 Advance in Microbiology 微生物前沿, 2013, 2, 98-101 http://dx.doi.org/10.12677/amb.2013.24018 Published Online December 2013 (http://www.hanspub.org/journal/amb.html) Progress on Bacterial Biofilm Formation and Antibiotics Resistance Mechanisms* Min Zhou, Lixiang You, Qing Zhao, Yuanyuan Li#, Shuyan Wu#, Rui Huang Department of Microbiology, School of Medicine and Bioscience, Soochow University, Suzhou Email: #liyuanyuan@suda.edu.cn, #shuyanzw@aliyun.com Received: Nov. 24th, 2013; revised: Dec. 8th, 2013; accepted: Dec. 12th, 2013 Copyright © 2013 Min Zhou et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. In accordance of the Creative Commons At- tribution License all Copyrights © 2013 are reserved for Hans and the owner of the intellectual property Min Zhou et al. All Copyright © 2013 are guarded by law and by Hans as a guardian. Abstract: Bacterial resistance to antib iotics h as b eco me a glob al medical and social issue. Bacterial biofilm (BBF) is an important aspect of bacterial resistance. It is a special bacterial community formed by bacteria and their extracellular polymeric matrix. It has a special spatial structure that can produce a strong barrier to resist antibiotics, enhance the communication among bacteria and transfer the resistance genes. In the process of the transmission of resistance genes, plasmid plays a great role as gene vector. Meanwhile, BBF interacts closely with gene expression. The research on BBF, plasmid and drug resistance genes can facilitate understanding of the spread and prevention of BBF resistance. Keywords: Bacterial Biofilm; Antibiotic Resistance; Drug Resistance Genes; Plasmid 细菌生物膜的形成及耐药机制研究进展* 周 敏，尤理想，赵 青，李嫄渊#，吴淑燕#，黄 瑞 苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系，苏州 Email: #liyuanyuan@suda.edu.cn, #shuyanzw@aliyun.com 收稿日期：2013 年11 月24 日；修回日期：2013 年12 月8日；录用日期：2013 年12 月12 日 摘 要：细菌对抗生素的耐药性已成为全球关注的医学及社会问题，细菌生物被膜(Bacterial biofilm, BBF)是细 菌耐药性产生的一个重要方面。BBF 是由细菌及其产生的胞外大分子多聚物形成的一种特殊细菌群落。这种细 菌群落具有特殊的空间结构，能产生很强的屏障作用，抵抗抗生素的杀菌作用，并且可以加强群落内细菌的交 流，传递耐药基因。在耐药基因的传递过程中，质粒作为基因的载体起到了极大的作用。同时，BBF 与基因表 达存在相互影响的关系。对 BBF、耐药基因及质粒的研究，可以提高对 BBF 耐药性播散的认识，有助于防治细 菌耐药性。 关键词：细菌生物膜；耐药性；耐药基因；质粒 1. 引言 细菌生物被膜(Bacterial biofilm, BBF)是指多个细 菌不可逆地黏附于机体或物体表面，被自身细胞分泌 的基质所包裹，是与浮游细菌不同的新表型[1]。BBF 可谓是无处不在，在一定条件下几乎所有的细菌都能 形成 BBF，目前认为 99%的细菌以 BBF 的形式存在， 65%~80%的人类感染性疾病与 BBF 有关[2]。