优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探 Pre-Study on the Molecular Mechanism of Self-Compatibility in Longtanzhenzhuli

doi:10.12677/HJAS.2012.23009

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Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2012, 2, 49-57

http://dx.doi.org/10.12677/hjas.2012.23009 Published Online September 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjas.html)

Pre-Study on the Molecular Mechanism of

Self-Compatibility in Longtanzhenzhuli

Yanping Ye1*, Shaoxi Huang2, Liping Meng1

1College of Agriculture, Guangxi University, Nanning

2College of Agricultural Sciences in Guangxi, Nanning

Email: *yeyanping0705@tom.com

Received: May 25th, 2012; revised: Jul. 18th, 2012; accepted: Aug. 6th, 2012

Abstract: Longtanzhenzhuli which is a new variety of plum with high quality were used as the experimental

materials in this research. A specific primer was designed based on the conserved sequences of plum (Prunus

salicina Lindl.) S-Rn ase(S) genes, two specific fragments were isolated from Longtanzhenzhuli genome DNA

with tese specific primers. The sequencing results showed that these fragments were confirmed as the plum S

genes. One was first cloned from Prunus salicina and named PsS-RNase-28, with length of 727 bp,

containing 367 bp intron and 360 bp Exton. Comparing with Prunus spinosa S-RNase S1 gene (EF636467.1),

it showed high identity (98%), more than 79% with other plums S-RNase genes. The other fragment with 718

bp in length, containing 343 bp intron and 375 bp Exton, showed high identity (99%) with Prunus salicina

PsS-RNase-h gene (AB084148.1), and more than 85% with other plums S-RNase genes. And sequences

follow-up analysis of these fragments would be benefited to study on the mechanism of self-compatibility of

Longtanzhenzhuli.

Keywords: Longtanzhenzhuli; Self-Incompatibility; Self-Compatibility; S-Rnase Genes

