 Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2013, 2, 73-77 http://dx.doi.org/10.12677/hjfns.2013.24014 Published Online November 2013 (http://www.hanspub.org/journal/hjfns.html) Determination of Methylene Blue Drug Residues in Import and Export Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry* Juyi Y in1, Jie Chen1, Haiqing Tang2, Yanxi a Mo2, Xia o j un Gu1, Meizhen Chen1, Weie r W u1, Weimin He1 1Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center, Ningbo City 2Import Food Testing Service Center of Ningbo Free Trade Zone, Ningbo City Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn Received: Aug. 30th, 2013; revised: Sep. 28th, 2013; accepted: Oct. 11th, 2013 Copyright © 2013 Juyi Yin et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: In this study, a HPLC-ESI(+)-MS/MS methodology is used for the high sensitive determination of drug resi- due of methylene blue (MB) in import and export aquatic products. The sample was extracted by the acetonitrile and operated with a neutral alumina column solid-phase extraction column. After elution, it was evaporated to dryness. The residue was dissolved by constant volume liquid and was filtered through 0.45-µm membrane. The sample solution was for determination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The liquid chromatography tandem mass spec- trometry was operated in the positive ion mode, using multiple reaction monitoring (MRM) for qualitative and quantita- tive analysis according to the calibration curve and the external standard method. Samples were detected with a ESI positive mode detector at MRM: m/z 285.1/269.1 and m/z 285.1/241.0. In the line of quality assurance, the stated LOQ of methylene blue residues in the negative sample was at the level of 0.1 µg/kg. The response for methylene blue was linear in the range of 0.5 - 50.0 μg/L, and the correlation coefficient is excellent 0.999. The average recovery range of this method was 87.6% - 111.2%, and the range of RSD was 4.0% - 10.2%. Keywords: Aquatic Products; Methylene Blue (MB); LC-ESI(+)-MS/MS; Residues 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留* 殷居易 1，陈 杰1，汤海青 2，莫燕霞 2，顾晓俊 1，陈梅珍 1，吴维尔 1，何卫敏 1 1宁波出入境检验检疫局技术中心，宁波 2宁波保税区进口食品检测服务中心，宁波 Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn 收稿日期：2013 年8月30 日；修回日期：2013年9月28日；录用日期：2013 年10 月11日 摘 要：运用高效液相色谱–电喷雾电离源串联四极杆质谱(HPLC-ESI(+)-MS/MS)法对进出口水产品中亚甲基 蓝药物残留进行高灵敏分析。样品经过乙腈溶剂提取后，用中性氧化铝柱固相萃取柱化，洗脱收集后蒸干，残 留用定容液溶解并过0.45 µm 滤膜过滤，样品溶液供液相色谱–串联质谱仪测定。用HPLC-MS/MS 在正离子模 式下进行多反应监测(MRM)测定，根据校准曲线和外标法定量。电喷雾电离源正离子MRM 模式检测：m/z 285.1/ 269.1；285.1/241.0。方法测定低限(LOQ, S/N > 10)为0.1 μg/kg；线性范围：0.5~50 μg/L 内峰面积与浓度成良好 线性(R2 > 0.999)。方法平均回收率范围在87.6 %~111.2%，RSD 范围在 4.0%~10.2%。 *基金项目：浙江省科技厅项目，项目编号：2011C37064。 Open Access 73  液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 Open Access 74 关键词：水产品；亚甲基蓝；液相色谱–串联质谱法；残留 1. 引言 亚甲基蓝[1-3](Methylene Blue，缩写 MB)属噻嗪类 碱性化合物抗菌染料，英文名称为：methylene blue； 化学名称为：氯化-3,7-双(二甲胺基)吩噻咛-5-鎓三水 化合物；分子式：C16H18C1N3S(见图 1)；分子量：373.90。 亚甲基蓝又称亚甲蓝、次甲基蓝、美蓝、品蓝、甲烯 蓝、瑞士蓝(Swiss Blue)等；国际非专利药品名称(INN) 中又称为 Methylthioninium Chloride。MB 是一种芳香 杂环化合物，水溶液在氧化性环境中蓝色，但遇锌、 氨水等还原剂会被还原成无色形态。一般被用作化学 指示剂、染料、生物染色剂和药物使用；兽医治疗中 被批准用作消毒剂与解毒剂。由于其对防治淡水鱼的 水霉病、红嘴病、小瓜虫病等有较好疗效[4]，自从孔 雀石绿、结晶紫等三苯甲烷类染料被广泛关注并禁用 于水产养殖后，亚甲基蓝成了一种潜在替代品。国外 研究发现，该染料及代谢物有致畸作用。 Figure 1. Chemical molecular structure of methylene blue 图1. 亚甲基蓝化学分子结构 2. 实验部分 2.1. 仪器与试剂 Agilent 1200RRLC 高效液相色谱仪串接 API5000 质谱仪；电子天平(感量0.1 mg和0.01 g)；冷冻离心 机(Sigma 3K30，西格马公司)；氮吹仪(Organomation Associates，美国 Jnc.公司)；台式分散仪(PT-MR2100 型，瑞士)；空旋转浓缩仪(BüCHI公司，瑞士)；纯水 器MILLI-Q (MILLI PORECO 公司，美国)；超声波清 洗器(250LH 型，KUDOS 公司)；多功能食品粉碎机 (HL-2070 型)；旋涡混合仪(Votexgenie-2型，德国)。 乙腈(色谱纯)；5冰醋酸(色谱纯)；甲 酸 (色谱纯)； 正己烷(色谱纯)；乙酸乙酯(色谱纯)；中性氧化铝(分 析纯)；无水硫酸钠(分析纯)。 近年国内外同类分析研究不多[5-18]，综合分析国 内外现有文献本方法，现有动物产品中亚甲基蓝的残 留研究基本采用色谱法或色谱–串联质谱法测定。吴 艳兵等(2008 年)和王媛等(2013 年)建立了高效液相色 谱法检测水产品中亚甲基蓝残留，定量限分别为 0.01 mg/kg (检出限 2.7 μg/kg)和5.0 μg/kg；钱疆等(2008 年) 建立了液相色谱安培检测养殖用水中亚甲基蓝及其 代谢物，定量限为 0.5 μg/L ；行业而标准SN/T 1974~2007、Jin-Zhong Xu等(2009年)、杨方等(2009 年)、Ying-Jiang Xu等(2012 年)以及崔瑾等(2013 年) 都建立了液相色谱–串联质谱检测亚甲基蓝及其代 谢物残留的方法，定量下限分别为 0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、0.3 µg/kg 以及 2.0 µg/kg。由于在日 本与美国该物质未被允许用于水产养殖，该禁止使用 药物的最低执行限量(MRPLs)要求将更加苛刻。因此， 进一步研究和监控其在国际水产品贸易中是否存在 违法添加使用，并从提高检测灵敏度和保持定性定量 准确度分析的角度进行优化测定十分迫切。 2.2. 标准溶液和试样制备保存 准确称取 10.00 ± 0.01 mg 标准物质，用甲醇溶解 于10 mL棕色容量瓶中 (可放置于超声波清洗器数分 钟促进溶解)，定容后配成为1.0 mg/mL 浓度的标准储 备液；将储备液置于−0℃冰箱中保存备用。使用时用 乙腈稀释至所需浓度，临用临配。 水产品的肉类组织(可食肌肉组织，去除几丁质壳 及内脏等)取样约 100 g~250 g，必要时将试样样品用 四分法进行缩分；用多功能食品粉碎机绞碎，装入洁 净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样于−20℃ 冰柜保存备用。 2.3. 样品前处理 提取和称取约5.0 g左右(精确至0.1 g)的水产品 组织样品于50 mL 离心管中，依次加入无水硫酸钠1 g、中性氧化铝 2 g，用 20 mL 乙腈经台式分散仪打浆 处理；旋涡混合仪充分混匀2 min，放入高速冷冻离 心机离心(时间 10 min，转 速5000 rpm)；吸取有机层； 重复操作一次，合并提取液，于旋转蒸发仪浓缩至 3  液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 mL 左右用中性氧化铝层析柱净化(先用 5 mL乙腈活 化，上样后用 3 mL 乙腈洗脱)，收集至 15 mL 离心管 中，于氮吹仪氮吹挥干，加入1 mL流动相，充分旋 涡混合，经 0.45 µm滤膜过滤，直接 LC-MS/MS 分析。 2.4. 色谱条件及测定 2.4.1. 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 m)；流动相：乙腈：20 mM 乙酸铵混合；流速：0.8 mL/ m i n；进样量：50 L；温度：30℃(表1)。 2.4.2. 质谱仪器条件参数 1) 离子源：电喷雾离子源(ESI)； 2) 离子模式：正离子化(+)； 3) 离子源雾化温度(TEM) 475℃； 4) 流动相入源分流比 3:7(或使用辅助干燥气)； 5) 各检测定量离子对及定性离子对及其他质谱 条件参数见下表2。 3. 结果与讨论 3.1. 色谱分离条件研究 LC-MS/MS 实验流动相一般是甲酸、乙酸水溶液 以及乙酸铵(挥发性盐)或者低浓度的乙酸铵盐溶液、 乙酸–乙酸铵离子对缓冲盐(需要时调节 pH)等。对于 多数正离子模式下的分析，一般需要少量的酸[H]+离 子，利于正离子化和[M + H]+准分子离子峰的生成； 而即便在负离子电离模式下，低浓度的乙酸铵盐溶液 能够起到参与增强和活化离子化过程作用。因此本次 试验选用了20 mM 乙酸铵水溶液和乙腈混合洗脱。