 Bioprocess 生物过程, 2011, 1, 18-21 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2011.12005 Published Online December 2011 (http://www.hanspub.org/journal/bp/) Copyright © 2011 Hanspub Bp Effect of Light Intensity on Growth Rate and Accumulation of Organics of Nannochloropsis oculata Droop Xiaofeng Du, Ning Zou, Donghong Sun, Lin Chang, Ping Zhao College of Life Sciences, Ludong University, Yantai Email: efeng000999@163.com; ningzou76@126.com Received: Sep. 13th, 2011; revised: Oct. 27th, 2011; accepted: Nov. 14th, 2011. Abstract: Influence of light intensities on growth rate and organics contents of Nannochloropsis oculata was studied. The results showed that the light intensity within 1000 lx and 10,000 lx, the specific growth rate, so- luble protein, and carotenoids contents increased at first and reached the maximum under 5000 lx, then de- creaded under 10,000 lx, the maximums are 0.101%, 3.8% and 0.8%. The maximal cell density increased with the increase of light intensity, the maximum is 6.52 × 107 mL –1. Polysaccharide and lipid contents increased and reached the maximum under 2000 lx, then decreased with the increase of light intensity, the maximums are 3.17% and 36.95%. Chlorophyll content decreased with increase of light intensity, the maximum is 0.35%. Keywords: Nannoc hl oropsis ocul at a Droop; Light Intesity; Specific Growth Rate; Organics n 光照强度对微绿球藻生长及有机质积累的影响 杜晓凤，邹 宁，孙东红，常 林，赵 萍 鲁东大学生命科学学院，烟台 Email: efeng000999@163.com; ningzou76@126.com 收稿日期：2011 年9月13 日；修回日期：2011 年10 月27 日；录用日期：2011 年11 月14 日 摘 要：本文以微绿球藻(Nannochloropsis oculata Droop)为材料，在室内研究了光照强度对藻细胞生长 及细胞内几种有机物质含量的影响。结果表明，在 1000 lx~10,000 lx的光强范围内，比生长速率、可 溶性蛋白、类胡萝卜素的含量随光照强度的增加而增加，在 5000 lx 时达到最高，最高值分别为0.101%、 3.8%、0.8%，在 10,000 lx 时反而降低；最高细胞密度随光照强度的增强而增大，10,000 lx 时达到最高， 为6.52 × 107 mL–1；多糖、总脂含量随光照强度的增加而增加，在 2000 lx 时达到最高，最高值分别为 3.17%、36.95%，在 10,000 lx 时又降低；叶绿素的含量随光照强度的增强而减小，1000 lx 时最高，为 0.35%。 