ABSTRACT

Glycogen synthase kinase-3 mainly includes two subtypes of GSK-3α and GSK-3β, whose catalytic activity area is highly homologous. GSK-3β can participate in multiple signaling pathways, including Wnt signal, affect the survival of normal cells and participate in the occurrence and development of the tumor. In this paper, we got GSK-3α, GSK-3β and GSK3β-like subtypes of Paralichthys olivaceus through gene cloning. NCBI Blast and NJ method built the system evolutionary tree; results showed that the GSK3β-like subtypes are peculiar to the marine fish. Meanwhile, Megalign protein sequence alignment and SMART structure prediction revealed that the three different subtypes are highly homologous in functional domain. But, the qRT-PCR results showed that GSK-3β presents significantly higher expression than the other two subtypes during embryonic development, which may be related to that GSK-3β plays a major role in a variety of biological processes.

Keywords:Paralichthys olivaceus, GSK-3, Wnt, Embryonic Development

牙鲆(Paralichthys olivaceus)糖原合成酶激酶-3 (GSK3)不同亚型的克隆及表达研究

王春丽，林彤彤

中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛

收稿日期：2015年12月7日；录用日期：2015年12月20日；发布日期：2015年12月29日

摘 要

糖原合成酶激酶-3 (Glycogen Synthase Kinase-3, GSK3)主要有GSK-3α和GSK-3β两种亚型，二者在催化活性区域具有高度的同源性。GSK3β可以参与包括Wnt信号在内的多个信号通路的调控，影响正常细胞的生存并参与肿瘤的发生与发展。本文以牙鲆为材料，通过基因克隆得到GSK-3α，GSK-3β和GSK3β-like 3个亚型，NCBI序列比对并经NJ法构建系统进化树，结果显示GSK3β-like亚型是海洋鱼类所特有的。同时，Megalign蛋白序列比对及SMART结构预测显示3个不同亚型的功能结构域高度同源；但qRT-PCR结果显示，GSK3β在胚胎发育时期的表达量明显高于另外两个亚型，这可能与GSK3β在多种生物学过程中发挥主要作用相关。

关键词 :牙鲆，糖原合成酶激酶-3，Wnt信号，胚胎发育

1. 引言

糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中[1] 。它最早是在兔骨骼肌的分次提取物中被分离出来，在哺乳动物中主要有两种亚型，即GSK-3α和GSK-3β，二者在催化区域具有高达98%的同源性 [2] ，在N端和C端的非催化功能区同源性较差，是参与肝糖代谢的关键酶。

GSK3β功能多样，研究也最多。不但可以通过对底物的磷酸化实现对Wnt信号通路的调控 [3] ，还可以在PI3K/Akt信号通路中作为下游蛋白，与AKT发生直接作用 [4] 。同时，它还是胰岛素信号通路的关键调节因子。GSK3β可以根据底物不同参与多个信号通路的调控，如底物磷酸化，亚细胞定位等 [5] 。通过与多种蛋白及转录因子相互作用，参与细胞的增值、分化及凋亡等一系列生理过程 [6] 。近年来研究发现，它还在癌症、神经精神类疾病的发病机制中具有重要作用，能够在癌细胞转录、细胞周期加速、肿瘤细胞的侵袭与转移等多个过程中起调控作用，GSK3β是众多恶性肿瘤中的关键激酶，虽然在肿瘤发生中的具体效应还不确定，在肿瘤发生中的作用已经被充分证实 [7] 。众多研究发现，肿瘤中无论Wnt/β-catenin通路还是PI3K/Akt信号通路通常都会处于异常活跃状态，在许多肿瘤如胃癌，结直肠癌、胰腺癌中都可检测到活化的GSK3β的高表达情况 [8] [9] 。因此GSK-3β在近年来成为多种疾病治疗中备受关注的可能靶点，受到越来越多研究者的重视 [10] 。

本篇文章通过分子克隆得到牙鲆GSK-3基因的GSK-3α，GSK-3β和GSK-3β-like3种亚型，并通过序列比对，蛋白结构预测及系统进化等对牙鲆GSK-3的3个不同亚型进行初步分析，并通过qRT-PCR研究了牙鲆GSK-3基因在早期胚胎发育过程中的时空表达变化。