另 外，色谱柱技术的发展和功能细化，已经远远超出前 期的应用；同样碳十八柱系列柱的键合功能团和特异 保留技术已经有了很多新技术。Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 m)色谱柱对多数极性化合物和非极 性化合物保留都比较合适，尤其适合碱性化合物分 析。实验首选了该柱，并对 UG120、MG-II 以及Waters Atlantics-dC18 柱等实验室现有储备柱进行了比较。 Agilent TC-C18 在相同流动相条件下，结果的保留时 Table 1. Mobile phase conditions 表1. 流动相条件 Step Total Time (min) Flow Rate (µL/min) B (%) C (%) D (%) 0 800 5.0 15.0 80.0 10 800 5.0 15.0 80.0 Table 2. The key parameters of mass spectrometry conditions 表2. 质谱条件关键参数 被测物 名称 保留时间 (min) 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 碰撞气能量 (CE) 亚甲基蓝 6.05 285.1/269.1 285.1/269.1 285.1/241.0 →47 →46 间、响应峰的尖锐程度(信噪比 S/N)以及分离度更优 异、适合。 3.2. 质谱测定条件的优化 三重四极杆质谱分析适合于极性化合物离子化 测定，通过调节仪器内部四极杆检测器(Q1)处于全扫 描模式(Full Scan)，碰撞室(Q2)处于碰撞碎裂模式(碎 裂能量可调)，进而通过四极杆检测器(Q3)监视由母离 子打碎后的特征基团碎片(子离子)。根据离子化原理 和待分析化合物分子结构等信息，通过全扫描模式寻 找到符合离子化的母离子碎片，即：母离子扫描(Parent Ion Scan)；找到符合离子化规则(如：[M + H]+，[M + NH4]+等)的目标母离子后作子离子扫描(Pruduct Ion Scan)，通过调节碰撞碎裂能量的大小找到符合目标母 离子的特征子离子，并选取较高敏度的特征子离子作 为定性定量子离子。根据上述原理，首先采用 1 mg/L 的亚甲基蓝化合物的标准溶液分别以流动注射的方 式在正/负离子模式下分别进行母离子全扫描。 经试验确定：在正离子模式下亚甲基蓝的准分子 离子峰响应信号更优越；以亚甲基蓝正离子模式下的 准分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选取 丰度较强、干扰较小的子离子对为定性离子；其中响 应强度最高子离子为定量离子(见图 2)。 3.3. 样品基质效应的消除 电喷雾电离离子源(ESI)易受样品基质的影响。试 验中发现，样品基质对离子化有一定抑制作用。为消 除样品基质效应，实验以阴性组织样品提取液作为标 准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的 离子化条件，从而消除或较大降低样品基质效应影 响。 3.4. 样品提取和净化条件的选择 Open Access 75  液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 Open Access 76 水产品肉类组织样品中脂肪含量相对不高，质谱 测定又具有较高的抗干扰能力，所以样品提取和净化 适用于简单快捷传统的方式。加入适当无水硫酸钠粉 末、中性氧化铝粉末调节提取液和组织液电解平衡 后，直接用适当乙腈打浆提取；涡旋后离心，取上层 有机试剂提取层；重复操作，合并提取液，于旋蒸仪 浓缩并过中性氧化铝SPE 柱净化，收集淋出液再次浓 Figure 2. The characteristic ion mass spectrometry analysis chromatogram of methylene blue 图2. 亚甲基蓝特征离子质谱分析谱图 缩定容后上样测试。分析结果显示回收效率良好。由 于处理步骤简捷、经济，比较适合基层检测部门和研 究院校采用。 3.5. 方法检测低限 经测定，本方法对亚甲基蓝的测定低限均可以达 到0.1 µg/kg (LOQ, S/N > 10)；线性范围：0.5~50 μg/L 内峰面积与浓度成良好线性(R2 > 0.999) (图3)。 3.6. 方法特异性、回收率和精密度 以不含目标物质残留的进出口水产品(鱼、蟹、虾 及鱿等)的肌肉组织以及鱼籽、虾籽、鱼头软组织等可 食性动物源性样品为基质，分别进行了添加回收率试 验。方法平均回收率范围在 87.6%~111.2%，RSD 范 围在 4.0%~10.2%。 4. 结论 采用本方法对进出口水产品的食用部分样品为 基质进行分析，目标化合物亚甲基蓝出峰位置没有杂 质峰干扰测定，分析技术指标均符合食品农兽药残留 分析相关规定。 本次研究水产品中亚甲基蓝的测定低限优于现 有公开发表文献资料所述，分析方法满足目前国际上 Figure 3. Characteristics ion mass spectrometry chromatograms and SNR diagram under low limit determined by adding matrix liquid (0.25 ng/ML) 图3. 添加基质液测定低限下特征离子质谱分析谱图及信噪比示意图 (0.25 ng/ML) 对该禁止使用药物的MRPLs 要求。由于分析仪器高 灵敏度、特异性和稳定性极大提升，用于色谱–串联 质谱法测定时对前处理的要求降低，也使得本方法秦 安处理过程更加简简洁，可满足快速、准确、方便的 测试需求。  液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 参考文献 (References) [1] Ziv, G. and Heavner, J.E. (1984) Permeability of the blood-milk barrier to methylene blue in cows and goats. 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