关键词：微绿球藻；光照强度；比生长速率；有机物质 1. 引言 微绿球藻也称眼点拟微球藻，是一种海洋单细胞 微藻，具有繁殖迅速、易培养、营养丰富等特点，细 胞球形或椭球形，直径 2 µm~4 µm[1]。该藻含有的 PUFA 是海水仔鱼、虾蟹贝等幼体的必需脂肪酸，能 够提高海产动物生长率和幼体的存活率[2,3]，其中 EPA 含量丰富，是生产高纯度 EPA 产品的极好原料， 国际上已经用作健康食品和药品[4]，加上其细胞壁极 薄，易于消化吸收，在水产养殖及生物活性物质提取 方面具有重要的经济价值[5]，PUFA对人体也有非常 重要的作用，可防治多种心血管疾病，促进儿童智力 及心理发育；该藻油脂含量丰富，在生物能源方面具 有广阔的应用前景，油脂含量占干重的31%~68%[6]， 魏东测得其总脂含量在稳定期达到最高，为干重的 43.3%[7]。微绿球藻无论在水产养殖、保健品开发， 还是生物能源方面，都具有广阔的开发前景。 光在水中以指数形式衰减，所以光照强度可以成 为影响藻类生长的因素之一，在一定的 pH、温度和 营养条件下，光照强度影响着光合作用产物的多少， 从而影响藻类的生长和细胞浓度[8]。光照强度对微绿 球藻生长、色素、总脂、脂肪酸组成的影响等方面已 有一些研究[3,9-13]，但除了对脂肪酸组成的影响方面  杜晓凤 等光照强度对微绿球藻生长及有机质积累的影响 | 19 研究较深入外，其他方面都不够全面深入，且对可溶 性蛋白、多糖的研究较少，本实验研究了光照强度对 微绿球藻多方面的影响，研究较全面。 本文采用气升式光生物反应器对微绿球藻进行 高密度培养，研究其在不同光照强度下的生长状况及 有机质含量，为光照强度对微绿球藻的影响提供补充 资料，也为该藻的工业化大规模培养及营养物质开发 利用提供一定的参考价值。 2. 材料与方法 2.1. 材料 微绿球藻(Nannochloropsis oculata Droop)藻种由 鲁东大学生命科学学院藻类研究所提供。 2.2. 培养方法及培养条件 采用气升式光生物反应器，光径5 cm，容量 10 L， 反应器底部安装由玻璃条固定的多孔通气管，向反应 器内通入空气。培养所用海水为自然海水，过滤灭菌 后使用，培养基配方参见邹宁等(2005)[14]。在完全相 同的光生物反应器中同时接入相同的藻种，控制接入 后的藻种密度相同或接近，在相同的条件下培养。培 养基的初始 pH 为8.0，温度为 23˚C~26˚C，设置 1000 lx、2000 lx、5000 lx、10,000 lx4 个光照强度梯度，每 个光照强度 3个平行，光周期为 L10:D14，通气时间 为24 h。 2.3. 实验方法 2.3.1. 生长测定方法 每天定时取样，每个反应器内取 3个样品，用血 球计数板计数细胞密度，用紫外分光光度计测定吸光 值。生长计算公式为：比生长速率 211 μln Nln Ntt 2 [15]。 2.3.2. 微藻采收 采收处于稳定期的藻液，用大型离心机离心，3000 r/min 离心 30 min，藻泥用去离子水洗 2~3 次，于电热 鼓风干燥箱中 65˚C烘干至恒重。将烘干的藻粉置于干 燥皿中待用。 2.3.3. 多糖含量的测定 准确称取 0.15 ± 0.01 g藻粉于 5 mL 离心管中，加 入2 mL 蒸馏水，在快速混匀器上混匀后，置于–20˚C 冰箱中反复冻融三次，再加入 2 mL蒸馏水，离心收 集上清；残渣加适量蒸馏水，于沸水浴中加热 3 h，离 心收集上清。合并上清液并定容到50 mL，每组采用 三个平行。采用蒽酮法测定多糖的含量[16]。 2.3.4. 可溶性蛋白含量的测定 准确称取 0.15 ± 0.01 g藻粉于 5 mL 离心管中，加 入2 mL 蒸馏水，在混匀器上混匀后，置于–20˚C冰箱 中反复冻融三次，再加入 2 mL蒸馏水，离心收集上 清，残渣加适量蒸馏水重复离心，合并上清液，定容 到50 mL，每组采用三个平行。采用考马斯亮蓝法测 定蛋白含量[17]。 2.3.5. 叶绿素含量的测定 准确称取 0.15 ± 0.01 g藻粉于具塞试管中，加入 1 mL 蒸馏水，在混匀器上混匀后，置于–20˚C冰箱中 反复冻融三次。加入 5 mL 80%的丙酮，混匀后置于 4˚C冰箱内提取 3 h 以上，上清倒入 5 mL 离心管中离 心，取上清；残渣倒入原试管中，再加 5 mL 80%丙酮 提取 3 h以上，离心合并上清，于 25 mL容量瓶中定 容。用 Arnon 法测定色素含量[18]。 2.3.6. 