 Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 13-20 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.21003 Published Online March 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp) Application in Activated Sludge Microbial Community Diversity Used Molecular Biological Technology* ——Study of Sludge Microbial Community Diversity Lianpeng Sun1,2, Yuhan Cui1, Jianming Huang3, Tingjin Ye3, Y i Cheng3 1School of Environmental Science and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Environmental Pollution Control and Remediation Technology, Guangzhou 3Foshan Water Group, Foshan Email: eesslp@mail.sysu.edu.cn Received: Dec. 2nd, 2011; revised: Dec. 21st, 2011; accepted: Jan. 7th, 2012 Abstract: Biochemical aerobic treatment technique based on activated sludge process is the most widely applied bio- logical wastewater treatment technique. With the development of modern molecular biological technology, it enhances our knowledge about the complexity and the biodiversity of activated sludge microbial communities. Numerous key microorganisms in activated sludge which were not detected by tradition al cultiv ation methods, were d isclosed b y mod- ern biological techniques. These modern molecular biological techniques are represented by FISH, DGGE/TGGE, T-RFLP, RAPD, AFLP, PCR-SSCP and so on. It reveals the characteristics and development of the modern techniques, and it provides guidance for study of activated sludge microbial community diversity. Keywords: Activated Sludge; Molecular Biological Technology; Biodiversity of Microbial Communities 分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用* ——污泥微生物群落研究 孙连鹏 1,2，崔语涵 1，黄剑明 3，叶挺进 3，程 毅3 1中山大学，环境科学与工程学院，广州 2广东省环境污染控制与修复技术重点实验室，广州 3佛山市水业集团有限公司，佛山 Email: eesslp@mail.sysu.edu.cn 收稿日期：2011年12月2日；修回日期：2011年12 月21 日；录用日期：2012 年1月7日 摘 要：以活性污泥法为主体的生化好氧处理工艺是目前应用最广泛的污水生物处理技术。随着分子生物学技 术的发展，人们对活性污泥微生物菌群的复杂性和多样性的认识逐步深入，大量依靠传统方法未能检测出，但 却在活性污泥中起关键作用的微生物逐渐被发现。这些现代分子生物技术以 FISH 技术、DGGE/TGGE 技术、 T-RFLP 技术、RAPD 技术、AFLP 技术、PCR-SSCP 技术等为代表。通过对这些技术的综述分析，揭示其技术 特点和应用发展方向，为探索研究活性污泥的微生物群落多样性提供指导意义。 关键词：活性污泥；分子生物技术；微生物群落多样性 *基金项目：广东省科技计划项目(2009B030801194，2010B020413003)，中央高校基本科研业务费专项资金 (2010380003161543)，佛山市禅 城区科技计划项目(2010A1004)。 Copyright © 2012 Hanspub 13  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 Copyright © 2012 Hanspub 14 1. 