 Botanical Research 植物学研究, 2012, 1, 54-59 http://dx.doi.org/10.12677/br.2012.13009 Published Online October 2012 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) Optimization of Chaenomeles SRAP-PCR Reaction System through the Quadratic Orthogonal Rotatable Combinatorial Design* Dekui Zang, Changhong Y i n, Yanling W a ng, Yan Ma Forestry College, Shandong Agricultural University, Tai’an Email: zangdk@sdau.edu.cn Received: Aug. 31st, 2012; revised: Sep. 14th, 2012; accepted: Sep. 15th, 2012 Abstract: Using Chaenomeles genome DNA as template, the relationship between the five PCR factors (Mg2+, dNTP, primer, Taq DNA polymerase, template DNA) and the PCR results was studied through the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design. The mathematical model of the PCR result on the PCR factors was firstly established by software SAS9.0. Based on the model, the optimized amplification system for SRAP-PCR of Chaenomeles was set up and verified. The successful establishment of the optimization system showed that the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design are stable and reliable to opti- mize the SRAP-PCR system, and it could be applied to the other optimization of PCR systems. Keywords: Chaenomeles; Quadratic Orthogonal Rotatable Combinatorial Design; Optimization of PCR System; Mathematical Model 利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系* 臧德奎，尹长虹，王延玲，马 燕 山东农业大学林学院，泰安 Email: zangdk@sdau.edu.cn 收稿日期：2012 年8月31 日；修回日期：2012 年9月14 日；录用日期：2012 年9月15 日 摘 要：以木瓜属(Chaenomeles)植物基因组 DNA 为模板，采用五因素二次正交旋转组合设计(12实 施)，对 PCR 反应的 5个因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板 DNA)进行研究，首次建立 了PCR 反应的各因素编码值与 PCR 结果评分值之间的数学模型。利用该模型，建立了 PCR 反应的最 优体系，并进行了验证。最优体系的成功建立表明，该优化方法是稳定可靠的，可以为其他物种的PCR 体系优化提供借鉴。 关键词：木瓜属；二次正交旋转组合设计；PCR 体系优化；数学模型 1. 引言 相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是由加州大学的 Li 和Quiros 在 芸薹属(Brassica)植物上开发出来的、基于 PCR 的新 型分子标记系统[1]。该标记针对基因外显子中 GC 含 量丰富、启动子和内含子中TC 含量丰富的特点，设 计独特的引物对开放阅读框 ORFs 进行特异扩增，具 有简单、快速、稳定性强、无需预知序列信息、在基 *基金项目：国家自然科学基金(30972406)。 Copyright © 2012 Hanspub 54  利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系 因组中分布均匀等特点，现已广泛应用于甜瓜、桃、 柿子、牡丹、番茄、葱属等多种植物的遗传多样性评 价、品种鉴定、比较基因组学等诸多领域[2-14]，均取 得了很好的结果。 SRAP 是基于 PCR 反应的分子标记，其反应条件 受到 PCR各因子的浓度、模板质量、退火温度等多种 因素影响，SRAP-PCR 反应体系的建立和优化是试验 成功与否的关键。目前，优化 PCR 反应体系的方法主 要有正交试验法和单因素试验法。正交试验法只是选 择了设计组合中较好的一个，最优组合不一定出现在 正交设计表中；单因素试验法则依次选择了各组分的 最佳浓度，但不能反映 PCR 体系中各组分的交互作 用，因此也无法确保该组合为最佳反应体系。此外， 均匀设计法[15]、趋势面设计法[16]也偶尔用于 PCR 体 系优化，但均不能明确反映 PCR 各因素间及其与 PCR 结果间的函数关系。 二次正交旋转组合设计是正交回归试验设计的 一种，它克服了普通正交设计无法寻找最优区域的缺 点，同时又保留了正交设计试验次数少、计算简便、 消除回归系数间相关性的优点。