 Sustainable Development 可持续发展, 2012, 2, 13-21 http://dx.doi.org/10.12677/sd.2012.21003 Published Online January 2012 (http://www.hanspub.org/journal/sd) Growth Inhibition of the Three Species of Red Tide Microalgae by Extracts from Potamogeton crispus Yingyin g Sun 1, Changhai Wang2* 1Ocean School, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 2Resources and Environment Science Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing Email: syy-999@163.com, *chwang2001@sina.com Received: Oct. 24th, 2011; revised: Nov. 13th, 2011; accepted: Nov. 28th, 2011 Abstract: To study effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the growth of the three species of microalgae (Karenia mikimitoi, Skeletonema costatum and Alexandrium tamarense), the extracts were extracted with petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol and distilled water by liquid-liquid fractionaction, respectively. And yields of solvent-partitioned fractions were 38.5% petroleum ether extracts, 21.9% ethyl acetate extracts, 9.37% n-butanol extracts and 26.6% distilled water extracts, respectively. Based on the observation of algal morphology and the measurement of algal number, and the contents of physiological indicators (protein, polysaccharide and chlorophyll), the results showed the petro- leum ether extracts and ethyl acetate extracts from methanol extracts of Potamogeton crispus had the stron- gest action. The inhibitory effect of the tested microalgae by these two extracts was above 66% in day 12 at the concentration of 16 mg/L. And the petroleum ether extracts and ethyl acetate extracts caused cavities, pieces and chlorophyll decreased in cells. The further investigation found that these two extracts significantly decreased the contents of protein, polysaccharide and chlorophyll in the cells of those microalgae. But n- butanol extracts and distilled water extracts had not significant affect the growth of the all test microalgae. Keywords: Potamogeton crispus; Red Tide Microalgae; Extracts; Growth Inhibition 菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 孙颖颖 1，王长海 2* 1淮海工学院海洋学院，连云港 2南京农业大学资源与环境科学学院，南京 Email: syy-999@163.com, *chwang2001@sina.com 收稿日期：2011年10月24 日；修回日期：2011 年11月13 日；录用日期：2011 年11月28 日 摘 要：以甲醇浸泡菹草干粉 4 d，过滤、减压蒸干后，制备到菹草甲醇浸膏。此浸膏用 90%甲醇水 溶液(V/V)溶解后，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为溶剂，采用液液萃取法进一步分离。经过滤、 减压蒸干，获得 4种液液分离提取物–石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸馏水提取物，得率分别为38.5%、 21.9%、9.37%和26.6%。在此基础上，通过测定藻细胞数量，观察藻细胞形态，分析藻细胞内叶绿素、 蛋白质和多糖含量等生理指标的变化，研究了此4种液液分离提取物对米氏凯伦藻(Karenia mikimitoi)、 中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长的影响。结果表明， 石油醚和乙酸乙酯提取物能明显降低3种赤潮微藻的细胞数量。当提取物浓度为16 mg/L时，此 2种 提取物对3种赤潮微藻的生长抑制率超过 66%(第12 d)。同时，此2种提取物显著改变了3种赤潮微 藻的细胞形态，致使藻细胞出现空洞、破碎和色素明显减褪现象。