引言 以活性污泥为主体的生化处理工艺已经成为污 水处理中的最主要工艺，该工艺主要依靠污泥中大量 的微生物氧化分解水中的污染物质，从而达到水质净 化的目的。微生物的种类、数量等直接影响到工艺的 处理效率。深入了解活性污泥微生物多样性，有助于 进一步揭示工艺的运行机理，从而提高处理效果和降 低处理费用。人们对活性污泥微生物菌群的认识随着 微生物研究方法的不断改进而日益深入。利用先进的 检测手段，对活性污泥微生物多样性进行研究，已成 为当今研究的热点问题。本文将重点描述目前微生物 多样性的主要研究方法与技术，包括 FISH 技术、 DGGE/TGGE 技术、T-RFLP 技术、RAPD 技术、AFLP 技术、PCR-SSCP 技术等。 2. 荧光原位杂交技术(FISH) FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是 20 世纪 80 年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术。它是以荧光标 记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。 其原理是基于碱基互补的原则，将一小段(通常 15~30 个碱基)用荧光物质标记过的 DNA 或RNA 序列作为 探针，与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制 片等杂交，与待测核酸的靶序列专一性结合，利用显 微镜和流式细胞术等荧光检测技术进行观察和分析， 通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存 在、数目和定位。这一技术也可同时对不同类群的细 菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位 置标示。1988 年，Giovannoni等首次将 FISH 技术引 入细菌学的研究[1]。1989 年，Delong 首次使用荧光标 记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞[2]。 2.1. FISH技术的特点 FISH 技术具有操作简单、测定灵敏迅速、实验周 期短、原位、安全等特点，可同时检测几种微生物， 避免了由于核酸抽提和 PCR(聚合酶链式反应)扩增 产生的偏差。以 rRNA 为基础的 FISH 技术可以得到 特定微生物在环境中的存在、空间分布和丰度以及整 个微生物群落的组成、结构及其多样性等全面信息。 该技术在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物 生态学研究中应用较多[3]。近年来，研究人员已对超 过2500 种细菌的 16 SrRNA进行了测序，在系统发育 水平上得到了大量的有用信息。 然而，FISH 技术在环境微生物研究中的应用尚处 在起步阶段，还存在许多不足：如检测的精确性和可 靠性依赖于寡核苷酸探针的特异性，探针特异性不足 或灵敏度偏低都会影响测量结果；细菌普遍存在的自 发荧光现象以及营养饥饿状态下荧光杂交信号减弱 等都会导致假阳性结果[4]；另外，杂交液渗透不充分、 杂交后荧光标记见光褪色等也会导致假阴性结果。 2.2. FISH技术的应用和发展 FISH技术既可以在保持活性污泥原始状态的情 况下研究其构造，又可以直接观察到目标微生物在活 性污泥中的实际分布状况，因此在污泥微生物群落的 研究中应用广泛。Man- Tak Wong等应用FISH 技术对 来自 9个污水处理厂的 13 种活性污泥样品中的微生 物群落进行分析，说明了大规模污水处理厂与实验室 反应器中的微生物种群结构相差甚远[5] 。在 Adrian Oehmena 等的研究中运用了三色杂交，提供了更多微 生物群落形态和它们之间结构关系的信息，增强了 FISH 技术的考察能力[6]。 如今，随着标记技术和信号检测设备的不断改进 及相关的细胞遗传学和分子生物学的发展，FISH 技术 正逐渐形成从单色到多色、从中期染色体到粗线期染 色体再向 DNA 纤维的发展趋势，灵敏度和分辨率正 在由 mb 向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、 大片段向小片段再向BAC/YAC等方向不断提高[7]。 目前，FISH技术已衍生出原位杂交显带(ISHB)[8]、反 向染色体涂色(reverse chromosome painting)[9]、多色荧 光原位杂交(mFISH)[10]、DNA纤维-FISH(DNA fiber- FISH)[11]、酪胺信号放大-FISH(TSA-FISH)[12]、ring- FISH[13]、MAR-FISH[14]等一系列技术。FISH 技术的 优势在于能了解微生物在污泥中的数量、形态、分布 状态等，其与流式细胞术、PCR、DGGE/TGGE、SSCP、 RFLP 染色等研究方法相结合，可突破FISH 技术不能 提供活性污泥内部种群多样性、检测“未知”微生物 的研究局限，增加研究的准确性，可以从宏观到微观 更全面地了解活性污泥的内部信息。Joh wan Ahn等 结合 FISH 与PCR-DGGE 技术对反应器中的活性污泥  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 微生物群落结构与分布进行了研究，FISH 技术弥补了 DGGE未能给出此菌种在活性污泥中分布状态和形态 结构信息的缺陷[15]。 