而且，利用该设计还 可以建立定量数学模型，并从多角度对模型进行模拟 分析。二次正交旋转组合设计目前主要应用于机械工 艺研究、培养基组份优化以及田间施肥量试验[17-24]， 尚无用于筛选PCR 反应体系的报道。本研究首次尝试 采用二次正交旋转组合设计优化 SRAP-PCR 反应体 系，并对其进行建模分析，以期得到最佳反应组合。 2. 材料与方法 2.1. 材料 研究材料为木瓜属(Chaenomeles)植物的叶片，采 自山东农业大学校园，包括“豆青”(C. sinensis “Douqing”)、“长俊”(C. cathayensis “Changjun”)和“多 彩”(C. speciosa “Toyo-Nishiki”)3 个品种。 SRAP 引物参照王明明等[25]的引物组合，正向序 列为：5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’，反向序列为： 5’-GACTGCGTACGAATTTAG-3’。 Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶均购自北京鼎国 昌盛生物技术有限责任公司，DNA marker 购自 Biomiga 公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。 2.2. 研究方法 2.2.1. 木瓜基因组 DNA 的提取和检测 以木瓜幼叶为材料，利用改良CTAB 法[26,27]提取 基因组 DNA，用 0.8%琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光 光度计法检测DNA 质量和纯度，稀释至50 ng·μL–1， –20℃保存。 2.2.2. PCR反应体系的二次正交旋转组合设计 采用 5因子二次正交旋转组合设计(12实施)。以 PCR 反应体系中的 5个因子 Mg2+(X1)、dNTP(X2)、引 物(X3)、Taq DNA聚合酶(X4)、模板 DNA(X5)为自变 量，编制 PCR 反应的因子水平编码表(表1)。反应体 系总体积为 25 μL，不足体积用 ddH2O补充。试验设 计方案见表 2，共 36 个处理，每个处理 4次重复。 PCR 扩增程序参照文献[1]：94℃预变性 5 min； 94℃变性1 min，35℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，5 个循环；94 ℃变性 1 min，50℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72℃延伸7 min。 扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙 锭(EB)染色，在凝胶成像系统上采集图像。 Table 1. Factor levels and their coded val ues 表1. PCR反应的因子水平编码表 因子浓度 Factor levels 编码值 Coded values X1/(mmol·L–1) X2/(mmol·L–1) X3(μmol· L–1) X4/U X5/ng 2 3.0 0.4 0.4 2 70 1 2.625 0.325 0.325 1.625 55 0 2.25 0.25 0.25 1.25 40 –1 1.875 0.175 0.175 0.875 25 –2 1.5 0.1 0.1 0.5 10 Copyright © 2012 Hanspub 55  利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系 Table 2. Experimental matrix and results 表2. 试验设计矩阵及试验结果 试验结果 Results 试验号 No. X1 X 2 X 3 X 4 X 5 4次试验条带数 Number of bands 条带之和 Sum of bands 条带方差 Variance of bands 得分 Y Score 1 1 1 1 1 1 8 7 6 9 30 1.25 28 2 1 1 1 –1 –1 4 4 3 4 15 0.1875 8 3 1 1 –1 1 –1 7 6 3 5 21 2.1875 15 4 1 1 –1 –1 1 2 2 1 2 7 0.1875 2 5 1 –1 1 1 –1 6 7 4 5 22 1.25 16 6 1 –1 1 –1 1 6 4 2 2 14 2.75 7 7 1 –1 –1 1 1 5 6 2 5 18 2.25 12 8 1 –1 –1 –1 –1 1 1 2 1 5 0.1875 1 9 –1 1 1 1 –1 10 11 9 6 36 3.5 34 10 –1 1 1 –1 1 11 13 8 5 37 9.1875 35 11 –1 1 –1 1 1 11 13 11 7 42 4.75 36 12 –1 1 –1 –1 –1 1 4 11 2 18 15.25 11 13 –1 –1 1 1 1 7 8 8 6 29 0.6875 27 14 –1 –1 1 –1 –1 7 3 1 3 14 4.75 5 15 –1 –1 –1 1 –1 8 5 7 5 25 1.6875 21 16 –1 –1 –1 –1 1 1 5 6 2 14 4.25 6 17 2 0 0 0 0 2 1 8 3 14 7.25 4 18 –2 0 0 0 0 8 6 9 10 33 2.1825 31 19 0 2 0 0 0 7 4 10 11 32 7.5 30 20 0 –2 0 0 0 5 1 7 3 16 5.0 9 21 0 0 2 0 0 5 3 7 8 23 3.6875 17 22 0 0 –2 0 0 3 3 7 7 20 4 13 23 0 0 0 2 0 8 9 7 11 35 2.1875 33 24 0 0 0 –2 0 4 1 2 2 9 1.1875 3 25 