总脂含量的测定 准确称取 0.15 ± 0.01 g藻粉于具塞试管中，加入 1 mL 蒸馏水，在混匀器上混匀后，置于–20˚C冰箱中 反复冻融三次。加入 5 mL 工业酒精，混匀后在室温下 提取 3 h，6000 rpm离心 5 min，收集上清于恒重的称 量瓶中，残渣返回试管内重复提取 2次，合并上清，将 上清于旋转蒸发仪中去除提取剂，称重，计算总脂含量。 2.3.7. 数据的处理 实验所得数据用 SPSS 16.0 软件进行处理。 3. 结果分析 3.1. 光照强度对微绿球藻生长的影响 采用光生物反应器，对微绿球藻进行高密度培 养，通过实验得出光照强度对微绿球藻比生长速率μ 及最高细胞密度的影响如表1。 实验结果表明，微绿球藻在 1000 lx~10,000 lx 的光强范围内均能生长，且延滞期短，1000 lx和2000 lx 光强下第四天开始快速生长，5000 lx和10,000 lx 光强下第三天即开始快速生长，可知微绿球藻喜强 光，且适光范围较广。 Copyright © 2011 Hanspub Bp  杜晓凤 等 | 光照强度对微绿球藻生长及有机质积累的影响 Copyright © 2011 Hanspub Bp 20 Table 1. Effects of light intensities on the specific growth rate and maximal cell density of N. oculata 表1. 光照强度对微绿球藻比生长速率 μ及最高细胞密度的影响 光照强度(lx)Light intensity 1000 2000 5000 10,000 比生长速率 μ Specific growth rate 0.082 ± 0.001528 A 0.084 ± 0.001155 A 0.101 ± 0.001732 B 0.093 ± 0.001000 C 最高细胞密度(× 107mL–1) Maximal cell density 3.680 ± 0.02646 A 3.920 ± 0.03215 B 6.125 ± 0.04359 C 6.520 ± 0.06351 D 单位面积产量(g·m–2·d–1) Yield per unit area 0.949 ± 0.013776 A 1.150 ± 0.023094 B 1.636 ± 0.005774 C 2.085 ± 0.014434 D 单位体积产量(mg·L–1·d–1) Yield per unit volume 18.895 ± 0.072169 A22.886 ± 0.077960 B32.569 ± 0.063509 C 41.512 ± 0.046188 D 注：表中同行不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p < 0.01)，以下表2同。 不同光强下微绿球藻的两种色素含量如图1。 经方差分析和多重比较，光照强度对微绿球藻 生长的影响极显著(p < 0.01)，在1000 lx~10,000 lx 光强范围内，比生长速率随光照强度的增加而增加， 在5000 lx时达到最高，为 0.101，在10,000 lx时反 而降低。强光组与弱光组间差异极显著(p < 0.01)， 说明强光可明显促进微绿球藻的生长，这与蒋霞敏 等人的研究结果一致[10,11]；最高细胞密度随光照强 度的增强而增大，10,000 lx 组最大，为6.520 × 107 m L–1、5000 lx组次之，为 6.125 × 107 m L–1，四个水 平间差异极显著(p < 0.01)。光强对单位面积产量和 单位体积产量的影响与最高细胞密度的结果一致， 最高值均在10,000 lx组，分别为2.085 g·m–2·d–1、 41.512 mg·L–1·d–1。可知弱光不利于微绿球藻生长， 培养时提供强光可增大细胞密度，提高产量。 微绿球藻细胞内的叶绿素含量随着光照强度的 增强而减少，1000 lx光强下叶绿素含量最高，为 0.3504%，与 2000 lx组差异不显著，说明弱光有利 于叶绿素的积累，10,000 lx光强下的叶绿素含量最 低，光照强度过强时，会破坏原生质，引起叶绿素 分解。微绿球藻缺乏叶绿素b[19]，叶绿素主要为叶绿 素a。类胡萝卜素在 5000 lx 光强下含量最高，为 0.8032%，极显著高于其他组，10,000 lx 时最低，这 可能是由于光照过低细胞生长慢，不利于类胡萝卜 素的积累，而光照过强又对其有破坏作用。