Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2013, 2, 73-77 http://dx.doi.org/10.12677/hjfns.2013.24014 Published Online November 2013 (http://www.hanspub.org/journal/hjfns.html) Determination of Methylene Blue Drug Residues in Import and Export Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry* Juyi Y in1, Jie Chen1, Haiqing Tang2, Yanxi a Mo2, Xia o j un Gu1, Meizhen Chen1, Weie r W u1, Weimin He1 1Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center, Ningbo City 2Import Food Testing Service Center of Ningbo Free Trade Zone, Ningbo City Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn Received: Aug. 30th, 2013; revised: Sep. 28th, 2013; accepted: Oct. 11th, 2013 Copyright © 2013 Juyi Yin et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: In this study, a HPLC-ESI(+)-MS/MS methodology is used for the high sensitive determination of drug resi- due of methylene blue (MB) in import and export aquatic products. The sample was extracted by the acetonitrile and operated with a neutral alumina column solid-phase extraction column. After elution, it was evaporated to dryness. The residue was dissolved by constant volume liquid and was filtered through 0.45-µm membrane. The sample solution was for determination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The liquid chromatography tandem mass spec- trometry was operated in the positive ion mode, using multiple reaction monitoring (MRM) for qualitative and quantita- tive analysis according to the calibration curve and the external standard method. Samples were detected with a ESI positive mode detector at MRM: m/z 285.1/269.1 and m/z 285.1/241.0. In the line of quality assurance, the stated LOQ of methylene blue residues in the negative sample was at the level of 0.1 µg/kg. The response for methylene blue was linear in the range of 0.5 - 50.0 μg/L, and the correlation coefficient is excellent 0.999. The average recovery range of this method was 87.6% - 111.2%, and the range of RSD was 4.0% - 10.2%. Keywords: Aquatic Products; Methylene Blue (MB); LC-ESI(+)-MS/MS; Residues 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留* 殷居易 1,陈 杰1,汤海青 2,莫燕霞 2,顾晓俊 1,陈梅珍 1,吴维尔 1,何卫敏 1 1宁波出入境检验检疫局技术中心,宁波 2宁波保税区进口食品检测服务中心,宁波 Email: yinjy@nbciq.gov.cn, tanghaiqing@nbu.edu.cn 收稿日期:2013 年8月30 日;修回日期:2013年9月28日;录用日期:2013 年10 月11日 摘 要:运用高效液相色谱–电喷雾电离源串联四极杆质谱(HPLC-ESI(+)-MS/MS)法对进出口水产品中亚甲基 蓝药物残留进行高灵敏分析。样品经过乙腈溶剂提取后,用中性氧化铝柱固相萃取柱化,洗脱收集后蒸干,残 留用定容液溶解并过0.45 µm 滤膜过滤,样品溶液供液相色谱–串联质谱仪测定。用HPLC-MS/MS 在正离子模 式下进行多反应监测(MRM)测定,根据校准曲线和外标法定量。电喷雾电离源正离子MRM 模式检测:m/z 285.1/ 269.1;285.1/241.0。方法测定低限(LOQ, S/N > 10)为0.1 μg/kg;线性范围:0.5~50 μg/L 内峰面积与浓度成良好 线性(R2 > 0.999)。