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

叶燕萍 1*，黄绍西 2，孟丽萍 1

1广西大学农学院，南宁

2广西农业科学院园艺研究所，南宁

Email: *yeyanping0705@tom.com

收稿日期：2012 年5月25 日；修回日期：2012 年7月18 日；录用日期：2012 年8月6日

摘要：本研究主要以广西本地生长的优质的具自花结实李品种龙滩珍珠李为材料，根据李属雌蕊

S-RNase 基因的序列信息设计了一对特异性保守引物，对龙滩珍珠李基因组 DNA 进行 PCR 扩增，并

对扩增产物进行克隆、测序以及序列分析，成功克隆出两个S-RNase 基因片段，其中一个为在中国李

中首次发现并命名为 PsS-RNase-28，大小为 727 bp，其中包含有 367 bp的内含子，仅有 360 bp的外

显子编码序列，与黑刺李(Prunus spinosa)S-RNase S1基因( EF636467.1)同源率达到 98%，与其它李 S-

RNase 基因的同源率都达到 79%以上。另一个扩增片段大小为718 bp，包含有 343 bp 的内含子，其中

仅有 375 bp的外显子编码序列，与中国李(Prunus salicina)PsS-RNase-h基因(AB084148.1)相似性达到

99%，与其它李 S-RNase 基因的相似性都达到 85%以上。这两个基因片段的获得及其后续分析有利于

进一步探讨龙滩珍珠李自花结实的分子机理。

关键词：龙滩珍珠李；自交不亲和；自花结实；S-RNase(S)基因

*通讯作者。

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

1. 引言

蔷薇科果树如苹果、梨、杏、甜樱桃、李、扁桃、

梅等树种的大部分品种存在典型的配子体型自交不

亲和性。因此，生产上必须配置授粉树、虫媒授粉或

人工授粉以保证主栽品种获得较高的产量，这增加了

生产成本和难度，还浪费有限的土地资源。因而弄清

自交不亲和性的分子机理，鉴定果树品种的 S基因型，

寻找或创造果树自交亲和性材料，以达到简化栽培方

式、降低果园生产成本、获得更高的经济效益的目的。

也正因为如此，对于果树自交不亲和的克服及其分子

机制的研究，成为当今研究的热点。陈迪新等[1]在不

同花龄，对“丰水”和“菊水”2个梨品种进行自花

授粉，发现蕾期授粉和延迟授粉都能显著提高它们自

花授粉的坐果率。李晓等[2,3]研究表明，甜樱桃自交不

亲和程度与其雌蕊的发育状态密切相关，蕾期授粉和

延迟授粉都能够在一定程度上克服甜樱桃的自交不

亲和性，但蕾期授粉的作用更加明显。蕾期或延迟授

粉克服自交不亲和的原因在于S-RNase 在开花之前才

大量形成，开花后S-RNase 的含量下降，花蕾中未成

熟的雌蕊不存在S-RNase 或其含量极少，不具备开花

当天花朵的那种有效抑制花粉管伸长的能力。另外，

在各种自然或人为诱导条件下，自交不亲和性植物也

会因 S基因发生突变丧失花粉或者花柱特异性识别，

进而表现自交亲和性。吴华清等[4]研究表明，“奥嗄二

十世纪”基因组中存在S-RNase-4基因，但不能遗传

给后代。Tao 等[5] 发现果梅品种“Benissashi”和

“Kensaki”也表现自交亲和性，Ushijima 等[6]进一步

研究发现这 2个品种都含有发生突变了的 SFB基因

(SFBf)，该基因的编码区插入了约 6.8 kbp 的核苷酸序

列，导致 SFBf 的转录提前终止，从而使得携带该基

因的花粉不能被Sf-RNase 识别和抑制，最后表现自交

亲和性，属于花粉突变体。Vilanova 等[7]研究认为杏

品种 Canino自交亲和的原因是该品种的花粉 S基因

SFBc 发生了突变，即编码区插入了 358 bp的核苷酸

残基。吴华清等[8]以“黄花梨”及其芽变品种“大果

黄花”为材料，研究表明，黄花和大果黄花是基于

S-RNase基因的 S基因型，发现两者均含有S-RNase-1

和S-RNase-2基因；而且两品种的这 1对雌蕊S-RNase

基因均特异性地在花柱中表达，表达量没有明显差

异，表明“大果黄花”和“黄花”的雌蕊S-RNase 基

因并无差异。由此他们推断：大果黄花的自交亲和性

突变，是由于花粉自交不亲和性功能丧失，从而表现

出自花授粉能够结实。配子体型自交不亲和性的二倍

体物种多倍体化会导致自交亲和，如人工诱导染色体

数目变异可以克服配子体型自交不亲和性。Entani等

[9]将自交不亲和的矮牵牛(Petunia hyrbida)PB 切段浸

泡在 0.02%的秋水仙素，过夜，然后生根，获得了自

交亲和的四倍体PF。转基因方法创制自交亲和性品种

具有可行性，通过转入额外的 S基因培育果树的自交

亲和品种，也可通过基因沉默的方式调节S-RNase 的