2. 材料及方法

2.1. 胚胎样品的获取及处理

体外自然受精的牙鲆卵至于23℃ (上下浮动1℃)的新鲜海水中孵育，期间保持充气，并隔日更换新鲜海水。分别取受精卵、2细胞、16细胞、桑椹胚、高囊胚、原肠期(原肠早期、原肠晚期)、神经胚、尾芽、出膜期、出膜后、出膜12 h、出膜1 d和出膜36 h共14个胚胎发育早期典型时期的胚胎和仔鱼置于1.5 ml RNA-free的离心管中，每管固定30枚胚胎。经PBS两次清洗后置于液氮中速冻，最后转移至−80℃中保存备用(注：因为没有关于胚胎发育时期该基因表达量的相关报道，我们只是随机挑取了14个胚胎发育时期进行检测)。

2.2. 总RNA的提取及定量模板的体外合成

利用Trizol试剂法提取牙鲆各胚胎组织总RNA，经苯酚/氯仿初步纯化后利用异丙醇沉淀RNA。初步纯化的RNA加入DNaseI去除DNA杂质后利用RNA clean纯化试剂盒(博迈德)除去残留的蛋白质，最后利用M-MLV反转录体系(Takara)体外反转录得到定量模板cDNA。

2.3. 蛋白功能结构域预测分析

利用SMART在线网站初步预测牙鲆GSK蛋白的保守功能结构域，然后绘制牙鲆GSK蛋白家族的一级结构示意图。

2.4. 系统进化分析

通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=GSK)获得哺乳动物(人及家鼠)，两栖类(非洲蟾蜍)，淡水鱼类(斑马鱼)及部分海水鱼(半滑舌鳎，大黄鱼，眶锯雀鲷)的GSK3基因氨基酸序列，利用MEGA6软件，将上述7个物种的氨基酸序列与我们经分子克隆得到的牙鲆GSK3基因各亚型的氨基酸序列以邻位相连法(NJ)进行系统进化分析，并构建系统进化树。

2.5. qRT-PCR

体外反转录得到的牙鲆胚胎各时期的cDNA，稀释到20 ng/μl作为荧光定量PCR的模板。通过IDT在线网站设计各基因的荧光定量引物，GSK3α-Fw：GGTAGGATGTTTGGGAGATGAG；GSK3α-Rv：ACCA CGGCCACACATAAA。GSK3β-Fw：CTCTGCCCTGGTTCATCTTT；GSK3β-Rv：CTCTGCCCTGGTTCATC TTT。GSK3β-like-Fw：CAGCTAAACTCGACCCTCATC；GSK3β-like-Rv：TGGTACTGAACT。内参基因选取的是18S rRNA，其中18S rRNA-Fw：GGTAACGGGGAATCAGGGT；18S rRNA-Rv：TGCCTTCCTTG GATGTGGT。但因为18S rRNA在组织中表达量极高，我们首先通过等比稀释将其模板稀释1000倍。运用Light Cycler 480 (Roche Applied Science)进行qRT-PCR扩增，反应条件是95℃预变性 (5 min)，然后(95℃ 15 s, 60℃ 45 s)共45个循环。每个样品重复3次，取其平均值。

2.6. 数据分析

通过2^−△△CT法对3个基因qRT-PCR所得到的结果进行数据处理，根据分析得到的GSK3基因和18S rRNA内参基因的拷贝数，计算出目的基因的相对表达量。最后用Prism6软件分析作图并利用SPSS 20.0软件进行方差显著性分析。

3. 结果

3.1. 牙鲆GSK3三种亚型基因的克隆及蛋白功能结构域

通过PCR扩增发现牙鲆GSK3基因包含3个亚型，GSK3α基因全长1323 bp，编码440个氨基酸；GSK3β基因全长1278 bp，编码425个氨基酸；GSK3β-like基因全长1320 bp，编码439个氨基酸(图1)。

图1. 牙鲆GSK3基因序列

然后通过SMART在线网站预测牙鲆GSK3基因的蛋白功能结构域，绘制出蛋白的一级结构示意图(图2)，发现3个基因均含有位于中间的大小约为285个(GSK3β为289个)氨基酸的S_—TKc蛋白激酶催化活性功能域，并表现出高度的保守性。在S_—TKc功能结构域处具有高达90%的序列同源性，其中催化活性位点、ATP结合位点，底物结合位点以及下游Axin蛋白结合区域氨基酸序列完全相同，这也验证了GSK3不同亚型在蛋白功能结构域上的高度保守性(图3)。然而3个基因在N端及C端序列差异较大。GSK3β基因与另外两个基因相比，在N端有一段20多个氨基酸的缺失，并在C端区多了10个氨基酸左右的片段。GSK3β与另外两个基因在N端及C端序列及结构上的差异对其功能上可能存在的影响仍不清楚。