方法平均回收率范围在87.6 %~111.2%,RSD 范围在 4.0%~10.2%。 *基金项目:浙江省科技厅项目,项目编号:2011C37064。 Open Access 73 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 Open Access 74 关键词:水产品;亚甲基蓝;液相色谱–串联质谱法;残留 1. 引言 亚甲基蓝[1-3](Methylene Blue,缩写 MB)属噻嗪类 碱性化合物抗菌染料,英文名称为:methylene blue; 化学名称为:氯化-3,7-双(二甲胺基)吩噻咛-5-鎓三水 化合物;分子式:C16H18C1N3S(见图 1);分子量:373.90。 亚甲基蓝又称亚甲蓝、次甲基蓝、美蓝、品蓝、甲烯 蓝、瑞士蓝(Swiss Blue)等;国际非专利药品名称(INN) 中又称为 Methylthioninium Chloride。MB 是一种芳香 杂环化合物,水溶液在氧化性环境中蓝色,但遇锌、 氨水等还原剂会被还原成无色形态。一般被用作化学 指示剂、染料、生物染色剂和药物使用;兽医治疗中 被批准用作消毒剂与解毒剂。由于其对防治淡水鱼的 水霉病、红嘴病、小瓜虫病等有较好疗效[4],自从孔 雀石绿、结晶紫等三苯甲烷类染料被广泛关注并禁用 于水产养殖后,亚甲基蓝成了一种潜在替代品。国外 研究发现,该染料及代谢物有致畸作用。 Figure 1. Chemical molecular structure of methylene blue 图1. 亚甲基蓝化学分子结构 2. 实验部分 2.1. 仪器与试剂 Agilent 1200RRLC 高效液相色谱仪串接 API5000 质谱仪;电子天平(感量0.1 mg和0.01 g);冷冻离心 机(Sigma 3K30,西格马公司);氮吹仪(Organomation Associates,美国 Jnc.公司);台式分散仪(PT-MR2100 型,瑞士);空旋转浓缩仪(BüCHI公司,瑞士);纯水 器MILLI-Q (MILLI PORECO 公司,美国);超声波清 洗器(250LH 型,KUDOS 公司);多功能食品粉碎机 (HL-2070 型);旋涡混合仪(Votexgenie-2型,德国)。 乙腈(色谱纯);5冰醋酸(色谱纯);甲 酸 (色谱纯); 正己烷(色谱纯);乙酸乙酯(色谱纯);中性氧化铝(分 析纯);无水硫酸钠(分析纯)。 近年国内外同类分析研究不多[5-18],综合分析国 内外现有文献本方法,现有动物产品中亚甲基蓝的残 留研究基本采用色谱法或色谱–串联质谱法测定。吴 艳兵等(2008 年)和王媛等(2013 年)建立了高效液相色 谱法检测水产品中亚甲基蓝残留,定量限分别为 0.01 mg/kg (检出限 2.7 μg/kg)和5.0 μg/kg;钱疆等(2008 年) 建立了液相色谱安培检测养殖用水中亚甲基蓝及其 代谢物,定量限为 0.5 μg/L ;行业而标准SN/T 1974~2007、Jin-Zhong Xu等(2009年)、杨方等(2009 年)、Ying-Jiang Xu等(2012 年)以及崔瑾等(2013 年) 都建立了液相色谱–串联质谱检测亚甲基蓝及其代 谢物残留的方法,定量下限分别为 0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、0.3 µg/kg 以及 2.0 µg/kg。由于在日 本与美国该物质未被允许用于水产养殖,该禁止使用 药物的最低执行限量(MRPLs)要求将更加苛刻。因此, 进一步研究和监控其在国际水产品贸易中是否存在 违法添加使用,并从提高检测灵敏度和保持定性定量 准确度分析的角度进行优化测定十分迫切。 2.2. 标准溶液和试样制备保存 准确称取 10.00 ± 0.01 mg 标准物质,用甲醇溶解 于10 mL棕色容量瓶中 (可放置于超声波清洗器数分 钟促进溶解),定容后配成为1.0 mg/mL 浓度的标准储 备液;将储备液置于−0℃冰箱中保存备用。使用时用 乙腈稀释至所需浓度,临用临配。 水产品的肉类组织(可食肌肉组织,去除几丁质壳 及内脏等)取样约 100 g~250 g,必要时将试样样品用 四分法进行缩分;用多功能食品粉碎机绞碎,装入洁 净容器作为试样,密封,并标明标记。将试样于−20℃ 冰柜保存备用。 2.3. 样品前处理 提取和称取约5.0 g左右(精确至0.1 g)的水产品 组织样品于50 mL 离心管中,依次加入无水硫酸钠1 g、中性氧化铝 2 g,用 20 mL 乙腈经台式分散仪打浆 处理;旋涡混合仪充分混匀2 min,放入高速冷冻离 心机离心(时间 10 min,转 速5000 rpm);吸取有机层; 重复操作一次,合并提取液,于旋转蒸发仪浓缩至 3 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 mL 左右用中性氧化铝层析柱净化(先用 5 mL乙腈活 化,上样后用 3 mL 乙腈洗脱),收集至 15 mL 离心管 中,于氮吹仪氮吹挥干,加入1 mL流动相,充分旋 涡混合,经 0.45 µm滤膜过滤,直接 LC-MS/MS 分析。 2.4. 色谱条件及测定 2.4.1. 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 m);流动相:乙腈:20 mM 乙酸铵混合;流速:0.8 mL/ m i n;进样量:50 L;温度:30℃(表1)。 2.4.2. 质谱仪器条件参数 1) 离子源:电喷雾离子源(ESI); 2) 离子模式:正离子化(+); 3) 离子源雾化温度(TEM) 475℃; 4) 流动相入源分流比 3:7(或使用辅助干燥气); 5) 各检测定量离子对及定性离子对及其他质谱 条件参数见下表2。 3. 结果与讨论 3.1. 色谱分离条件研究 LC-MS/MS 实验流动相一般是甲酸、乙酸水溶液 以及乙酸铵(挥发性盐)或者低浓度的乙酸铵盐溶液、 乙酸–乙酸铵离子对缓冲盐(需要时调节 pH)等。对于 多数正离子模式下的分析,一般需要少量的酸[H]+离 子,利于正离子化和[M + H]+准分子离子峰的生成; 而即便在负离子电离模式下,低浓度的乙酸铵盐溶液 能够起到参与增强和活化离子化过程作用。