流式细胞仪方法定量评价巨噬细胞非调理素吞噬能力 Macrophage Phagocytosis Abilities Measured with Flow Cytometry Method

doi:10.12677/is.2014.21001

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Immunology Stud i es 免疫学研究, 2014, 2, 1-4

http://dx.doi.org/10.12677/is.2014.21001 Published Online February 2014 (http://www.hanspub.org/journal/is.html)

Macrophage Phagocytosis Abilities Measured with Flow

Cytometry Method

Yan Zhang1,2,3, Zhengguo Zhang2,3, Xi Chen2,3, Limei Han1*, Guangwei Liu2,3*

1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang

2Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai

3Biotherapy Research Center, Fudan University, Shanghai

Email: *limeihan@hotmail.com, *liugw@fudan.edu.cn

Received: Nov. 5th, 2013; revised: Nov. 19th, 2013; accepted: Dec. 4th, 2013

stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the origin al work is properly cited. In accordance of th e Creative Commons At-

guarded by law and by Hans as a guardian.

Abstract: Macrophage is an important component of innate immunity, which plays a great role in anti-infection im-

munity. The accurate evaluation of non-opsonic phagocytosis of macrophages is often used as an important indicator of

the non-specific immune responses when bacterial infection occurs. In the present study, the non-opsonic phagocytosis

of macrophages in resident or inflammatory infiltrating cond ition was quantificationally detected by using flow cyto-

metry method combined with bacterial counts . Th is method will contribute to the q uantitative evaluation for the ability

of macrophage phagocytosis and the accurate response to macrophage immunity in a variety of physiological and pa-

thological condition s.

Keywords: Flow Cytometry; Macrophages; Non-Opso ni c Phagocytosis

流式细胞仪方法定量评价巨噬细胞非调理素吞噬能力

张妍1,2,3，张正国 2,3，陈茜2,3，汉丽梅 1*，刘光伟 2,3*

1沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳

2复旦大学基础医学院免疫学系，上海

3复旦大学生物治疗研究中心，上海

Email: *limeihan@hotmail.com, *liugw@fudan.edu.cn

收稿日期：2013 年11 月5日；修回日期：2013 年11 月19 日；录用日期：2013 年12 月4日

摘要：巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，在抗细菌感染等免疫应答中发挥重要调控作用。当细菌等病原微生

物感染机体时，准确的定量评价巨噬细胞的非调理素吞噬能力，常常被作为评价机体非特异免疫应答能力的重

要指标。本文采用流式细胞仪结合细菌计数的方法，定量的检测了定居巨噬细胞和炎症浸润的巨噬细胞对细菌

的非调理素吞噬能力变化。该研究方法将有助于定量评价在免疫应答中巨噬细胞的吞噬能力变化，以更准确反

映在各种生理或病理条件下巨噬细胞的免疫应答状态。

关键词：流式细胞仪；巨噬细胞；非调理素吞噬

1. 引言

巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，在抗细菌感染

等免疫应答中发挥重要调控作用[1]。当细菌等病原微

生物感染机体时，巨噬细胞常常是首先发挥免疫应答

反应的细胞。在局部炎症因子刺激下，局部定居的巨

*汉丽梅和刘光伟同为通讯作者。

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流式细胞仪方法定量评价巨噬细胞非调理素吞噬能力

噬细胞和炎症浸润的巨噬细胞迅速集聚到炎症局部，

通过有效的吞噬反应，进行抗原处理、消化并最终提

呈抗原给适应性免疫细胞，同时也伴随大量的细胞因

子分泌[2-4]。在这一巨噬细胞炎症反应过程中，对巨噬

细胞吞噬能力的评价常常可以直接反映机体早期的

免疫应答状态。因此，如何有效和准确的评价巨噬细

胞的非调理素吞噬能力，就成为巨噬细胞免疫能力检

测的重要指标。

本文采用流式细胞仪结合细菌计数的方法，定量

地检测定居巨噬细胞(peritoneal macrophages; PEMs)