表达量而产生自交亲和现象。Broothaerts 等[10]对苹果

品种“早捷”(Elstar)进行转基因操作，转入了 35S 启

动子基因片段使花柱中的 S-RNase 基因发生基因沉

默，花柱中没有S-RNase 的产生，从而获得自交亲和

性植株。

近年来，随着分子生物学技术的发展及各方面研

究的深入，自交不亲和性的分子机理研究取得了许多

突破性进展，极大地丰富了果树配子体型自交不亲和

性机理的学术理论[4-10]。目前国际上研究较多的和已

鉴定出 S基因型的果树树种有苹果、甜樱桃、杏和梨

4种，对于李的自交不亲和性和 S基因型的研究已有

一些进展，黄绍西(2009)采用李属雌蕊S-RNase 基因

特异性保守引物进行 PCR 和RT-PCR，并对扩增产物

进行克隆、测序和序列比对，在中国的 10 个传统李

品种中获得了 8个符合雌蕊 S特异性识别决定因子必

要条件的新基因，同时鉴定了中国李 25 个品种的

S-RNases基因型。在中国的传统李品种中鉴定出了更

丰富的 S-RNase 基因多态性。并且认为中国李

S-RNase-h在所研究样本中表现最高的基因频率，预

示着该基因可能与某些优良农艺性状有连锁关系。龙

滩珍珠李是广西科研单位与当地农民合作 10 年选育

出来的优质李新品种，树势生长旺，可自花结实，不

需要授粉树，适应性强，没有病虫害，产量高，对土

壤条件要求不高，在较为贫瘠的地段生长结果良好，

抗寒性也较好，是中国李中少有的能自花结实品质优

良的李品种。而对于像广西龙滩珍珠李能够自花结实

品质优良这样特殊的李品种S基因型的研究未见报

道。研究和鉴定龙滩珍珠李的S基因型，研究其如何

克服自交不亲和现象，从分子生物学的角度分析其自

交亲和的机理。龙滩珍珠李S基因型的鉴定，对于李

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

品种的遗传改良和栽培利用具有一定的指导意义，也

为丰富 S基因的遗传信息，深入开展自交不亲和遗传

机制提供实验支持。

2. 材料与方法

2.1. 龙滩珍珠李 S基因的克隆和 S基因型的鉴定

2.1.1. 龙滩珍珠李总 DNA 的提取

本实验采用较适合于李叶片基因组 DNA提取的

改良 CTAB法，具体步骤如下：

1) 取约0.3~0.5 g新鲜叶片，剪成 5 mm2左右大

小放入研钵中，再加入少量液氮迅速研磨。加入 3或

4次液氮反复研磨，直至磨碎成细粉末状为止。

2) 将样品粉末装入1.5 ml离心管中，加 800 μl

CTAB 缓冲液(含2% PVP)，24 μl β-巯基乙醇。

3) 混匀后置 65℃水浴中 30 min，每隔 10 min 摇

匀一次。

4) 水浴后将样品在 12,000 rpm 离心5 min。

5) 吸取上清，加等体积的 CI(氯仿:异戊醇 =

24:1)，混匀后于摇床上摇匀15 min，10,000 rpm 离心

10 min。

6) 吸取上清，加等体积的PCI( 苯酚:氯仿:异戊醇

= 25:4:1)，上下颠倒混匀，12,000 rpm 离心 10 min。

7) 吸取上清后再次加等体积的 CI 抽提，12,000

rpm 离心 10 min。

8) 吸取上清加2倍体积无水乙醇，1/10 体积的

NaAc，沉淀 DNA。

9) –20℃静置 30 min。12,000 rpm离心 15 min，

用70%乙醇漂洗沉淀2~3 次，室温下风干至无乙醇味

时(30 min 左右)加500 ml 无菌水溶解。

10) 加10 mg/ml 的Rnase A(天根公司)1 μl，37℃

水浴 1 h。

11) 等体积的 CI 抽提，吸取上清加入 1/10 体积

的NaAc 和2倍体积无水乙醇沉淀 DNA，于–20℃静

置30 min。

12) 12,000 rpm离心 15 min，沉淀用 70%乙醇洗

2~3 次，室温干燥，溶解于适量无菌水中(20~50 μl)。

13) 取2 μl样品在 0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，电

压100 V，30 min后结束电泳，将凝胶转移到溴化乙

锭溶液中染色 5 min，紫外检测并拍照，观察主带是

否清晰，有无降解，是否含有RNA。

14) 取2 μl DNA 溶液加纯水稀释至 400 μl，紫外

分光光度计测定，波长 200~300 nm。根据 OD260/OD280

估计其纯度，根据以下公式计算 DNA的浓度。并用

无菌水调节 DNA浓度为 50~100 ng/μl。

DNA 的质量浓度＝ 50 × OD260 × 稀释倍数(单

位：mg/ ml ) 。

2.1.2. 引物设计

蔷薇科李属 S-RNase 具有以下结构特点(图1)，与

其他蔷薇科 S-RNase一样，具有 5个保守区(C1-C5)