3. 变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE) DGGE(denatured gradient gel electrophoresis)技术 是由 Fischer 和Lerman 于1979 年最先提出的用于检 测DNA 突变的一种电泳技术[16]。Myers 等(1985)首次 在DGGE 中使用“GC 夹板”和异源双链技术，使该 技术日趋完善[17]。Muzyer 等(1993)首次将 DGGE 技术 应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种技术在 揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方 面具有独特的优越性[18]。后来发展的用温度梯度代替 化学变性剂的温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)是其衍生技术。该技术被 广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已 经发展成为研究微生物群落结构的最主要分子生物 学方法之一。 DGGE/TGGE 是依据双链 DNA 片断熔解行为的 不同，分离 PCR 产物中长度相同但序列不同的 DNA 标记片断(rRNA 或rDNA)。从理论上讲，DGGE/TGGE 指纹图上的一个条带就代表一个微生物类群，分类水 平可达种。因此，指纹图谱不但直观反映了微生物群 落的结构和多样性，还可方便判断出优势菌或功能 菌。 3.1. DGGE/TGGE技术的特点 DGGE/TGGE 技术可直接对提取的样品总 DNA 进行微生物多样性分析，其重现性强、可靠性高、速 度快、无须对引物标记，能够弥补传统方法分析微生 物群落的不足。 但DGGE 法只能对微生物群落中数量大于 1%的 优势种群进行分析[19]，且不能对样品中所有的 DNA 片段进行分离[20]；一个条带并非只代表一种细菌种 群，不同的实验条件很可能导致不同的带型谱图[21]。 3.2. DGGE/TGGE技术的应用和发展 基于 DGGE/TGGE衍生出了多项新技术，使其在 污泥中微生物群落的检测更加客观可靠：1) DGGE/ TGGE 与PCR 结合：可用于不同微生物群落之间的差 异分析，也可进行同一种微生物群落随时间和环境变 化演替规律的研究，是微生物群落遗传多样性和动态 分析的有力工具。刘新春等应用 PCR-DGGE 技术， 追踪了分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥 系统中的微生物群落结构的动态变化情况，研究结果 表明，在相同的操作条件下，两系统的微生物群落结 构的相似性随着运行时间的增加而增加，PCR-DGGE 技术在评价活性污泥系统中微生物群落结构的变化 方面方便快捷，具有良好的应用前景[22]；2) 巢式 PCR- DGGE/TGGE 技术：利用两套PCR 引物进行两轮PCR 扩增反应，以第一轮扩增的DNA 序列内部的一对引 物进行第二轮扩增，降低了扩增多个靶位点的可能 性，增加了检测的敏感性和可靠性，有利于对微生物 特异种属的研究。李黎等选取 MBR工艺和 Orbal 氧 化沟的生物池进行活性污泥样品的采集，结合巢式 PCR 技术和DGGE 技术，研究了两种不同工艺中活性 污泥中细菌种群结构及其多样性[23]；3) DGGE/TGGE 与标记技术结合：在对 PCR 扩增产物进行梯度凝胶电 泳后，以 DGGE/TGGE 图谱上的条带为原始模板， 制备带有标记的核苷酸探针，与来自已知纯培养物的 相应基因扩增产物进行杂交，来确定 DGGE/TGGE 图 谱上特定条带的微生物种类。Samantha 等采用稳定同 位素探针(SIP)-PCR-DGGE 技术研究了有机污染土壤 中微生物群落功能和遗传结构的演变过程，并对甲烷 细菌群落生态多样性进行了分析[24]；4) DGGE/TGGE 与克隆技术结合：对环境样品高可变区 DGGE 分析得 到群落特征的同时，从克隆 16SrDNA长片段获得更 多的序列信息，克服了 PCR-DGGE检测片段携带信 息量有限的缺点，还可对多克隆集合 DGGE分析，反 映生态系统中的优势群落。曾薇等针对4种实际污水 短程生物脱氮系统中硝化菌群 AOB 和NOB 进行定性 与定量化分析，其中对 SBR大型中试反应器中污泥 样品的 PCR-Cloning-Sequencing 结果显示，所有的克 隆相似于Nitrosomonas，与DGGE 分析结果完全一致， 其中 60%以上的克隆相似于 Nitrosomonas europaea[25]； 5) 双梯度–变性梯度凝胶电泳DG-DGGE：在 原有单 一化学变性剂梯度的基础上引入凝胶浓度梯度，提高 DGGE 的灵敏度。邢德峰等用DG-DGGE 技术分离和 鉴定 PCR扩增产物，获得了连续流生物制氢反应器活 性污泥中微生物群落多样性信息[26]。 Copyright © 2012 Hanspub 15  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 4. 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP) T-RFLP(Terminal-Restriction fr agment length poly- morphism)技术是由 RFLP 发展而来。