0 0 0 0 2 8 5 3 4 20 3.5 14 26 0 0 0 0 –2 2 6 4 5 17 2.1875 10 27 0 0 0 0 0 5 9 7 5 26 2.75 23 28 0 0 0 0 0 6 7 7 7 27 0.1875 25 29 0 0 0 0 0 6 4 8 5 23 2.1875 19 30 0 0 0 0 0 5 5 8 9 27 3.1875 24 31 0 0 0 0 0 7 6 10 11 34 4.25 32 32 0 0 0 0 0 7 5 10 9 31 3.6875 29 33 0 0 0 0 0 8 6 7 8 29 0.6875 26 34 0 0 0 0 0 1 7 8 8 24 8.5 20 35 0 0 0 0 0 6 5 8 4 23 2.1875 18 36 0 0 0 0 0 6 5 6 8 25 1.1875 22 3. 结果与分析 3.1. 回归模型的建立 木瓜 SRAP-PCR 反应体系的 36 个处理的扩增结 果(图1)显示，不同处理间存在显著差异。目前对电泳 图的评价主要采用评分法[28]，本研究加以改进。对凝 胶成像图中 36个处理，除了统计亮度高且清晰的条 带数量外，还根据 4次重复实验计算同一处理的方差 Copyright © 2012 Hanspub 56  利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系 注：M为DNA marker，1~36 为二次正交旋转组合试验设计不同的处理。 Note: M means DNA marker, 1 - 36 means different treatments of the experiment. This figure is one of the four repeated experimental pictures. Figure 1. Electrophoresis photograph of SRAP-PCR reaction with the quadratic orthogonal rotatable combinatorial design 图1. SRAP-PCR二次正交旋转组合试验设计电泳图 以反映其稳定性。依不同处理的条带总数与方差进行 排序，条带最多且方差较小的处理得36 分，条带最 少且方差较大的处理得 1分，以此类推，以不同处理 所得分值为目标函数(表2)。 将表 2中的试验设计矩阵及评分结果在SAS 9.0 软件中运行，由响应面的参数估计得回归方程： Y = 23.6875 – 5.791667X1 + 4.875X2 + 2.625X3 + 7.208333X 4 + 2.041667X5 – 1.28125X1 2 – 2.5625X1X2 – 0.78125X2 2 + 0.1875X1X3 + 1.6875X2X3 – 1.90625X3 2 – 0.4375X1X4 + 0.0625X2X4 – 0.9375X3X4 – 1.15625X4 2 – 1.4375X1X5 + 1.5625X2X5 + 1.5625X3X5 – 0.5625X4X5 – 2.65625X5 2 该方程反映了 PCR处理的评分值 Y与PCR各因 素编码值之间的函数关系。 回归模型的方差分析(表3)显示，除交叉项外，方 程的线性项、平方项及总回归全部显著，复决定系数 R2 = 0.9342，证明回归方程与实际拟合较好；失拟检 验不显著(P = 0.7118)，说明未知因素对试验结果的干 扰较小，因此回归模型有意义。 3.2. 木瓜SRAP-PCR 反应最优体系的建立 与验证 3.2.1. 最优体系的建立 将回归方程代入 SAS9.0，在各因素编码范围 (–2~2)内的0.1 水平上进行模拟寻优，求得 Y的极大 值点。此时 X1 = –2，X2 = 2，X3 = 1.72，X4 = 2，X5 = 1.81，Y = 68.3045。 将各因子编码值换算为相应的浓度值即得到反 应的最优体系：Mg2+ 1.5 mmol·L–1 、dNTP 0.4 mmol·L–1、引物 0.379 μmol · L –1、Taq DNA聚合酶2 U、 模板 DNA 67.15 ng，总体积为 25 μL。 3.2.2. 利用最优体系筛选多态性引物组合 以木瓜属 3个品种的基因组 DNA 为模板，利用 上述最优体系对157 对SRAP 引物(表4)进行扩增(图 2)，共筛选出条带清晰且多态性丰富的引物组合32 对，这 32对引物共扩增出 544 条带，其中多态性条 带495 条，平均每对引物扩增出 15.47 个多态性条带。 可以看出，该最优体系对不同木瓜品种及引物组合的 扩增均是稳定可靠的。 4. 讨论 PCR 技术在各个领域都有着广泛应用，PCR 反应 体系因参试物种、分子标记方法及药品质量的不同而 有所差异，但PCR 的优化方法是可以通用的，因此， 选择一个好的试验设计方法对 PCR 体系的优化至关 重要。 本文运用二次正交旋转组合设计优化木瓜的 SRAP-PCR 反应体系，建立了 PCR 处理的评分值与 PCR 各因素编码值之间的数学模型，该模型达到了 0.0001 的极显著水平且失拟检验不显著，即所建模型 有意义且与实际拟合较好，因此该设计方法是合适 的。 目前对电泳胶图的评价主要采用直观法，对其进 行评分分析的较少且均未体现出条带的稳定性[16, 29,30]。本实验采用条带数之和与方差相结合的方法， 既体现了条带的特异性和敏感性，又兼顾其稳定性。 模型的成功建立证明该评价方法是可行的。 Copyright © 2012 Hanspub 57  利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系 Table 3. Variance analysis of the regression model 表3. 