和一个高变区RHV(或HV)，第一个内含子位于信号

肽和 C1 区之间，第二个内含子位于高变区，而高变

区(RHV)则位于C2 和C3之间。

根据蔷薇科李属 S-RNase 结构特点，分别在C2

上游区设计引物

Pru-C2(TGGCCAAGTAATTATTCAAACCC) ，在 C5

下游区设计引物

Pru-C5(CAAAATACCACTTCATGTAACAAC) ，用这

对引物对龙滩珍珠李基因组DNA 进行PCR 扩增。

2.1.3. S-等位基因 PCR 扩增反应体系和反应条件

用引物 Pru-C2与Pru-C5 对龙滩珍珠李的基因组

DNA 进行扩增，其反应体系如下：

Template DNA 1.0 μl

10 × PCR Buffer 2.5 μl

MgCl2 (25 mmol/L) 2.5 μl

dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2.5 μl

Primer 1: Pru-C2 (2.5 mmol/L) 0.625 μl

Primer 2: Pru-C5 (2.5 mmol/L) 0.625 μl

Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.2 μl

ddH2O 15 μl

Total volume 25 μl

反应程序如下：

Step 1 94℃ 3 min

Step 2 94℃ 30 s

Step 3 56℃ 45 s 35 cycles

Step 4 72℃ 1 min 30 s

Step 5 72℃ 10 min

Step 6 4℃ END

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

Figure 1. The structure of Prunus S-RNase

图1. 李属S-RNase 结构示意图

2.1.4. 凝胶上回收特异性 DNA 目的片段

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得 1

条特异性条带。采用 UNIQ-10柱离心式 DNA 胶回收

试剂盒(上海生工)来回收此条带。操作步骤如下：

1) 用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA 片段与其他

DNA 尽可能分开，然后用干净的手术刀割下所要的

DNA 琼脂块，放入 1.5 ml 离心管中。

2) 按每100 mg琼脂糖凝胶加入 400 μl Binding

Buffer，置于 50℃~60℃水浴中 10 min，使胶彻底融

化。加热融胶时，每 2 min 混匀一次。

3) 将UNIQ-5 柱放入 2 ml收集管中，将融化的

胶溶液转移到UNIQ-5 柱中，室温放置 2 min 后，8000

rpm 室温离心 1 min。

4) 取下 UNIQ-5 柱，倒掉收集管中的废液，将

UNIQ-5 柱放入原收集管中，放入 450 μl Wash

Solution，8000 rpm 室温离心1 min。

5) 重复步骤 4。

6) 去下 UNIQ-5 柱，倒掉收集管中的废液，将

UNIQ-5柱放入原收集管中，让离心管盖敞开着，

12,000 rpm 室温下离心 1 min。

7) 将UNIQ-5 柱放入一根新的 1.5 ml离心管中，

柱膜中央加入30 μl Elution Buffer 或水(pH 7.0)，室温

或37℃放置 2 min，提高 DNA的洗脱效率。

8) 12,000 rpm高速离心 1 min，离心管中的收集

液即含有回收的DNA 片段，可立即使用或保存于–20

℃备用。

2.1.5. 目的 DNA 片段与 T载体的连接

采用 PUCm-T载体(上海生工)，连接体系如下：

回收的 DNA 1 μl

PUCm-T Vector (50 ng/μl) 1 μl

10 × Buffer 1 μl

T4 DNA ligase 1 μl

ddH2O 6 μl

Total volume 10 μl

混匀后，20℃连接过夜。

2.1.6. 大肠杆菌感受态细胞的转化及阳性克隆的筛选

参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克等，1996)