1997 年Liu 等首 先将 T-RFLP 技术用于微生物群落分析，现已应用于 菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育种群多样 性的评估等领域[27]。T-RFLP 技术的原理是将 PCR引 物中的一条加以荧光标记，将 PCR 扩增产物用合适的 限制性内切酶消化，酶切后会产生许多不同长度的限 制性片段，只有末端带荧光标记的片段才能被监测 到。通过对这些荧光信号以及由此生成的 T-RFLP 图 谱的分析，就可以揭示样品中微生物的种类、数量和 种群大小等，从而解析微生物群落的结构、功能及其 动态变化。 4.1. T-RF LP技术特点 T-RFLP 技术是一种全面的、分辨率高、重现性 良好的分子指纹图谱技术。相对于其它分子生物学分 析技术如 RFLP、DGGE/TGGE 等，T-RFLP 具有较明 显优势[28]：1) 能够迅速产生大量重复、精确的数据， 用于微生物群落结构的时空演替研究；2) 重现性好， 自动化高，可对大量信息进行快速分析，数字化输出 可以直接用于标准统计分析；3) 消化产物中获得的所 有末端片段，可以与已有序列数据库对比，有可能直 接鉴定出群落图谱中的单个菌种。 T-RFLP 也存在一定的局限性[29]：1) 是基于 PCR 扩增的技术，具有这类技术共同的缺陷；2) 只检测带 荧光标记的末端限制性片段，且 500 bp以上的末端片 段精度不够，易造成对群落多样性的低估；3) 步骤繁琐， 对实验操作和条件要求非常高 ，影 响因素多 ，DNA 提 取方法、PCR中的参数设置及限制性内切酶等的选择都 可能使 T-RFLP 图谱的解析存在一定的不确定性；4) 最 终获得的大量信息的处理和统计学分析技术仍不完善。 4.2. T-RF LP技术的应用和发展 尽管 T-RFLP 技术存在不少缺陷，该技术已成为 分析复杂环境微生物群落多样性的最强有力工具之 一。Eschenhagena等研究了强化生物除磷工艺中活性 污泥微生物群落结构，T-RFLP 技术表明两种运行方 式下活性污泥中的微生物群落结构有明显差异，而用 FISH 技术却未发现差异，说明T-RFLP 技术的分辨率 较高[30]。而今越来越多的研究者证明 T-RFLP 技术具 有比 DGGE 等指纹图谱技术更强的优势，已广泛应用 于研究活性污泥的微生物菌群结构和监测因环境改 变而引起的菌群变化[31,32]。 5. 随机扩增多态 DNA(RAPD) RAPD 是由Wiliams[33]和Welsh[34]两个研究团队 于1990 年各自独立发现的一种 DNA 多态监测技术， 通过 PCR 扩增，并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分 离、溴化乙锭染色后，来检测 DNA 片段多态性。是 基于 PCR 的一种可对整个未知序列的基因组进行多 态性分析的分子生物学技术。 5.1. RAPD技术的特点 RAPD 技术继承了 PCR技术效率高等优点。但 RAPD 技术又不同于 PCR技术，有其独特之处[35,36]： 1) 模扳 DNA 的需量极少，且纯度要求低，采用随机 引物，不需预先知道待扩增基因的核苷酸顺序即对各 种生物进行 DNA 片段多态性分析；2) 操作简便快速， 不需要分子杂交、克隆制备等复杂步骤，可直接对 DNA 多态性进行分析；3) 所需引物短，整个基因组 内的结合位点多，覆盖率大，引物可以混用，可综合 运用上百种的引物对基因组进行地毯式的多态分析， 检测基因组间的微小差异；4) 较低的退火温度，增大 了引物在基因组 DNA中配对的随机性，检出率高。 尽管 RAPD 具有如上优点，但模板质量、浓度、 引物选择、循环次数、凝胶质量等经常造成 RAPD 重 现性差等问题[37]。 5.2. RAPD技术的应用与发展 基于 RAPD 的重现性差的问题，在RAPD 基础上 发展起来的新的分子标记技术正逐渐完善该系列技 术，如 SCAR(sequence characterized amplified regions， 系列特征放大区)[38]、DAF(DNA Amplification Finger- printing，DNA 扩增指纹印迹)[39]、FRAPD(fluorescent RAPD，荧光随机扩增多态性)[40]、RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism，随机扩增微卫 星多态性)[41]等衍生技术得到了快速发展，有望成为未 来污泥微生物群落多样性研究的重要工具。 Copyright © 2012 Hanspub 16  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 6. 扩增片段长度多态性(AFLP) AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 技术是 1993年由荷兰Zabeau和Vos创建的结合 RFLP 和RAPD 技术特点的一种 DNA 指纹技术[42]。该方法 克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害和 RAPD 技术 稳定性差、标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有 RAPD 的高效性和 RFLP 的稳定性、可重复性的特点。 