回归模型的的方差分析 变异来源 Source of variance 自由度 DF 平方和 Sum of Squares F值 F Value P值 Pr > F 线性项 Linear 5 2887.875000 33.90 <0.0001 二次项 Quadratic 5 456.906250 5.36 0.0050 交叉项 Cross product 10 284.625000 1.67 0.1788 总回归 Total Model 20 3629.406250 10.65 <0.0001 失拟项 Lack of Fit 6 74.693750 0.62 0.7118 误差 Pure Error 9 180.900000 总剩余 Total Error 15 255.593750 Table 4. SRAP primer sequences used in amplification 表4. 用于扩增的 SRAP 引物序列 正向引物 Forward primer 碱基序列 Sequences 反向引物 Reverse primer 碱基序列 Sequences ME1 5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’ EM1 5’-GACTGCGTACGAATTTGC-3’ ME2 5’-TGAGTCCAAACCGGAGC-3’ EM2 5’-GACTGCGTACGAATTTGG-3’ ME3 5’-TGAGTCCAAACCGGACC-3’ EM3 5’-GACTGCGTACGAATTAGC-3’ ME4 5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’ EM4 5’-GACTGCGTACGAATTCGA-3’ ME5 5’-TGAGTCCAAACCGGTGT-3’ EM5 5’-GACTGCGTACGAATTCCA-3’ ME6 5’-TGAGTCCAAACCGGCGT-3’ EM6 5’-GACTGCGTACGAATTGGC-3’ ME7 5’-TGAGTCCAAACCGGACG-3’ EM7 5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’ ME8 5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’ EM8 5’-GACTGCGTACGAATTTAG-3’ ME9 5’-TGAGTCCAAACCGGTAA-3’ EM9 5’-GACTGCGTACGAATTCAG-3’ ME10 5’-TGAGTCCAAACCGGTCA-3’ EM10 5’-GACTGCGTACGAATTACG-3’ ME11 5’-TGAGTCCAAACCGGAAG-3’ EM11 5’-GACTGCGTACGAATTATG-3’ ME12 5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’ EM12 5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’ ME13 5’-TGAGTCCAAACCGGAGA-3’ EM13 5’-GACTGCGTACGAATTGCA-3’ ME14 5’-TGAGTCCAAACCGGGTA-3’ EM14 5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’ EM15 5’-GACTGCGTACGAATTATT-3’ Note: M means DNA marker, 83 - 92 means different primer combinations. 注：M为DNA marker，83~92 为不同引物组合的序号。 Figure 2. Amplification results of different primer combinations using the optimized system 图2. 最优体系在部分 SRAP 引物组合中的扩增结果 Copyright © 2012 Hanspub 58  利用二次正交旋转组合设计优化木瓜 SRAP-PCR 反应体系 所建立的最优体系为Mg2+ 1.5 mmol·L–1、dNTP 0.4 mmol·L–1、引物0.379 μmol · L –1、Taq DNA 聚合酶 2 U、模板 DNA 67.15 ng，总体积为25 μL。利 用 该 最 优体系对木瓜属3个种的157 对SRAP 引物进行筛选， 结果表明，该体系对不同木瓜品种及引物组合的扩增 均是稳定可靠的，可以用于木瓜属分子研究的后续试 验。 将相关文章中的 SRAP体系各因素浓度进行编码 后带入本实验所得模型，有的体系得分较高，如姜帆 等对龙眼的优化体系[31]得分 95.90；有的体系得分与 本实验相近，如李艳香等对八仙花的优化体系[32]得分 62.13；也有的体系得分较低，如楚爱香等对观赏海棠 的优化体系[33]得分 3.09。这可能是由于不同试验材料 对PCR 反应体系的要求不一样，因此，所得模型也不 能完全通用，需要根据不同的试验材料建立相适应的 数学模型进行优化。 二次正交旋转组合设计在 PCR 体系优化中的应 用还没有报道，将该设计方法与 SRAP标记技术结合 并应用到木瓜属植物的研究中也尚属首例。本文对二 次正交旋转组合设计在 PCR 反应体系优化中的应用 进行了尝试，并与 SAS软件结合，建立了完整的优化 程序，希望能使这项技术在今后PCR 体系优化中发挥 作用。 参考文献 (References) [1] G. Li, C. F. Quiros. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: Its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theo- retical and Applied Genetics, 2001, 103: 455-461. 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