并加以改进。

1) 在1.5 ml离心管中将连接产物加入到 200 μl

感受态细胞(新鲜制备或–70℃保存均可)，轻轻摇匀。

2) 将离心管在冰上放置 20 min后，放在42 ℃水

浴中热激90 s，立即把离心管放置在冰上冷却 2 min。

3) 加入 800 μl LB 液体培养基(不含 AMP)，混匀。

37℃，200 rpm 培养45~60 min。

4) 离心，去上清，将剩余的 150 ml菌液重悬后

均匀涂布于LB平板上(用蓝白斑筛选法，平板表面涂

有40 μl X-Gal，4 μl IPTG)，室温放置 2 h左右，37

℃倒置培养 16 h 以上，直至出现单菌落。

X-Gal 储液(20 ng/ml)的配制为0.02 g X-Gal溶于

1 ml 的二甲基甲酰胺，外包铝或黑纸，以防光破坏，

储于–20℃；IPTG 储液(200 ng/ml)配制为1 ml 蒸馏水

中溶解 200 mg IPTG 后，用0.22 μm滤膜过滤除菌，

装于 eppendorf管中。

2.1.7. 重组质粒的 PCR 鉴定

1) 配制200 ml LB液体培养基，121℃高压灭菌

20 min后，冷却至 55℃左右时加入 200 μl 100 μg/ml

的氨苄青霉素，混匀后分装于已灭菌的 eppendorf 管

中。

2) 待蓝白斑显色后挑取平板上的白色单菌落，放

入已冷却的LB液体培养基中，37℃，200 rpm 过夜(16

h以上)震荡培养，至饱和状态(OD600 = 4 左右)。

3) 取5 μl PCR产物用相同引物和反应条件进行

再次 PCR鉴定，反应体系如下：

菌液 1.0 μl

10 × PCR Buffer 2.5 μl

MgCl2 (25 mmol/L) 2.5 μl

dNTP (2.5 mmol/L) 2.5 μl

Primer 1 (2.5 mmol/L) 0.625 μl

Primer 2 (2.5 mmol/L) 0.625 μl

Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.2 μl

ddH2O 15 μl

Total volume 25 μl

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

4) 用1.5%的琼脂糖电泳检测是否获得目的条

带，将获得目的条带的菌液直接由上海生工测序。

2.1.8. 特异片段序列分析

序列分析采用DNAMAN软件与

http://www.bio-soft.net/sms/index.html 在线分析软件，

然后在NCBI的GenBank、DDBJ数据库与

http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw在线分析软件，进行

核苷酸序列比对。用DNAMAN 和Clustalx 1.83、

Clustalw软件进行S-RNase序列的同源分析比对。

3. 结果与分析

3.1. 龙滩珍珠李 S基因的克隆

3.1.1 龙滩珍珠李总 DNA 的提取

提取的龙滩珍珠李基因组DNAOD260/OD230 比值

大于 2.0，OD260/OD280 比值约为 1.8，质量好，产量高，

在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测中，主带清晰，无降解现

象(图2)，完全可以满足后续 PCR 扩增要求。

3.1.2. S-等位基因 PCR 扩增

本实验分别对 Taq 酶、模板 DNA、Mg2+、dNTP

和引物的使用量进行调整，以使 PCR反应体系达到最

优化，效果最佳。最终确定的最适合用量分别为：Ta q

酶1 U、模板 DNA 1 μl、Mg2+、2.5 μl、dNTP 2.5 μl、

Primer 1 0.625 μl、Primer 2 0.625 μl，共 25 μl的反应

体系。

经过反复试验对PCR 反应程序进行调整，特别是

对不同退火温度和时间以及循环数进行调整，以使

PCR 扩增效果最好。最终确定的最佳反应程序是：94

℃预变性3 min，94℃变性 30 s，56℃退火 45 s，72

℃延伸 1 min 30 s，35 个循环，72℃后延伸 10 min。

建立了最佳 PCR 反应体系和反应程序，进行 PCR

扩增，结果如图 3所示，得到 1条清晰的特异扩增

Figure 2. Genome DNA of Longtanzhenzhuli by the CTA B method