由于该技术产生的多态性远远超过了 RFLP、RAPD 等技术，已被认为是目前 DNA 指纹图谱技术中多态 性最为丰富的一项技术。 6.1. A FLP技术的特点 AFLP 技术的优点主要表现在：分析所需 DNA 量 少、可重复性好、多态性强、分辨率高、不需要 Southern 杂交、无放射性危害、样品适用性广、信息量大、结 果稳定可靠且呈典型的孟德尔遗传、可在全基因组产 生标记、理论上可产生的标记数目是无限的、对模板 浓度的变化不敏感、可作为物理图谱和遗传图谱的位 标等[43]。 但同时也存在着一些缺点，如：费用昂贵、必须 具有放射性同位素操作过程中特殊的防护措施以及 配套的仪器设备、对 DNA 纯度和内切酶的质量要求 高、难以鉴别等位基因、对模板反应迟钝和谱带可能 发生错配与缺失等问题。 6.2. A FLP技术的应用和发展 虽然该技术发展的时间较短，在许多领域的研究 尚处于起步阶段，但它所具有的诸多特点已显示出其 在众多领域的广阔应用前景[44]。 该项技术自产生以来在限制性内切酶组合、引物 设计、检测方法等方面有了较大改进，并发展衍生了 许多相关技术。其中限制性内切酶组合改进包括单限 制性酶切 AFLP(SADF-AFLP)[45]、三限制性酶切 AFLP (TE-AFLP)[46]等。多态性的检测已经由最初采用对环 境及人体有危害性的放射自显影技术发展到银染[47] 以及荧光检测技术[48]。 Bachem 等将 AFLP技术应用于 mRNA 表达差异 分析，发展了一种 mRNA 指纹图谱技术，即 cDNA- AFLP 技术，该法不需要知道基因或EST 的序列信息， 一次能够分析大量差异表达的基因，并能够检测出低 丰度表达的转录本，检测灵敏，主要用于基因家族等 高度同源性或相似性的基因片段的分离分析[49]。 7. 聚合酶链式反应–单链构象多态性 (PCR-SSCP) SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism) 技术是一种 DNA 标记技术。1989 年，日本科学家 Orita 将DNA 单链凝胶电泳技术成功的用于检测复杂基因 组中单拷贝 DNA 的多态现象并提出了SSCP 的概念， 即利用 DNA 单链构象具有多态性，在非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时迁移率的不同来分析 DNA 单链中的 基因突变[50]。Lee 等首先将SSCP 技术应用于微生物 群落组成的分析[51]。但该项技术在微生物群落结构解 析研究方面仍有待完善，不同研究者报道的试验条件 和结果有较大差异[52,53]。1989年，Orita 等作了大胆 改进，用敏感的银染法直接对电泳后的凝胶进行染 色，从而建立了PCR-SSCP 分析法，使检测突变方法 的简便性和灵敏性进一步提高[54]。 7.1. PCR-SSCP技术的特点 作为一种检测 DNA序列变异的手段，PCR-SSCP 法具有以下优点[55]：1) 可用非同位素方法检测，原理 和操作简单，PCR 产物变性后无需处理就可直接电 泳；2) 实验步骤少、周期短、对DNA 原始材料纯度 要求不高，需量少、成本较低；3) 适于大样本筛查， 无需事先知道待测 DNA 片段的序列，在测序之前可 采用该法筛选出需测序的 DNA 样本，避免盲目测序 带来的浪费；4) 可检测任何 DNA 位点上的多态性和 突变，灵敏性高。 但此项技术也有许多不足之处[56]：1) 只能作为一 种突变检测方法，不能对 DNA 序列变异进行精确的 定位，且随着 DNA 片段长度的增加，检测的敏感性 降低，而且应用中可能会遇到一定比例的假阴性结 果，因而该技术不能明确证明有没有突变；2) 分析结 果受电泳温度、离子强度等多种因素的影响，不同的 实验条件甚至可能导致完全不同的结果。 7.2. PCR-SSCP技术的应用和发展 PCR-SSCP 技术在废水生物治理、微生物多样性 检测和群落结构分析等方面都得到了广泛的应用。 该技术用于分析复杂环境微生物如活性污泥的 Copyright © 2012 Hanspub 17  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 群落结构时需要有针对性地优化操作条件。鲍立新等 针对厌氧活性污泥微生物群落结构复杂、群落中相似 基因序列较多等特点，对影响 SSCP图谱分辨率的电 泳温度、甘油、交联度和影响PCR 扩增的 BSA 等因 素进行了实验研究，通过条件优化，提高了 SSCP图 谱的分辨率和可读性，为解析厌氧活性污泥细菌群落 的结构提供了快速、重复性强、灵敏度高的手段[57]。 王爱杰等人也通过 SSCP技术，分析了活性污泥微生 物群落结构的条件优化，以获得较理想的SSCP 图谱[58]。 近年来，SSCP 技术在方法上得到了重大改进， 解决了检测稳定性差等缺陷，使操作简便性和检测灵 敏度大幅提高。此外，该项技术与DGGE、DNA 指 纹技术、RFLPs 技术等相结合，也可解决 PCR-SSCP 本身存在的缺点，提高检出率。 8. 应用展望 以活性污泥法为基础的污水处理工艺日益受到 人们的重视，越来越多的研究者开始把活性污泥作为 研究的热点问题。活性污泥中的微生物菌群随着现代 研究技术的发展逐渐被人们所认知。但是，我们目前 了解到的微生物菌群还远远不够，一些重要的菌群还 有待发现。近几年，随着分子生物技术的发展，人们 开始应用基于 PCR 技术等各种先进手段对活性污泥 中微生物菌群多样性进行探索。