3.2. GSK3系统进化分析结果

从NCBI上下载得到已公布的部分物种的GSK3基因序列，鱼类中包括淡水鱼斑马鱼，海水鱼中的大黄鱼，眶锯雀鲷以及半滑舌鳎，两栖类中选取的是是非洲蟾蜍，哺乳类动物选取小鼠和人。将上述物种的氨基酸序列，与克隆得到的牙鲆GSK3基因氨基酸序列一起进行分析，利用MEGA 6.0软件，通过NJ法构建GSK3基因系统进化树(图4)。

结果显示：1) GSK3β-like这个亚型只在海水鱼类中存在，且与鱼类的GSK3α首先聚为一支，然后再与两栖类及哺乳类的GSK3α聚在一起，说明GSK3β-like是进化过程中产生的海水鱼类所特有的一个新的GSK3亚型。2) 牙鲆GSK3在进化关系上与大黄鱼和眶锯雀鲷亲缘性最高，且GSK3α与GSK3β两个亚型在系统发生上完全一致，这也表明了GSK3基因在进化上的保守性。

3.3. GSK3基因在牙鲆胚胎发育早期的的qRT-PCR表达分析

牙鲆胚胎发育各时期中GSK3基因定量结果显示：在受精卵中就能检测到GSK3三种亚型的表达，表现为母源性表达(图5)。由图可知，GSK3各基因在牙鲆胚胎发育各时期中表达量并不高，且表现出基本一致的表达变化趋势：合子开始发育到2 cell，GSK3三种亚型表达量先是明显下调，然后表达量上升，16 cell后表达量开始逐渐下降，原肠胚开始后表现为显著下调，可能是由于原肠作用影响。发育到神经胚后表达量表现出一次显著升高并维持在较高的表达水平直到出膜期，GSK3三种亚型从出膜期开始表达量再次显著下降，直至出膜后1天才表达量开始上升。GSK3β与GSK3β-like的表达量都在出膜期达到最高，而GSK3α的表达量在受精卵时期表现最高。

图2. 牙鲆GSK3蛋白一级结构示意图

图3. 牙鲆GSK3基因氨基酸序列比对

图4. 牙鲆GSK3基因蛋白系统进化分析

图5. 牙鲆GSK3基因胚胎发育时期qRT-PCR分析

但值得注意的是，GSK3β基因在牙鲆胚胎发育时期的时空表达表现出与另外两个基因略有不同的变化趋势。1) 从受精卵时期到囊胚期，与另外两个基因相比，GSK3β基因的表达量一直较低，但发育到体节期后，其表达量突然显著升高，远远高于另外两个基因。这种高表达可能与GSK3β在Wnt信号通路及其它生物学过程中发挥主要作用相关。2) 从高囊胚期到体节期，GSK3α与GSK3β-like都表现出逐渐下降的表达趋势，而GSK3β的表达量先升高，在原肠晚期才出现显著下调。囊胚期及原肠期的表达差异可能与各基因在胚层形成及运动过程中发挥不同作用有关。

综上可得：除GSK3α外，GSK3β与GSK3β-like的表达量都在出膜期达到最高。且GSK3β在胚胎发育时期的表达量明显高于另外两个基因，可能与GSK3β在多种生物学过程中发挥主要作用相关。

4. 讨论

糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)在哺乳动物中主要有两种亚型，即GSK-3α和GSK-3β，本次实验通过分子克隆得到牙鲆GSK-3基因的3种亚型：GSK-3α，GSK-3β和GSK-3β-like，通过NCBI序列比对及系统进化分析可得，GSK-3β-like亚型为海洋鱼类所特有。但有意思的是：GSK-3β-like与GSK-3α氨基酸序列一致性(95%)显著高于GSK-3β (88%)。而系统进化分析也显示，海洋鱼类GSK-3α首先与GSK-3β-like聚为一支，然后再与哺乳类及两栖类的GSK-3α聚在一起，也说明GSK-3α与GSK-3β-like在进化关系上更为接近。

X射线晶体衍射显示：GSK-3β蛋白结构包括三个部分：由7个β片层形成一个β-桶结构的氮端区域，中间铰链区域以及C端α螺旋区域(PDB ID: 1PYX)。通过SMART在线网站预测并绘制出的牙鲆GSK蛋白的一级结构示意图显示：GSK-3β的S_—TKc蛋白激酶催化活性功能域位于中间56-344氨基酸区域，且该功能域在三个亚型中高度保守，序列同源性高达96%。但它们在两端的同源性仅36%，且GSK-3α和GSK-3β-like与GSK-3β相比，在N端有一个20个氨基酸左右的延伸。GSK-3β与其它亚型在催化功能区的高度保守以及在N端结构上的差异导致它们虽然功能上代偿但又存在某些差异。GSK-3α和GSK-3β有着相似的功能，都可以参与软骨细胞分化，调控Wnt信号通路 [11] [12] ，但两者的功能并不能相互替代。小鼠GSK-3β基因敲除实验发现，敲除GSK-3β基因后，早期胚胎发育正常，但敲除GSK-3β基因的小鼠出生13.5~14.5天后会死于肝退化，说明GSK-3a可以一定程度上功能性地弥补GSK-3β的缺失，在发育中也具有非常重要的作用，但这两种亚型在功能上仍存在某些差异 [13] 。