1 and 2, PCR products; Lane M, -1500 marker

Figure 3. Allele –se genes from

图3. 龙

条带，片段大小在 700 bp~00 bp 之间，接近 800 bp。

3.1.3. 凝胶上回收特异性 DNA 片段

-10 柱式 DNA

凝胶

3.1.4. 重组质粒的 PCR 鉴定

，在位置 700 bp~800 bp

对应

3.2. 龙滩珍珠李 S基因型的鉴定

龙滩珍珠李 S-RNase 基因的序列分析

数据库以及生

物软

接位点一样

(Finc

pecific PCR amplification of S-RNas

LongtanzhenzhuliLane

滩珍珠李 S基因的 PCR 扩增

本实验使用上海生工生产的 UNIQ

回收试剂盒，对目的片段进行回收纯化，如图4

所示，对电泳分离出的条带进行切割回收纯化，结果

条带较清晰，可以进行下一步实验。

如图 5电泳检测结果显示

的出现了更为清晰的条带，说明目的片段已被转

入大肠杆菌中。将出现条带的菌液送至上海生工进行

测序，测序结果为 727 bp 和718 bp，分别用 S-RNase、

S-RNase2来表示。

1) 通过 NCBI 的GenBank、DDBJ

件分析显示，珍珠 S-RNase-1片段在中国李中首次

发现并命名为 PsS-RNase-28，其中包含有 367 bp的内

含子(见图 6)，仅有 360 bp 的外显子编码序列，编码119

个氨基酸，通过 GeneBank 数据库的BLAST 同源性分

析结果表明(表1)，与黑刺李(Prunus spinosa) S-RNase

S1 基因(EF636467.1)相似性达到 98%，与其它李 S-

RNase 基因的相似性都达到 79%以上。

与大多数植物在内含子/外显子剪

ham，1994；Beuppu 等，2002)，中国李 S-RNase

基因内含子的剪切位点也具有GT/AG 保守序列，此

外，第一个剪切位点的左侧有两个相对保守的碱基

TG，第二个剪切位点的右侧第一个碱基通常为 T，附

近4个碱基富含 C。

图2. 龙滩珍珠李基因组 DNA

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

根据图 7，对中国李的 S-RNase-28和黑刺李 S-RNase-1

的DNA 序列进行比较，结果表明，前者的内含子省略

了117 bp，在编码区两者只有 4个碱基的差异。

在氨基酸序列上(图8)，中国李的 S-RNase-28 和

黑刺李的S-RNase-1两者没有区别。氨基酸序列相同，

其功能是否相同还需要进行进一步研究。

2) 龙滩珍珠李 S-RNase-2片段包含有 343 bp的内含

子(见图 9)，其中仅有 375 bp的外显子编码序列，编码

124 个氨基酸，通过GeneBank 数据库的 BLAST同源性

分析结果表明(表2)，与中国李(Prunus salicina) PsS-

RNase-h 基因(AB084148.1)同源率达到99%，与其它李

S-RNase 基因的同源率都达到 85%以上。

Figure 4. Electrophoresis detection of PCR product

M：DL-1500 marker

图4. 回收PCR 产物的电泳检测

4 讨论与结论

Figure 5. The PCR detection of plamids M: DL marker

sequence oZhenzhu plum S-RNase1(PsS-RNase-28)

Accession Description Max scoreTotal scoreQuery coverage E value Max ident

-1500

本研究采用PCR、克隆和测序的方法，在广西龙

滩珍珠李基因组DNA中获得了 2个基因片段，通过

NCBI 进行序列比对和同源性序列搜索，分析了这2

个基因片段，其中一个为在中国李中首次发现并命名

为PsS-RNase-28，与黑刺李(Prunus spinosa)S-RNase

图5. 转化菌落的 PCR鉴定

Table 1. Homology a nalysis off

表1. 龙滩珍珠李 S-RNase1(PsS-RNase-28)序列同源性分析

EF636467.1 Prunus spinosa S-locus S-Rrtial cds Nase S1 gene, pa846 1285 99% 0.0 98%