除了本文论述的 FISH 技术、DGGE/TGGE技术、T-RFLP 技术、RAPD 技术、 AFLP 技术、PCR-SSCP技术外，生物标记物法、SSR 技术、LH-PCR 技术、实时定量 PCR、ARDRA 技术、 宏基因组学等先进手段也在微生物菌群的研究中发 挥着重要作用。 目前来说，单一的研究方法已经基本趋于成熟， 但是每种技术都有其局限性，一些实验误差是不可避 免的。而综合运用多种层次上的组合技术可以在一定 程度上解决单一方法所带来的局限性，使实验结果更 加准确真实可靠。在研究污泥微生物菌群时，可以将 各种方法有机结合，这也是近年的新趋势，可以从不 同角度、不同层次上揭示污泥中微生物菌群的多样 性，为研究提供更为全面的信息。如 DGGE/TGGE、 SSCP 等技术可以探测到未知微生物的存在，通过切 胶、电泳等步骤可以获取未知微生物的染色体组DNA 库，应用 RFLP 技术进一步筛选主要的基因，根据这 些基因设计出针对未知微生物的特异性探针，就可以 通过 FISH 技术获知未知菌在污泥中的数量、形态、 分布状态等相关信息。 另一方面，研究者也可以针对各种技术的优缺 点，进行传统方法的改进和先进技术的探索，新的技 术手段将在环境微生物的研究中有更为广阔的应用 前景。 随着现代生物技术的发展，越来越多的新技术将 被运用于微生物菌群多样性的研究中，这对于将来更 好地利用活性污泥法具有十分重要的科学指导意义。 9. 致谢 本研究受广东省科技计划项目(2009B030801194， 2010B020413003)，中央高校基本科研业务费专项资 金(2010380003161543)，佛山市禅城区科技计划项目 (2010A1004)资助，在此表示感谢！ 参考文献 (References) [1] S. J. Giovannoni, E. F. Delong, G. J. Olsen, et al. Phylogenetic group specific oligodeocy nucleotide probes for identification of single microbial cells. Journal of Bacteriology, 1988, 170: 720- 726. [2] E. F. Delong, G. S. Wickham and N. R. Pace. Phylongenetic stains: Ribosomal RNA based probes for the identification of sin- gle microbial cells. Science, 1989, 65: 5554-5563. [3] G. J. Olsen, D. J. Lane, S. J. Giovannoni, et al. Microbial ecol- ogy and evolution: A ribosomal RNA approach. Annual Review Microbiology, 1986, 40(1): 337-365. [4] 李冰冰, 肖波, 李蓓. FISH技术及 其在环境微生物监测中的 应用[J]. 生物技术, 2007, 18(5): 94-97. [5] M. T. Wong, T. Mino, R. J. Seviourc, et al. In situ identification and characterization of the microbial community structure of full-scale enhanced biological phosphorous removal plants in Japan. Water Research, 2005, 39(13): 2901-2914. [6] A. Oehmena, M. T. Vivesa, H. B. Lu, et al. The effect of pH on the competition between polyphosphate accumulating organisms and glycogen-accumulating organisms. Water Research, 2005, 39(15): 3727-3737. [7] 呼庆, 齐鸿雁, 张洪勋. 荧光原位杂交技术及其在微生物生 态学中的应用[J]. 生态学报, 2004, 24(5): 1048-1054. [8] A. Cuadrado, P. Rubio, E. Ferrer, et al. Sequential combinations of C-banding and in situ hybridization and their use in the detec- tion of interspecific introgressions into wheat. Euphytica, 1996, 89(1): 107-112. [9] N. P. Carter, M. A. Ferguson-Smith, M. T. Perryman, et al. Re- verse chromosome painting: A method for the rapid analysis of aberrant chromosomes in cl inical cytogenet ics . Journal of M edical Genetics, 1992, 29(5): 299-307. [10] N. P. Carter. Cytogenetic analysis by chromosome painting. Cy- tometry, 1994, 18(1): 2-10. [11] H. Q. Heng, J. Squire and L.