另外，二者在心脏发育过程中也发挥不同的作用，心肌细胞的存活离不开GSK3α，而GSK3β负责调控心脏的定位及左右分布 [7] 。

GSK3最初是从骨骼肌中分离出来的，但在哺乳动物各组织中普遍表达，其中GSK3β在脑组织中具有显著高表达，尤其是神经元细胞中。这是由于GSK3β在神经信号通路中发挥重要作用，参与轴突的生成。在牙鲆胚胎发育时期，GSK3三种亚型均表现为母源性表达，其中GSK-3α和GSK-3β-like表达量较低，且呈现基本一致的表达变化趋势，而GSK3β基因在发育早期表达量较低，但发育到体节期后，其表达量突然显著升高，远远高于另外两个基因，这种高表达可能与GSK3β在多个信号通路及生物学过程中发挥主要作用相关。

GSK3β是Wnt/β-catenin信号通路中的成员，能够通过对β-catenin激酶磷酸化作用调控Wnt信号通路的活化或失活，在通路中与Wnt一起充当正调节因子。GSK3β在调节细胞增殖与凋亡,微管动力学及细胞运动和血管生成中均具有重要作用 [14] 。越来越多的研究发现，GSK3β还能在癌细胞转录、肿瘤细胞的侵袭与转移等多个过程中起调控作用，是众多恶性肿瘤中的关键激酶。鉴于GSK3β的多元化作用及其在不同肿瘤中发挥不同的调控作用，学者们猜测其可能成为新的肿瘤的治疗靶点 [4] 。

在斑马鱼中的研究表明：GSK3β抑制剂化合物处理会引起芽基细胞核内β-catenin的积累、Wnt/β-catenin信号通路下游基因lef1和shh表达上调，促进再生组织中细胞的增殖并最终促进斑马鱼再生过程中的骨生长 [15] 。另有报导：抑制GSK3β能够激活BMP信号并较少SOST的表达从而引起成骨细胞的分化增强。这些研究都证实了GSK3β在Wnt/β-catenin信号通路中发挥着重要作用。而大黄鱼肝脂质沉积实验表明：GSK3β/β-catenin可能通过peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ)来参与调控大黄鱼肝脏中fatty acid synthetase (FAS) and lipoprotein lipase (LPL)的形成，并最终抑制肝脂质沉积 [16] 。

因此开展对于牙鲆GSK3基因结构、系统发生及其在牙鲆胚胎发育早期的表达变化的基础研究，对于我们更好地理解其在Wnt信号通路中的分子作用机制以及后续开展GSK3基因的功能验证具有重要意义，也为我们更深入了解其对于牙鲆早期生长发育的可能调控作用打下基础。

5. 结论

1) 本文通过基因克隆得到了牙鲆GSK3基因的三个不同亚型：GSK-3α，GSK-3β和GSK3β-like，其中NCBI比对及系统进化分析显示GSK3β-like亚型是海洋鱼类所特有的，且在进化关系上与GSK-3α更为接近。

2) 氨基酸序列比对结果显示：三个亚型的S_—TKc蛋白激酶催化活性功能域高度保守，但在N端和C端的非催化功能区同源性较差。

3) 牙鲆胚胎发育各时期GSK3基因定量结果显示：GSK3α的表达量在受精卵时期表现最高，而GSK3β与GSK3β-like的表达量都在出膜期达到最高，且GSK3β在胚胎发育时期的表达量明显高于另外两个基因，这可能与GSK3β在多种生物学过程中发挥主要作用相关。

文章引用

王春丽,林彤彤. 牙鲆(Paralichthys olivaceus)糖原合成酶激酶-3 (GSK3)不同亚型的克隆及表达研究
The Cloning and Expression Analysis of Different Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK3) Subtypes on Paralichthys olivaceus[J]. 水产研究, 2015, 02(04): 74-84. http://dx.doi.org/10.12677/OJFR.2015.24009

参考文献 (References)