和炎症浸润巨噬细胞(thioglycollate-induced macro-

phages; T EMs )对细菌的非调理素吞噬能力变化。该研

究将有助于定量评价免疫应答中巨噬细胞吞噬能力，

以更准确反映在各种生理或病理条件下巨噬细胞的

免疫应答状态。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

C57BL/6 小鼠，体质量(20 ± 2)g，雌雄兼用，购

自复旦大学实验动物中心。

2.2. 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备

采用 5 mL注射器和冷 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液

(PBS)反复灌洗小鼠腹膜腔，将灌洗液收集于 50 mL

离心管中，离心(1500 r/min, 5 min)。弃上清液，再用

冷PBS 液洗两次。混匀后用台盼蓝(北京中杉生物技

术公司)染色和计数，并调整活细胞数至 1 × 106个/mL。

将1 mL腹腔悬液加入预先用 2%明胶(eBioscience)处

理的 24 孔板(Costar)中，于5% CO2细胞培养箱中 37℃

培养 30 min后，将其上清液轻轻吸弃。收取贴壁纯化

的巨噬细胞，并调整细胞浓度为1 × 106个/mL 备用。

台盼蓝染色观察细胞活性(活细胞率 > 95%)和小鼠巨

噬细胞标志 F4/80 抗体(BD Bioscience)染色及流式细

胞仪鉴定巨噬细胞纯度(阳性率 > 95 %)。

2.3. 硫胶质诱导的化学性腹膜炎

采用 1 mL 无菌的 3%硫胶质(Thioglycollate; TG)

腹腔注射入小鼠诱导化学性腹膜炎，3天后，常规腹

腔灌洗，获得巨噬细胞，混匀后用台盼蓝染色(活性率 >

95%)和计数。小鼠巨噬细胞标志 F4/80 抗体染色进行

流式细胞仪鉴定巨噬细胞纯度(阳性率 > 95% )。调整

活细胞数至 1 × 106个/mL，备用。

2.4. RAW264.7 培养

RAW264.7 巨噬细胞系进行常规培养在预先用 2%

明胶(eBioscience)处理的 24孔板(Costar)中。实验前，

收取贴壁的 RAW264.7 巨噬细胞，离心收集在 15 ml

离心管中。采用台盼蓝染色和计数，调整活细胞数至

1 × 106个/mL，备用。

2.5. 大肠杆菌标记

将带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的质粒(pGFPuv)