-C. Tsui. High-resolution mapping of mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proceeding of National Academy of Science USA, 1992, 89(20): 9509-9513. [12] P. Komminoth, M. Werner. Target and signal amplification: Ap- Copyright © 2012 Hanspub 18  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 proaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. His- tochemistry and Cell Biology, 1997, 108(4-5): 325-333. [13] K. Zwrglmaier, W. Ludwing and K. H. Schleifer. Recognition of individual genes in a single bacterial cell by fluorescence in situ hybridization-RING-FISH. Molecular Microbiology, 2004, 51(1): 89-96. [14] P. H. Nielsen, K. Andreasen, M. Wagner, et al. Variability of type 021N in activated sludge as determined by in situ substrate uptake pattern and in situ hybridization with fluorescent rRNA targeted probes. Water Science and Technology, 1998, 37(4-5): 423-440. [15] J. Ahn, T. Daidou, S. Tsuneda, et al. Characterization of denitri- fying phosphate accumulating organisms cultivated under dif- ferent electron acceptor conditions using polymerase chain reac- tion-denaturing gradient gel electrophoresis assay. Water Research, 2002, 36(2): 403- 412. [16] S. G. Fischer, L. S. Lerman. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory. Proceeding of National Academy of Science USA, 1983, 80(6): 1579-1583. [17] R. M. Myers, S. G. Fischer, L. S. Lerman, et al. Nearl y all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Research, 1985, 13: 3131-3145. [18] G. Muyzer, E. C. Waal and A. G. Uitterlinden. Profiling of com- plex microbial populations by denaturing gradient gel electro- phoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes encoding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbi- ology, 1993, 59: 695-700. [19] M. J. Ferris, G. Muyzer and D. M. Ward. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA defines populations inhab- iting a hotspring microbial mat community. Applied and Envi- ronmental Microbiology, 1992, 62: 340-346. [20] T. Vallaeys, E. Topp, G. Muyzer, et al. Evaluation of denaturing gradient gel electrophoresis in the detection of 16S rDNA se- quence variation in rhizobia and methanotrophs. FEMS Micro- biology Ecology, 1997, 24: 279-285. [21] H. Sekiguchi, N. Tomioka, T. Nakahara, et al. A single band does not always represent single bacterial strains in denaturing gradient gel electrophoresis analysis. Biotechnology Letters, 2001, 23: 1205-1208. [22] 刘新春等. PCR-DGGE 法用于活性污泥系统中微生物群落变 化的解析[J]. 