DQ677587.1 llele and 344 344 42% 4e−91 86%

Nase-9 allele and

EU833958.1 allele 318 318 41% 2e−83 85%

DQ677586.1 se-7-1 allele and 318 318 41% 2e−83 85%

DQ646488.1 and 311 311 40% 4e−81 85%

plete cds

se-3-1 allele and

l cds

2 allele and

S-locus F-box protein (SFB) gene, SFB-3-2 allele, partial cds

Prunus spinosa S-RNa s e (S-RNase) gene, S-RNase-8 a

S-locus F-box protein (SFB) gene, SFB-8 allele, partial cds

Prunus salicina gene for Sm-RNase, partial cds AB093135.1 335 335 43% 2e−88 85%

AB093134.1 Prunus salicina gene for Sl-RNase, partial cds 324 324 42% 5e−85 85%

DQ677588.1 Prunus spinosa S-RNase (S-RNase) gene, S-R

S-locus F-box protein (SFB) gene, SFB-9 allele, partial cds

Prunus spinosa S7-2 RNase (S-RNase) gene, S-RNase-S7-2

322 322 40% 2e−84 86%

and SFB (SFB) gene, SFB7-2 allele, partial cds

Prunus spinosa S-RNase (S-RNase) gene, S-RNa

S-locus F-box protein (SFB) gene, SFB-7-1 allele, partial cds

Prunus salicina haplotype Sb S-locus-F-box (SFB) gene

S-RNase(S) gene, Sb allele, partial cds

Prunus salicina gene for Sb-RNase, comAB252413.1 311 311 40% 4e−81 85%

DQ512912.1 Prunus salicina S7-RNase mRNA, partial cds 311 311 37% 4e−81 87%

DQ677584.1 Prunus spinosa S-RNase (S-RNase) gene, S-RNa

S-locus F-box protein (SFB) gene, SFB-3-1 allele, partial cds

Prunus salicina cultivar wickson Sk-RNase gene, partial cds

309 309 62% 1e−80 79%

EU113311.1 305 305 42% 2e−79 84%

AB093133.1 Prunus salicina gene for Sk-RNase, partial cds 305 305 42% 2e−79 84%

AB084143.1 Prunus salicina PS -Sb gene for Sb-RNase, partia305 305 40% 2e−79 85%

DQ677585.1 Prunus spinosa S-RNas e (S-RNase) gene, S-RNase-3- 303 303 62% 7e−79 79%

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

Figure 6. Sequence of Zhenzhu plum S-RNase1 (PsS-RNa se-28) (lineated italic small letters indicated the nucleotides of predicted intron)

图6. 龙滩珍珠李 S-RNase1(PsS-RNase-28)序列(内含子序列用划线小写字母表示)

Figure 7. Aligment between Zhenzhu plum S-RNase1(PsS-RNase-28) and Prunus spinosa S-RNase-1

图7. 龙滩珍珠李 S-RNase1(PsS-RNase-28)和黑刺李 S-RNase-1的DNA序列比较

Figure 8. Aligment of the amino acid between Zhenzhu plum S-RNase1(PsS-RNase-28) and Prunus spinosa S-RNase-1

图8. 龙滩珍珠李 S-RNase1(PsS-RNase-28)和黑刺李 S-RNase-1的氨基酸序列比较

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

Figure 9. Sequence of Zhenzhu plum S-RNase2 (lineated italic small letters indicated the nucleotides of predicted intron)

图9. 龙滩珍珠李 S-RNase 序列(含子序列用划线小写字母表示)

表2. 李S-RNase 序列同源性分析

Accession Description ore Query

coverage E value Max ident

able 2. Homology analysis of sequence of Prunus spinosa S-RNase-2

-2

Max score Total sc

APrunus salicina PSh-RNase,

partial cds

B084148.1 S-Sh gene for 1312 1312 99% 0.0 99%

DQ790374.1 Prunus salicina cultivar Friar Sh-RNase gene

partial cds

l cds

AB280793.1 381 381 41% 3e−102 89%

893 893 68% 0.0 99%

DQ790373.1 Prunus salicina cultivar Green Sun Sh-RNa s e

gene, partia883 883 67% 0.0 99%

DQ512914.1 Prunus salicina Sh-RNase mRNA, partial cds 604 696 52% −169 100%

DQ677587.1

Prunus spinosa S-RNa s e (S-RNase) gene,

S-RNase-8 allele and S-locus F-box protein

(SFB) gene, SFB-8 allele, partial cds

Prunus salicina gene for Se-RNase, complete

cds, haplotype: Se

424 424 48% 5e−115 88%

S1 基因(EF636467.1)同源率达到 98%，与其它李S-RNase

者在米曲霉(Aspergillus oryzae)中发

现和

单元型特异多态性，此外，relic S-RNase与S-RNase

具有更多的相似性，比如在花柱中特异性地表达。

白，

进化

的研

PCR 的方法在别的物种中寻找 S-RNase的同源基因，

基因的同源率都达到 79%以上。另一个扩增片段与中

国李(Prunus salicina)PsS-RNase-h基因(AB084148.1 )