细菌可以 *基金项目：江苏省自然科学基金(No.2011286)；苏州大学大学生创 新创业训练计划项目(No.2012yb017)。 #通讯作者。 Open Access 98  细菌生物膜的形成及耐药机制研究进展 在水管内面、水流过滤器表面等物品上形成 BBF，给 人类的生活带来极大的危害，甚至可黏附在临床医疗 器械如导尿管、内窥镜管腔、呼吸机导管中形成 BBF， 这已成为介入性医源性感染的主要感染源。细菌形成 BBF 后，不但难以清除，而且对抗生素的抵抗力也有 了极大提高，同时可逃避宿主免疫作用和抗菌药物的 杀伤作用。质粒(Plasmid)是细菌染色体外能够自主复 制的较小的 DNA 分子，可作为基因的载体参与细菌 间耐药基因的传递，与细菌耐药性有着密切关联。研 究BBF 的形成及质粒的高表达对探索耐药性的作用 机制具有重要的临床意义。 2. BBF的特殊空间结构 BBF 为细菌提供了一个特殊的空间结构，BBF 均 由胞外聚合物(Extracellular polymeric substances, EPS) 和不同程度地包绕于其中的细菌所组成，BBF内细菌 密度高，使细菌间的空间结构狭小，构成了一种特殊 的三维结构[3]。通 过BBF 的空间结构而建立的底物和 营养梯度，使得 BBF 中细菌的活动度不同。根据细菌 在BBF 内位置的不同可将其分为表层菌和深层菌。表 层菌容易获得营养和氧气，代谢产物也容易排出，因 而生理代谢比较活跃，分裂较快；深层菌则处于休眠 或静止状态，缺乏营养和氧气，代谢缓慢。由于大多 数多糖蛋白复合物带负电荷，可从周围环境中吸引各 种有机物和无机物，所以不同细菌及不同环境下 BBF 形态有所不同，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)表面形成一种柔韧的、有一定厚度的并突 向介质内的多糖蛋白复合物；而肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella peneumoniae)的多糖复合物则僵硬且均匀 完整地分布于细菌表面。BBF 并非一层致密的膜结 构，而是内含水通道，对流的水分可输送养料、酶、 代谢产物及其他排泄废物，以满足细菌生存的需要。 BBF 如此复杂的结构有助于其适应物理的、化学的等 多样性变化的环境。 BBF 对细菌的作用表现在很多方面。BBF 内细菌 代谢状态的不同，使得细菌在任何状态下都能存活一 部分。当浮游细菌活性高、分裂频繁时，质粒丢失的 速度增加，会导致缺失质粒的细菌增多；而 BBF 内的 细菌相比同类浮游菌，其活性低，分裂减少，使质粒 缺失较少发生。同时由于用于质粒复制的能量减少， 使得细菌维持质粒代谢的负担相应减少[4]。BBF 中细 菌质粒的存活率增高，加强了对耐药基因的保护和传 递作用。此外，由于细菌的代谢率降低，抗生素通过 作用于代谢环节影响细菌活性的概率也降低。研究发 现BBF 的微环境发生了改变，氧气在 BBF 表面被消 耗殆尽，导致其深处为厌氧环境，而氨基糖苷类抗生 素对微生物的作用在厌氧条件下要明显低于有氧条 件。BBF 中pH、渗透压环境等改变也会导致细菌胞 膜对抗生素敏感性的下降[5]。BBF 的异质性指不同部 位BBF 的细菌展现不同的基因表达模式，发挥不同的 功能，这是 BBF 最大的特点。BBF垂直方向不同层 面的细菌 RNA 含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同， 同时由于细菌所处微环境的pH和氧化还原电位等不 同，可使遗传学上一致的细菌个体表现不同的特征， 如产生毒素的不同可使 BBF 内一些细菌个体对宿主 无害，而另一些细菌则可能对宿主产生致命威胁[6]。 BBF 中细菌微环境和生理状态的不同，使得细菌对质 粒的反应不同，质粒更容易进入适合其表达的宿主 菌，促使耐药基因的出现与播散。 3. BBF的屏障作用 BBF 内的细菌对不利条件如干燥、极端温度、抗 菌药物和消毒剂等的抵抗力均明显增强[7]。与浮游细 菌相比，处于 BBF 中的细菌对抗生素的抵抗性可提高 10~1000 倍。BBF 主要由大量胞外多聚物构成，可阻 碍抗生素的渗透，促进其耐药性。BBF的特殊结构， 也能有效地阻止抗微生物蛋白酶和补体等大分子的 进入。有研究表明，BBF可限制氧自由基的扩散，抵 抗氧自由基的损害。此外，BBF 内的胞外黏质物是带 负电荷的，可与大量的抗生素分子结合；同时许多抗 生素水解酶可以固定在 BBF 上，使进入膜内的抗生素 被灭活，从而使渗入并接触到 BBF 内细菌的抗菌药物 大大减少，达不到抑菌、杀菌浓度而使药物失效。BBF 中多糖蛋白复合物的聚积，可减慢抗生素渗透速度， 延长其渗透时间，使得细菌有足够的时间启动耐药基 因来抵抗抗生素。但是，渗透障碍并不可能是BBF 耐药的唯一机制，如利福平、克林霉素和大环内酯类 等药物，就能顺利地通过 BBF 进而渗透入细胞内。 BBF 还可以通过抵抗吞噬细胞的作用等多种方 式对抗机体免疫防御机制。对呼吸机导管内的BBF Open Access 99  细菌生物膜的形成及耐药机制研究进展 研究发现，超声波洗脱下的 BBF 碎片与吞噬细胞共育 时，虽然吞噬细胞对 BBF 有趋化作用，但吞噬细胞不 能通过吞入过程直接清除 BBF。