转入大肠杆菌，氨苄抗性筛选得到绿色标记的细菌

(DH5α-pGFPuv)，细菌培养平板上保存。实验前，从

培养平板上挑取一个单菌落接种于 5 ml LB(Luria-

Bertani)液体培养基(胰蛋白胨 10 g/L；酵母提取物 5

g/L 和氯化钠 10 g/L)的试管中，37℃振荡培养 3~4 小

时。采用分光光度计测定细菌 OD 值，调整细菌浓度

为109 CFU/mL，备用。

2.6. 流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬百分率

将巨噬细胞和细菌按照一定比例混合培养，观察

巨噬细胞对细菌的吞噬效应。为检测其吞噬效应，将

培养板中待检孔上清液收集，离心并进行菌落培养和

计数。同时，用冷 PBS 收取巨噬细胞，加入抗-鼠FcγR

抗体 CD16/32(2.4 G2; BD Bioscience)以阻断非特异染

色后，在流式测定管中加入 1 × 106个细胞与藻红蛋白

荧光素(PE)-抗-鼠F4/80 单克隆抗体(BD Bioscience)，

4℃孵育 30 min。冷 PBS 洗2次，上机检测。在流式

细胞仪(BD Biosciences)的散点图上根据前向角

(forward scatter, FS)与侧向散射角(side scatter, SS)两

个参数圈定巨噬细胞群并排除细胞碎片，FL1 通道检

测绿色荧光 GFP，FL2 通道检测红色荧光。应用红色

荧光和绿色荧光双阳性细胞占总巨噬细胞(红荧光单

阳性 + 红荧光和绿荧光双阳性)的百分数来计算其吞

噬百分率。其中巨噬细胞未吞噬 E. coli 组作为对照实

验组，而吞噬 E. coli 组作为实验组。

2.7. 统计学分析

实验数据均用均数 ± 标准差表示，采用 SPSS

11.0 统计软件包进行检验分析。学生的非配对 t检验

OPEN ACCESS

流式细胞仪方法定量评价巨噬细胞非调理素吞噬能力

用来比较两组之间差异。而对于具有一个重复测量值

的单因素实验，采用单因素方差分析方法。P值小于

0.05 被认为具有统计学显著性差异。

3. 结果

3.1. 巨噬细胞对细菌吞噬的时程变化

将RAW264.7 巨噬细胞与标记了GFP 的E. coli

共同孵育不同时间后，应用PE-F4/80 抗体标记巨噬细

胞。用流式细胞仪定量检测 RAW264.7 巨噬细胞吞噬

GFP-E. coli 的情况。对照组检测巨噬细胞未吞噬GFP-

E. coli 情况(图1(a)-(b))。如图1所示，RAW264.7 部

分巨噬细胞吞噬 GFP-E. coli，在 30 min 时阳性吞噬百

分率明显增加，而后下降，但仍可以通过流式细胞仪

检测到，证明巨噬细胞对 E. coli 具有明显吞噬效应。

3.2. 巨噬细胞对细菌吞噬的量效变化

将RAW264.7 巨噬细胞与不同剂量的 GFP 标记

E. coli 共同孵育 30 min 后，应用PE-F4/80 抗体标记

巨噬细胞。用流式细胞仪定量检测 RAW264.7 巨噬细

胞吞噬 GFP-E. coli 的情况。如图1(c)所示，流式细胞

检测显示 RAW264.7 巨噬细胞可以明显吞噬 E. coli，

而且与 5 × 108 CFU 细菌共孵育后，巨噬细胞吞噬细

菌的阳性百分率明显增加，且高于 1 × 108 CFU 组的

阳性百分率，具有明显的剂量依赖性变化效应。

3.3. 定居与浸润的巨噬细胞对细菌吞噬的效应

进一步，分离小鼠腹腔定居的巨噬细胞和 3%硫

胶质诱导的化学性腹膜炎腹腔炎症浸润的巨噬细胞，

并观察定居巨噬细胞与炎症浸润巨噬细胞对 E. coli吞

噬的变化规律。5 × 108 CFU 的E. coli 与巨噬细胞共孵

育30 min后，取培养上清菌液进行菌培养，其菌落生

长情况和细菌数被显示(图2(a))，吞噬后定居巨噬细

Figure 1. Time-courses and dose-effects of macrophage phagocyto-

sis on E. coli. (a). Phagocytosis of R AW264.7 on E. coli measured

by flow cytometry; (b). Time-course effects of macrophage phago-

cytosis on E. coli; (c). Dose-effects of macrophage phagocytosis on

E. coli

图1. 巨噬细胞对细菌E. coli吞噬的时程和量效变化 (a) 流式细胞

仪检测RAW264.7对E. coli的吞噬；(b) RAW264.7对E. coli吞噬效

应时程变化规律；(c) RAW264.7对E. coli吞噬效应的量效变化规律

Figure 2. Phagocytosis effects of peritoneal resident macrophages (PEMs; resident) and thioglycollate-induced macrophages (TEM) on E. coli.

(a). Following the phagocytosis of macrophages to E. coli in the culture plate, the supernatants were harvested and bacterial were counted;

(b). And, the phagocytosis of PEMs and TEMs on E. coli was detected by flow cytometry and results were summarized

图2. 腹腔定居巨噬细胞和硫胶质诱导的腹腔炎症浸润巨噬细胞对细菌(E. coli)的吞噬效应 (a) 在培养板中观察巨噬细胞对细菌的吞噬效应，

吞噬完成后，培养上清中未被吞噬的细菌涂板进行细菌计数；(b)流式细胞仪定量检测PEMs和TEMs对细菌的吞噬情况

OPEN ACCESS 3

流式细胞仪方法定量评价巨噬细胞非调理素吞噬能力

胞吞噬组存活细菌数明显多于炎性巨噬细胞吞噬组，

提示炎性巨噬细胞比定居巨噬细胞可能有更高的吞

噬效应。

结果一致，在细菌与巨噬细胞共孵育后，采用流

式细胞仪定量检测巨噬细胞吞噬E. coli 的情况。结果

显示，吞噬细菌的定居巨噬细胞百分率明显低于吞噬

细菌的炎性浸润巨噬细胞百分率(图2(b))。这表明，

炎性巨噬细胞确实比定居巨噬细胞具有更高的吞噬

效应。综合上述结果提示，炎性巨噬细胞在炎症部位

集聚，对最终解决炎症可能起到至关重要的作用。同

时，也表明采用流式细胞仪方法可以更精确定量巨噬

细胞的吞噬能力，从而定量反映其抗细菌感染能力。

4. 讨论

单核巨噬细胞系统是机体的主要防御系统之一，

具有非调理素依赖的和抗体及补体等调理素依赖的

吞噬细菌或异物的吞噬清除功能[4-6]。E. coli 常被作为

经典的吞噬功能检测物，并通过检查巨噬细胞对E.