并且，它们还能显著影响藻细胞内 叶绿素、蛋白质和多糖等生理指标的合成。在实验设定浓度范围内，正丁醇和蒸馏水提取物未对 3种 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 13  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 14 Copyright © 2012 Hanspub 赤潮微藻的生长产生明显的影响。 关键词：菹草；赤潮微藻；提取物；抑制作用 1. 引言 菹草(Potamogeton crispus)是眼子菜科(Potamo- getonaceae)多年生沉水草本植物，生长快，耐污性较 强，分布广泛，常与金鱼藻(Ceratophylum demersum) 和穗花狐尾藻(Myriophy llumspicatum)等伴生，在冬春 季节成为沉水植被的优势种[1]。由于菹草耐污能力较 强，关于其生态价值的研究较多，主要集中在利用菹 草去除富营养化水体中氮、磷营养盐[2,3]和控制藻类生 长[4-6]，及其对铜、锌、镉和汞等重金属的富集和对有 毒物质(如硒和苯酚)等吸收转化方面。 近年来，化感作用(化感物质)治理藻类因兼具化 学法快捷、生物法相对安全的优点，已广泛应用于淡 水藻类控制研究，但用于赤潮治理的研究较少。陈芝 兰等发现，凤眼莲根(Eichhornia crassipes)粉末及其提 取物对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)有显 著的抑制作用[7]。刘洁生等发现凤眼莲根粉末及其提 取物抑制东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的生 长[8]。通过前期研究，我们发现菹草粉末的甲醇提取 物能明显抑制某些藻类生长[9]。鉴于此，本文采用液 液萃取法(分别以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇为溶剂) 对菹草粉末的甲醇提取物进行进一步分离。通过测定 藻细胞数量，观察藻细胞形态，分析藻细胞内叶绿素、 蛋白质和多糖含量等生理指标的变化，研究了这几种 液液分离提取物对米氏凯伦藻(Karenia mi ki mi t oi )、中 肋骨条藻(Skeletonema costatum)和塔玛亚历山大藻 (Alexandrium tamarense)生长的影响，以期为利用菹草 治理赤潮微藻提供实验基础。 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻无菌 株由中国海洋大学提供，在 f/2 培养基中培养，培养 温度(20 ± 0.1)℃，光照强度 40 μmol·(m2·s)–1，光暗比 12:12。 菹草采自连云港市赣榆县郊区水体，自来水仔细 洗去泥沙和其它附着物后，再用蒸馏水漂洗处理材料 3~4 次。40˚C下烘干3 d，完全干燥后磨成粉末备用(粉 碎至 0.3 mm)。 天然海水经过脱脂棉和300 目筛绢过滤，煮沸、 冷却，pH 值和盐度分别调节至8.5和30 备用(实验所 用海水均做如上处理)。 石油醚、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇和甲醇等有机 溶剂以及硫酸、蒽酮、考马斯亮蓝、六氰合铁酸钾和 琼脂粉为分析纯，购置国药集团化学试剂有限公司； 硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等无机盐为分析纯， 购置南京化学试剂有限公司。 2.2. 菹草甲醇浸膏的制备 1.5 kg菹草粉末，置于10 L棕色瓶中，加入8 L 无水甲醇。室温(10˚C ~15˚C)黑暗浸泡4 d后，离心、 过滤，40˚C下浓缩。经 0.45 μm滤膜过滤后，减压蒸 干，获得甲醇浸膏。 2.3. 菹草甲醇浸膏的液液萃取分离 在上述实验基础上，用90%甲醇水溶液(V/V)溶 解甲醇浸膏。加入石油醚萃取3次，减压蒸干，获得 石油醚相提取物。萃余相 40˚C下除去甲醇后，补充 适量蒸馏水，并加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸干得 到乙酸乙酯相提取物。最后，加入正丁醇萃取3次， 分别获得正丁醇相提取物和蒸馏水提取物。用适量甲 醇或蒸馏水溶解上述提取物，使其浓度为200 mg/L， 经0.22 μm滤膜除去微生物，保存于 4˚C冰箱备用。 通过前期预实验，发现甲醇投加比例 < 1%对受 试微藻的生长无影响，后续投加比例均控制在此范围 内。 2.4. 菹草 4种液液分离提取物的抑藻圈实验 采用培养皿抑藻圈法[10]，检 测4种溶剂提取物对 3种赤潮微藻生长的影响。f/2培养基中加入 1.5%琼 脂制成平板(90 mm)。在平板内，铺设30 mm的圆形 滤纸片(已浸润对数生长期的 3种微藻藻液)，于滤纸 中心滴加一定量提取物。同时，以滴加相同体积的甲 醇或蒸馏水为对照组，每个培养皿设定 3个重复，置  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 于光照培养箱内培养1 d。 2.6.2. 蛋白质和多糖的测定 25 mL 藻液2000 g 转速下离心10 min，弃去上清 液。藻泥于–20˚C冻融破碎3次后，加入 3 mL PBS(磷 酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合溶液)并充分振荡，离心 10 min。上清液参照文献[12]测定可溶性蛋白质和多 糖含量(以细胞干重衡量，mg/g)。 2.5. 菹草 4种液液分离提取物的抑藻作用 分别移取相应体积的提取物到250 mL 锥形瓶，4 种提取物的终浓度依次为4 mg/L、8 mg/L、12 mg/L 和16 mg/L。随后，加入f/2培养基，将体积定容至 150 mL。同时，设定添加相同体积甲醇(或蒸馏水)的 新鲜海水配制的 f/2 培养基为对照组。米氏凯伦藻、 中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻的起始藻细胞数量分 别为 10 × 104·mL–1、18 × 104·mL–1 和7 × 104·mL–1， 培养条件同上，培养12 d。每个锥形瓶设定3个重复， 每隔一日，测定藻细胞数量。实验结束后，测定藻细 胞叶绿素、蛋白质和多糖含量，并用 Motic 显微照相 系统拍摄藻细胞形态(放大倍数为 10 × 40)。 