因此本次 试验选用了20 mM 乙酸铵水溶液和乙腈混合洗脱。另 外,色谱柱技术的发展和功能细化,已经远远超出前 期的应用;同样碳十八柱系列柱的键合功能团和特异 保留技术已经有了很多新技术。Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 m)色谱柱对多数极性化合物和非极 性化合物保留都比较合适,尤其适合碱性化合物分 析。实验首选了该柱,并对 UG120、MG-II 以及Waters Atlantics-dC18 柱等实验室现有储备柱进行了比较。 Agilent TC-C18 在相同流动相条件下,结果的保留时 Table 1. Mobile phase conditions 表1. 流动相条件 Step Total Time (min) Flow Rate (µL/min) B (%) C (%) D (%) 0 800 5.0 15.0 80.0 10 800 5.0 15.0 80.0 Table 2. The key parameters of mass spectrometry conditions 表2. 质谱条件关键参数 被测物 名称 保留时间 (min) 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 碰撞气能量 (CE) 亚甲基蓝 6.05 285.1/269.1 285.1/269.1 285.1/241.0 →47 →46 间、响应峰的尖锐程度(信噪比 S/N)以及分离度更优 异、适合。 3.2. 质谱测定条件的优化 三重四极杆质谱分析适合于极性化合物离子化 测定,通过调节仪器内部四极杆检测器(Q1)处于全扫 描模式(Full Scan),碰撞室(Q2)处于碰撞碎裂模式(碎 裂能量可调),进而通过四极杆检测器(Q3)监视由母离 子打碎后的特征基团碎片(子离子)。根据离子化原理 和待分析化合物分子结构等信息,通过全扫描模式寻 找到符合离子化的母离子碎片,即:母离子扫描(Parent Ion Scan);找到符合离子化规则(如:[M + H]+,[M + NH4]+等)的目标母离子后作子离子扫描(Pruduct Ion Scan),通过调节碰撞碎裂能量的大小找到符合目标母 离子的特征子离子,并选取较高敏度的特征子离子作 为定性定量子离子。根据上述原理,首先采用 1 mg/L 的亚甲基蓝化合物的标准溶液分别以流动注射的方 式在正/负离子模式下分别进行母离子全扫描。 经试验确定:在正离子模式下亚甲基蓝的准分子 离子峰响应信号更优越;以亚甲基蓝正离子模式下的 准分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描,选取 丰度较强、干扰较小的子离子对为定性离子;其中响 应强度最高子离子为定量离子(见图 2)。 3.3. 样品基质效应的消除 电喷雾电离离子源(ESI)易受样品基质的影响。试 验中发现,样品基质对离子化有一定抑制作用。为消 除样品基质效应,实验以阴性组织样品提取液作为标 准溶液的稀释溶液,可使标准和样品溶液具有同样的 离子化条件,从而消除或较大降低样品基质效应影 响。 3.4. 样品提取和净化条件的选择 Open Access 75 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 Open Access 76 水产品肉类组织样品中脂肪含量相对不高,质谱 测定又具有较高的抗干扰能力,所以样品提取和净化 适用于简单快捷传统的方式。加入适当无水硫酸钠粉 末、中性氧化铝粉末调节提取液和组织液电解平衡 后,直接用适当乙腈打浆提取;涡旋后离心,取上层 有机试剂提取层;重复操作,合并提取液,于旋蒸仪 浓缩并过中性氧化铝SPE 柱净化,收集淋出液再次浓 Figure 2. The characteristic ion mass spectrometry analysis chromatogram of methylene blue 图2. 亚甲基蓝特征离子质谱分析谱图 缩定容后上样测试。分析结果显示回收效率良好。由 于处理步骤简捷、经济,比较适合基层检测部门和研 究院校采用。 3.5. 方法检测低限 经测定,本方法对亚甲基蓝的测定低限均可以达 到0.1 µg/kg (LOQ, S/N > 10);线性范围:0.5~50 μg/L 内峰面积与浓度成良好线性(R2 > 0.999) (图3)。 3.6. 方法特异性、回收率和精密度 以不含目标物质残留的进出口水产品(鱼、蟹、虾 及鱿等)的肌肉组织以及鱼籽、虾籽、鱼头软组织等可 食性动物源性样品为基质,分别进行了添加回收率试 验。方法平均回收率范围在 87.6%~111.2%,RSD 范 围在 4.0%~10.2%。 4. 结论 采用本方法对进出口水产品的食用部分样品为 基质进行分析,目标化合物亚甲基蓝出峰位置没有杂 质峰干扰测定,分析技术指标均符合食品农兽药残留 分析相关规定。 本次研究水产品中亚甲基蓝的测定低限优于现 有公开发表文献资料所述,分析方法满足目前国际上 Figure 3. Characteristics ion mass spectrometry chromatograms and SNR diagram under low limit determined by adding matrix liquid (0.25 ng/ML) 图3. 添加基质液测定低限下特征离子质谱分析谱图及信噪比示意图 (0.25 ng/ML) 对该禁止使用药物的MRPLs 要求。由于分析仪器高 灵敏度、特异性和稳定性极大提升,用于色谱–串联 质谱法测定时对前处理的要求降低,也使得本方法秦 安处理过程更加简简洁,可满足快速、准确、方便的 测试需求。 液相色谱串联质谱法测定进出口水产品中亚甲基蓝药物残留 参考文献 (References) [1] Ziv, G. and Heavner, J.E. (1984) Permeability of the blood-milk barrier to methylene blue in cows and goats. 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