不同光强 下微绿球藻细胞内含量最高的色素均为类胡萝卜素。 研究表明[20,21] ，光照对微绿球藻的生长和油脂 积累有着重要影响。由表2可以看出，微绿球藻 的 总脂含量随光照强度的增加而增加，在 2000 lx 时含 量最高，为 36.95%，随后随光照强度的增加而降低， 这与多糖含量的结果一致。 3.2. 光照强度对微绿球藻有机物质含量的影响 不同光照强度对微绿球藻有机物质含量的影响见 表2。 由表 2可以看出，2000 lx 和5000 lx组的可溶性 蛋白含量最高，分别为 3.6%和3.81%，各组差异极 显著。在同样的温度条件下，强光和弱光都不利于 可溶性蛋白的积累。5000 lx光照下可溶性蛋白含量 最高，这与比生长速率的结果一致，可能是由于细 胞的快速生长，积累了大量的蛋白。 0.0% 0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% 0.7% 0.8% 0.9% 100020005000 10000 光照强度（lx） light intensity 色素含量（%） pigments contents 叶绿素 类胡萝卜素 2000 lx组多糖含量最高，为3.17%，5000 lx 次 之，为 2.94%，各组间差异极显著。在同样的温度条 件下，强光和弱光都不利于多糖的积累。2000 lx光 照下多糖含量最高，可能是由于弱光下细胞生长缓 慢，多糖积累量少，而强光下细胞过快繁殖，消耗 了大量能量，使多糖积累较少。 Figure 1. Effects of light intensities on pigments contents of N. ocul ata 图1. 光照强度对微绿球藻色素含量的影响  杜晓凤 等光照强度对微绿球藻生长及有机质积累的影响 | 21 Table 2. Effects of light intensities on organics contents of N. oculata 表2. 光照强度对微绿球藻有机物质含量的影响 光照强度(lx) Light intensity 1000 2000 5000 10,000 可溶性蛋白含量(%) soluble protein 2.4 ± 0.1333 A 3.6 ± 0.2082 B 3.81 ± 0.01155 C 1.0 ± 0.01202 D 多糖含量(%) polysaccharide 1.7 ± 0.01528 A 3.17 ± 0.02082 B 2.94 ± 0.0577 C 2.02 ± 0.01528 D 叶绿素含量(%) Chlorophyll 0.35 ± 0.01000 a A 0.33 ± 0.00577 a AB0.28 ± 0.01528 b B 0.09 ± 0.01528 C 类胡萝卜素含量(%) carotenoids 0.49 ± 0.01000 A 0.50 ± 0.01528 A 0.80 ± 0.00577 B 0.33 ± 0.01000 C 总脂含量(%)lipid 30.03 ± 0.02646 A 36.95 ± 0.03606 B 30.61 ± 0.02646 C 29.28 ± 0.03000 D 4. 结论 光照强度对微绿球藻的细胞生长有非常显著的 影响，光照强度从 1000 lx到10,000 lx的范围内，随 着光照强度的增强，比生长速率先升高后下降，5000 lx 组最高，为0.101；最高细胞密度越来越高，最高 达到 6.520 × 107 mL–1，但藻液的颜色变浅变黄。说 明强光能够促进微绿球藻细胞分裂，但也能使藻细 胞快速趋向老化，这与尤珊[22]的结果一致。 光照强度对微绿球藻有机物质含量有显著的影 响，可溶性蛋白、类胡萝卜素的含量随光照强度增强 先升高后下降，5000 lx 时最高，分别为 3.8%和0.8%； 可溶性多糖、总脂含量随光照强度的增强先上升后 下降，2000 lx 时含量最高，分别为 3.17%和36.95%； 叶绿素的含量随光照强度的增强而减小，1000 lx时 最高，为 0.35%。 不同的光照强度都有其利于生长或利于有机物 质积累的优势，工业化生产时可根据不同的需求选 择不同的光照强度。 参考文献 (References) [1] 余颖, 陈必链. 微绿球藻的研究进展[J]. 海洋通报, 2005, 24(6): 75-81. 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