2.7. 数据处理 实验数据采用 SPSS11.5 软件包进行独立样本检 验统计分析，P < 0.05 为显著性差异，P < 0.01 为极显 著性差异。 微藻生长抑制率， 0 I 1100%NN－，式中： N为处理组藻细胞数量，/×104·mL–1；N0为对照组藻 细胞数量，/×104·mL–1。 2.6. 微藻的生理指标测定 3. 结果和分析 2.6.1. 叶绿素的测定 3.1. 菹草 4种液液分离提取物对 3种赤潮微藻生 长的影响 藻液 5000 g 离心 15 min，弃去上清液，加入 90% 丙酮，4˚C抽提24 h。离心后，测定上清液630 nm， 645 nm和665 nm吸光度，参照文献[11]计算叶绿素 含量(以细胞干重衡量，mg/g)。 菹草甲醇浸膏采用液液萃取分离，制备到4种提 取物(见表1)。从 图1可以看出，石油醚和乙酸乙酯提 Figure 1. Algal inhibition ring of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus for the three species of red tide microalgae 图1. 菹草4种液液分离提取物对 3种赤潮微藻的抑藻圈 Table 1. Yields of solvent-partitioned fractions as % (w/w) of methanol extracts from Potamogeton crispus 表1. 菹草4种液液分离提取物得率 甲醇浸膏 石油醚提取物 乙酸乙酯提取物 正丁醇提取物 蒸馏水提取物 质量/g 42 16.2 9.22 3.94 11.2 得率/% 38.5 21.9 9.37 26.6 Copyright © 2012 Hanspub 15  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 取物对米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻产 生了明显(p < 0.05)的抑制作用。当提取物浓度为30 µL(6 mg/L)时，对 3种微藻的抑藻圈直径超过1.9 cm。 在实验设定浓度范围内，蒸馏水提取物未对3种赤潮 微藻产生明显的抑制作用，正丁醇提取物对3种微藻 表现出一定的抑制作用(抑藻圈直径 < 0.4 cm)。 在上述实验基础上，采用培养液检测方法，进一 步分析 4种提取物对3种赤潮微藻生长的影响(图2~ 图4)。结果表明，石油醚和乙酸乙酯提取物对3种赤 潮微藻的生长抑制显著(P < 0.05)且具有浓度效应。在 16 mg/L时，它们对米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛 亚历山大藻的生长抑制率在66%以上(第12 d)。正丁 醇和蒸馏水提取物未对 3种测试微藻的生长产生抑制 作用，这与上述抑藻圈的实验结果一致。 Figure 2. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the growth of Karenia mikimitoi 图2. 菹草4种液液分离提取物对米氏凯伦藻生长的影响 Figure 3. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the growth of Skeletonema costatum 图3. 菹草4种液液分离提取物对中肋骨条藻生长的影响 16 Copyright © 2012 Hanspub  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 Figure 4. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the growth of Alexandrium tamarense 图4. 菹草4种液液分离提取物对塔玛亚历山大藻生长的影响 3.2. 菹草 4种液液分离提取物对 3种赤潮微藻细 胞形态的影响 3.3. 菹草 4种液液分离提取物对 3种赤潮微藻蛋 白质、多糖和叶绿素含量的影响 在图 5中，我们发现在石油醚和乙酸乙酯提取物 致使 3种赤潮微藻细胞出现不同程度的空洞、破碎和 细胞色素减褪现象；蒸馏水提取物未对3种赤潮微藻 的藻细胞形态产生影响。此外，发现在正丁醇提取物 作用下，米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻 的细胞形态也发生一定程度的改变。 从图 6~图8可以看出，石油醚和乙酸乙酯提取物 显著(P < 0.05)降低了3种赤潮微藻细胞内叶绿素、蛋 白质和多糖的含量。与对照组相比，当提取物浓度为 16 mg/L时，米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山 大藻细胞内蛋白质、多糖和叶绿素含量降低为对照组 细胞内相应生理指标含量的50%左右。正丁醇和蒸馏 (a) (b) (c) Figure 5. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on morphology of the three species of red tide microalgae; (a) Karenia mikimitoi; (b) Skeletonema costatum; (c) Alexandrium tamarense 图5. 菹草4种液液分离提取物对 3种赤潮微藻形态的影响；(a) 米氏凯伦藻；(b) 中肋骨条藻；(c) 塔玛亚历山大藻 Copyright © 2012 Hanspub 17  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 0 120 240 0481216 正丁醇提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 叶绿素含量 /(mg/g) 0 100 200 300 0481216 蒸馏水提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 叶绿素含量 /(mg/g) Figure 6. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the contents of physiological indicators of Karenia mikimitoi 图6. 菹草4种液液分离提取物对米氏凯伦藻生理指标的影响 水提取物未对3种赤潮微藻细胞内的3种生理指标产 生明显(P > 0.05)的影响。 4. 讨论 沉水植物是水体中重要的初级生产者，对水体功 能具有非常重要的影响。研究者指出，沉水植物释放 的化学物质对藻类的抑制作用是浅水湖泊维持清水 状态的机制之一[13]。目前，已经发现具有抑藻化感活 性的沉水植物超过 40 多种[13]。其中，有较强耐寒和 耐污能力的菹草被发现能显著抑制铜绿微囊藻、水华 鱼腥藻、小席藻以及斜生栅藻的生长[6,14]。然而，Sabine 通过实验证实，与金鱼藻和穗花狐尾藻相比，菹草的 抑藻能力偏低，前者能抑制大部分的蓝藻、硅藻和绿 藻[15]。 通过前期研究，制备到了菹草甲醇浸膏。在本文， 采用液液萃取法对此浸膏进行进一步分离，获得4种 18 Copyright © 2012 Hanspub  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 中肋骨条藻 0 100 200 300 400 500 0481216 石油醚提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 1.6 3.2 4.8 6.4 叶绿素含量 /(mg/g) 蛋白质 多糖 叶绿素 0 100 200 300 400 500 0481216 乙酸乙酯提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 1.6 3.2 4.8 6.4 叶绿素含量 /(mg/g) 0 100 200 300 400 500 0481216 正丁醇提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 1.6 3.2 4.8 叶绿素含量 /(mg/g) 0 100 200 300 400 500 0481216 蒸馏水提取物浓度 /(mg/L) 蛋白质或多糖含量 /(mg/g) 0 1.6 3.2 4.8 叶绿素含量 /(mg/g) Figure 7. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the contents of physiological indicators of Skeletonema costatum 图7. 菹草4种液液分离提取物对中肋骨条藻生理指标的影响 液液分离提取物——石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸 馏水提取物。在此基础上，分析此4种提取物对米氏 凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻生长的影响。 由图 1、图 2、图3和图 4可见，石油醚和乙酸乙酯 提取物明显降低3种赤潮微藻的细胞数量，当提取物 浓度为 16 mg/L 时，此 2种提取物对3种赤潮微藻的 生长抑制率超过66%(第12 d)。结果表明，菹草提取 物能显著抑制米氏凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山 大藻的生长。 在石油醚和乙酸乙酯提取物作用下，发现3种赤 潮微藻的细胞形态发生了变化，藻细胞出现明显的空 洞、破碎和细胞色素减褪现象(图5)。在铜绿微囊藻研 究中，洪喻等发现，芦竹(Arundo donax Linn.)有机溶 剂提取物能使藻细胞出现空洞和破碎现象[10]。在海 带、浒苔和紫菜提取物对多环旋沟藻、前沟藻、米氏 凯伦藻、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻等生长的 Copyright © 2012 Hanspub 19  菹草提取物对 3种赤潮微藻生长的抑制作用 Figure 8. Effects of solvent-partitioned fractions of methanol extracts from Potamogeton crispus on the contents of physiological indicators of Alexandrium tamarense 图8. 菹草4种液液分离提取物对塔玛亚历山大藻生理指标的影响 研究中也发现藻细胞形态出现类似的变化[16-19]。 如图 6、图 7和图8所示，石油醚和乙酸乙酯提 取物还致使3种受试微藻细胞内蛋白质、多糖和叶绿 素的合成发生明显变化。在陆地和淡水生态系统化感 作用的机理研究中，已经证实化感物质能降低植物的 叶绿素含量、影响蛋白质合成以及酶活等生理指标 [19-21]。根据上述结果，我们推测这种化感作用机理也 可能适用于海洋生态系统，但还有待进一步研究。 参考文献 (References) [1] 金送笛, 李永函, 倪彩虹等. 菹草 (Potamogeton crispus)对水 中氮、磷的吸收及若干影响因素[J]. 生态学报, 1994, 14(2): 168- 173. [2] 黄蕾, 翟建平, 王传瑜. 4种水生植物在冬季脱氮除磷效果的 试验研究[J]. 农业环境科学学报, 2005, 24(2): 366-370. [3] 戴莽, 倪乐意, 谢平. 利用大型围隔研究沉水植 被对水体富 营养化的影响[J]. 水生生物学报, 1999, 23(2): 97-101. [4] 王海珍, 刘永定, 肖邦定. 围隔 中鲢和菹草控藻效 果及其生 态学意义[J]. 水生生物学报, 2002, 28(2): 141-146. [5] 俞子文. 几种高等水生植物的克藻效应[J]. 水生生物学报, 1992, 16(1): 1-7. [6] 贺锋, 吴振斌, 邱东茹 . 东湖围 隔中菹草与藻类生化他 感作 用的初步研究[J]. 水生生物学报, 2002, 26(4): 421-424. [7] Z. L. Chen, W. D. Yang, J. S. Liu, et al. Allelopathic effects of Eichhornia crassipes roots on Alexandrium tamarense. 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