BBF 不仅具有明显抗 吞噬作用，甚至可以包裹吞噬细胞限制其自身吞噬功 能[8]。在小鼠巨噬细胞对铜绿假单胞菌作用的实验中 发现，巨噬细胞可通过吞噬作用阻止细菌的入侵，但 当铜绿假单胞菌形成 BBF 时，细菌可分泌大剂量的藻 酸盐抑制巨噬细胞对细菌的吞噬作用，逃避宿主的免 疫反应[9]。BBF 的抗吞噬作用，保护了细菌及其耐药 基因，导致细菌耐药性的播散，易于造成更大的危害。 4. BBF与细菌基因表达的相互影响 耐药基因的表达可影响 BBF 的形成。这些基因主 要是通过促进细菌间的黏附，促进 BBF 的形成。大肠 杆菌(Escherichia coli)的luxS 基因，可合成 AI-2 信号 分子，通过促进鞭毛的表达、增强细菌的活力，促进 BBF 的形成[10]。肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)鸡 源株 ompR 基因缺失，影响菌毛和纤维素的表达导致 其不能形成 BBF[11]。Ghigo 等发现所有已知的接合质 粒，都能通过合成细胞表面黏附物质，启动表面相关 的BBF 形成[12]。本实验室的研究也证实了伤寒沙门 菌质粒 pRST98 可促进生物膜的形成。而部分基因对 BBF 的形成有抑制作用，表皮葡萄球菌(St ap hyl ococcus epidermidis)中ica R 基因对 ica/Aica D 的表达有抑制 作用，可减少 PIA 的合成，从而抑制 BBF 的形成[13]。 铜绿假单胞菌 pvdQ基因所编码的蛋白可促使细菌进 入静止状态，也会抑制 BBF 的形成[14]。 BBF 内细菌与浮游菌相比，出现了特有的基因表 达模式，使其生物学行为也随之改变。BBF 特有的表 型能够激活其耐药机制。实验研究中发现，铜绿假单 胞菌形成 BBF 后，基因表达发生了变化。ropS 基因 与细菌形态结构及对抗生素敏感性有关，在 BBF 中 ropS 基因的表达被抑制，使其形成的 BBF 比野生株 更厚更坚固，耐药性也更强；tolA基因的高度表达引 起氨基糖苷类药物与细菌外膜的结合力下降，使其耐 药性增强；该菌还存在一种调控相位变异的蛋白质 (Phenotype variant regulator, PvrR)，控制着细菌对抗生 素敏感和耐药的转化，其相应基因在生物膜细菌中转 录活跃，通过抑制或激活 PvrR 的表达来调控铜绿假 单胞菌 BBF 的耐药性[15]。 5. BBF中耐药基因的传递作用 耐药基因的表达是细菌耐药性的重要机制，而 BBF 中耐药基因的传递是细菌获得耐药性及其播散 的主要途径。水平基因转移(H ori zontal gene tra ns fer， HGT)为供体和受体之间的非亲代到子代的遗传物质 交换。这种机制帮助了 BBF 中耐药基因的传递。耐药 基因可存在于质粒上，质粒易作为耐药基因载体参与 基因转移，其原因可能有：1) 质粒的表达依赖于细菌 的存活，因此质粒帮助细菌进化完善，适应环境的变 化，使其群体保持稳定；2) 当基因从细菌染色体转移 到质粒中时，新的更强的启动子也会和基因一并转 移；3) 相较于细菌染色体，质粒更易在细菌之间传递， 因此质粒上的编码基因可能存在更多的相同序列，使 其基因数量占优势[16]。 质粒参与的 HGT主要有接合和转化两种形式。 接合是供体菌通过性菌毛将遗传物质(主要是质粒 DNA) 传递给受体菌的过程。本实验室以往的研究表 明，伤寒沙门菌可通过 R质粒把耐药基因传递给人体 的正常菌群大肠杆菌，而接受耐药基因后的大肠杆菌 也可以把耐药基因传递给其他肠道致病菌[17]。在 BBF 的形成过程中，菌毛促进细菌的聚集，在这种高密度 聚集的菌群中，细菌间通过接合发生基因转移的效率 较高。研究表明，BBF 中细菌间的接合频率远大于浮 游细菌[18]。转化是受体菌直接摄取供体菌的游离 DNA 获得新的遗传性状的过程。在天然发生的转化体系 中，细菌一般在进入一种被称为感受态的特殊生理状 态时，才能够捕获外源的转化DNA。BBF基质中存 在大量的细胞外DNA(extra DNA, eDNA)，这些eDNA 对BBF 基质的稳定起着重要的作用[19]。有实验证明， BBF 中的 eDNA 可以触发细胞进入感受态，从而使得 质粒转化的宿主范围扩大[20]。由此可见，HGT 的增强 加快耐药基因在 BBF 内的传递，从而提高了细菌的耐 药性。 6. 展望 伴随着抗生素的大量应用，细菌耐药性日益成为 严重威胁人类健康的重要问题，人们对细菌耐药性的 研究也越来越深入。BBF 的形成使细菌更能适应多样 化的生存环境，并且较浮游菌具有更强的耐药性和抵 抗能力。对 BBF 的研究是微生物学发展的重要一步， Open Access 100  细菌生物膜的形成及耐药机制研究进展 Open Access 101 BBF 内的基因传递也可能是细菌获得耐药基因的主 要途径。随着 BBF 的解离，获得耐药基因的菌株将导 致细菌耐药性的播散，造成更大危害。随着对耐药机 制研究的深入，必然会出现新的理论与技术，创造出 抵抗细菌耐药性的有效方法，进而对解决BBF 相关耐 药性这一难题产生重要的影响。 参考文献 (References) [1] Qu, Y. , Daley, A.J., Istivan, T.S., et al. 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