquine and methyl-
ene blue combination against malaria. European Journal of Cli-
nical Pharmacology, 60, 709-715.
[6] Gaudette, N.F. and Lodge, J.W. (2005) Determination of me-
thylene blue and leucomethylene blue in male and female fischer
344 rat urine and B6C3F1 mouse urine. Journal of Analytical
Toxicology, 29, 28-33.
[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 (2007) 进出口
水产品中亚甲基蓝残留量检测方法液相色谱–质谱/质谱法
和高效液相色谱法. SN/T 1974-2007.
[8] 钱疆, 陈国南, 杨方 等 (2008) 液相色谱安培检测养殖用水
中的孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物.
分析试验室
, 3,
69-72.
[9] 王若燕, 周晓萍, 杜赛 (2008) 固相萃取高效液相色谱法测
定血浆中亚甲蓝含量.
中国卫生检验杂志
, 10, 2012-2013.
[10] 李莉, 汤磊, 黄家宇 等 (2008) 高效液相色谱法测定亚甲基
蓝原料药的有关物质.
药物分析杂志
, 10, 116-119.
[11] 杨方, 刘正才, 胡小钟 等 (2008)噻嗪类染料在动物体内的
代谢及检测研究进展.
药物分析杂志
, 8, 1395-l399.
[12] 吴艳兵, 王建华, 李广领 等 (2008) 高效液相色谱法检测水
产品中亚甲基蓝的残留.
湖南农业科学
, 3, 165-167.
[13] Xu, J.-Z., Dai, L., Wu, B., et a1. (2009) Determination of me-
thylene blue residues in aquatic products by liquid chromatog-
raphy-tandem mass spectrometry. Journal of Separatio n Scie nce ,
32, 4193-4199.
[14] 杨方, 范克伟, 刘正才 等 (2009) 超高效液相色谱–串联质
谱联用法对水产品中亚甲基蓝及其代谢物残留的检测.
分析
测试学报
, 1, 32-36.
[15] Zhang, W.J., Zhou, C.J., Zhou, W.C., et a1. (2011) Fast and
considerable adsorption of methylene blue dye onto graphene
oxide. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,
87, 86-90.
[16] Xu, Y.-J., Tian, X.-H., Zhang, X.-Z., et a1. (2012) Simultaneous
determination of malachite green, crystal violet, methylene blue
and the metabolite residues in aquatic products by ultra-per-
formance liquid chromatography with electrospray ionization
tandem mass spectrometry. Journal of Chromatographic S cien ce,
50, 591-597.
[17] 王媛, 于慧娟, 钱蓓蕾 等 (2013) 液相色谱法测定水产品中
亚甲基蓝残留量.
分析试验室
, 1, 90-94.
[18] 崔瑾, 杨洪生, 章建浩 (2013) 超高效液相色谱-电喷雾串联
质谱法测定水产品中亚甲基蓝及代谢物.
南方水产科学
, 3,
67-73.
Open Access 77

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