coli 的吞噬能力和速率来检测该系统的功能[7,8]。应用

预先荧光标记的E. coli或其他细菌结合流式细胞仪方

法可以检测巨噬细胞吞噬能力强弱和比较巨噬细胞

不同亚群的吞噬效应，以评价机体单核巨噬细胞系统

的功能[9]。同时结合未被吞噬的细菌计数等方法，可

以间接反映巨噬细胞对细菌吞噬能力变化。传统的巨

噬细胞吞噬能力评价是采用 Gimesa 染色，光镜下观

察巨噬细胞吞噬细菌的情况，并在镜下计数获得巨噬

细胞对细菌的吞噬指数[8]。流式细胞仪检测和传统方

法相比其优点是可以定量检测巨噬细胞吞噬率，较之

传统 Gimesa 染色检测吞噬指数等方法更敏感。由于

流式细胞仪属于高精度仪器，价格昂贵，可能在一定

程度上限制了该方法的广泛应用，但是对于基础科学

研究和重要病理过程巨噬细胞功能评价将大有助益。

将多染色流式细胞仪技术进一步应用于此项检测，可

以同时进行巨噬细胞多个亚群吞噬能力的测定与功

能比较，其优越性将进一步提高。

项目基金

国家自然科学基金项目(No. 31171407；81273201)、

上海市科委基础研究重点项目(No.12JC1400900)和上

海市教委重点项目(No.14ZZ00 9)。

参考文献 (References)

[1] Yamamoto, M., Okuyama, M., Ma, J., Kimura, T., Kamiyama,

N., Saiga, H., et al. (2012) A cluster of interferon-gamma-in-

ducible p65 GTPases plays a critical role in host defen se against

Toxoplasma gondii. Immunity, 37, 302-313.

[2] Potian, J., Rafi, W., Bhatt, K., Mcbride, A., Gause, W. and Sal-

game, P. (2012) Preexisting helminth infection induces inhibi-

tion of innate pulmonary anti-tuberculosis defense by engaging

the IL-4 receptor pathway. The Journal of Experimental Medi-

cine, 208, 1863-1874.

[3] Cramer, R., Rivera, A and Hohl, T. (2011) Immune responses

against Aspergillus fumigatus: What have we learned? Current

Opinion in Infectious Diseases, 24, 315-322.

[4] Kim, B., Shenoy, A., Kumar, P., Das, R, Tiwari, S. and Mac-

micking, J. (2012) A family of IFN-gamma-inducible 65-kD

GTPases protects against bacterial infection. Science, 332, 717-

721.

[5] Jantsch, J., Chikkaballi, D. and Hensel, M. (2011) Cellular as-

pects of immunity to intracellula r Salmonella enterica. Immuno-

logical Reviews, 240, 185-195.

[6] Akira, S., Misawa, T., Satoh, T. and Saitoh, T. (2013) Macro-

phages control innate inflammation. Diabetes, Obesity and Me-

tabolism, 15, 10-18.

[7] Liu, G., Ma, H., Jiang , L., Peng, J. and Zhao, Y. (2007) The im-

munity of splenic and peritoneal F4/80(+) resid ent macrophages

in mouse mixed allogeneic chimeras. Journal of molecular

medicine, 85, 1125-1135.

[8] Dai, W., Kohler, G. and Brombacher, F. (1997) Both innate and

acquired immunity to Listeria monocytogenes infection are in-

creased in IL-10-deficient mice. The Journal of Immunology,

158, 2259-2267.

[9] Bourgeois, C., Majer, O., Frohner, I., Lesiak-Markowicz, I.,

Hildering, K., Glaser, W., et al. (2010) Conventional dendritic

cells mount a type I IFN respo n se ag ains t Can did a sp p. requiring

novel phagosomal TLR7-mediated IFN-beta signaling. The

Journal of Immunology, 186, 3104-3112.

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