同源率达到 99%，与其它李S-RNase 基因的同源率都

达到 85%以上。

1988 年，研究

鉴定了T2-RNase 的序列[11]。T2 -RNase 与S-糖蛋

白具有相似的序列特征[12]。进一步研究表明，S-糖蛋

白具有体外RNase酶活性[12]。所有已知的 S-糖蛋白与

T2-RNase一样包含两个具有催化活性的组氨酸[13]。因

此，S-糖蛋白被重新命名为 S-RNase，编码该蛋白的

基因也被命名为S-RNase 基因。T2-RNase 和S-RNase

被归类并命名为T2/S-RNase 家族，该家族还包括了

S-like RNase 和relic S-RNase。relic S-RNase 和S-like

RNase 一样，广泛存在于蔷薇科、茄科和玄参科植物

中，与 S-RNase 具有序列相似性。但是它们不表现 S

比较茄科不同S-RNases氨基酸序列，发现 S-

RNases具有 5个保守区(C1、C2、C3、C4 和C5)，2个

高变区(HVa 和HVb)[13]。S-RNase属于碱性胞外糖蛋

主要分布于花柱的中上部引导组织的基质中，通

常自花花粉管生长也是在该部位受到抑制。S-RNase

分子量大约为 24-32 KD，N-端有 22~27 个氨基酸残基

组成的信号肽，C1、C4、C5 是疏水区与 S-RNase 的

高级结构有关；C2 和C3 为亲水区，各存在 1个组氨

酸残基，是 S-RNase 的活性部位；高变区 HVa和HVb

分布于 C2与C3 之间，氨基酸残基具有亲水性和多变

性，与 S-RNase 的等位基因特异性识别有关。

根据 S-RNase 的序列特征，在 5个保守区设计引

物，利用 PCR 技术，可以克隆 S-RNase 的cDNA 及其

基因组片段。这种方法对自交不亲和的种群及其

究[14]，对植物 S-基因型的鉴定尤为有用[15]。通过

优良品种龙滩珍珠李自花结实分子机理初探

可以初步认为该物种也具有 S-RNase介导的配子体型

自交不亲和性现象。比如，通过这种方法其他学者在

金鱼草植物(Antirrhinum hispanicum)克隆了 S-RNase 同

源基因的 cDNA，并发现这个物种也表现配子体自交

不亲和性。S-RNase 的系统发育分析提示不同科植物

间的配子体自交不亲和起源于共同的祖先。

虽然中国李 S-RNase-28 和黑刺李 S-RNase-1的氨

基酸序列相似性高达 100%，但前者的内含子省略了

117 bp，在编码区两者也有 4个碱基的差异。张树军

等[6]对中国李S-RNase-26与杏 S-RNase-2进行了序列

比对

的同源性，这说明

S-RN

智年博士。

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87: 732-735.

: 304-311.

分析，结果在编码区仅有 2个碱基差异，而在内

含子区域，无论长度还是碱基组成，二者差异都比较

大，两者推导的氨基酸序列相似性达到 99%，具有相

同的高变区(RHV)。在甜樱桃中也报道了相似的结果。

Zisovich 等[16]在西洋梨(Pyrus communis)上更进一步

的证明了具有相同高变区(RHV) 的S-RNase-i 和

S-RNase-n基因具有不同的等位基因特异性识别。因

此，即使是氨基酸序列相似性高达 100%，其功能是

否一样还需要进一步的研究。

龙滩珍珠李具有自花结实而且品质优良，本研究

成功克隆得到的两个基因片段中，一个为曾被报道过

的中国李S-RNas e-h，另一个新基因与曾被报道过的

李属其它S-RNases 基因有高度

ases 氨基酸序列中从C2 到C5 的区域是正常的，

导致其自花结实的原因很可能在于 C1之前或 C5 之后

的区域出现了不同于其他李品种的变化，产生了变

异，具体原因有待于进一步研究。

6. 致谢

感谢广西农科院作物遗传改良生物技术重点实

验室及魏源文博士、黄诚梅博士、邓

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