生态学报, 2005, 25(4): 842-847. [23] 李黎, 张松贺, 王超. 污水处理厂活性污泥细菌多样性研究 [URL], 2011. http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/ 201101-1046 [24] A. Samantha, L. Morris and S. Radajewski. Identification of the function ally active methanotroph population in apeat soil mi- crocosm by stable isotope probing. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(3): 1446-1453. [25] 曾薇等. 采用 FISH、DGGE 和Cloning对短程脱氮系统中硝 化菌群的比较分析[J]. 环境科学学报, 2006, 26(5): 734-739. [26] 邢德峰, 任南琪, 宋业颖等. DG-DGGE分析产氢发酵系统微 生物群落动态及种群多样性[J]. 生态学报, 2005, 25(7): 1818- 1823. [27] W. T. Liu, T. L. Marsh, G. H. Cheng, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment 1ength po1ymorphisms of genes encoding 16S rRNA. App1ied Environmental Microbiology, 1997, 63(11): 4516-4522. [28] 罗剑飞等. T-RFLP技术及其在硝化细菌群落分析中的应用[J]. 微生物学通报, 2008, 35(3): 456-461. [29] 余素林, 吴晓磊, 钱易. 环境微生物群落分析的 T-RFLP 技术 及其优化措施[J]. 应用与环境生物学报, 2006, 12(6): 861- 868. [30] M. Eschenhagena, M. Schupplerb. Molecular characterization of the microbial community structure in two activated sludge sys- tems for the advanced treatment of domestic effluents. Water Research, 2003, 37(13): 3224-3232. [31] 王晓慧, 文湘华, 丁鵾, 张辉, 周军. T-RFLP方法分析城市污 水处理厂中细菌群落的动态变化[J]. 环境科学, 2010, 31(5): 1307-1312. [32] H. L. Ayala-del-Río, S. J. Callister, C. S. Criddle, et al. Corre- spondence between community structure and function during s uc - cession in phenol and pheno l-p1us-trichloroethen e-fed se q u e n c i n g batch reactors. App1ied Environ mental Microbiology, 2004, 70(8) : 4950-4960. [33] J. G. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak, et al. DNA polymor- phisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic ma rk- ers. Nucleic Acids Research, 1990, 18(22): 6531-6534. [34] J. Welsh, M. Mcclelland. Fingerprinting genomes using PCR with arbituary primers. Nuc leic Acids Research, 1990, 18(24): 7213- 7218. [35] 白生文, 范惠玲. RAPD标记技术及其应用进展[J]. 河西学院 学报, 2008, 24(2): 52-54. [36] 刘晓宇. RAPD分子标记技术概述及应用[J]. 科技创新与生 产力, 2010, 9: 98-99. [37] 姜自锋, 林乃铨, 徐梅. RAPD技术及其应用中的一些问题[J]. 福建农林大学学报, 2002, 31(3): 356-360. [38] 张志永, 张劲松, 巩学千等. 抗SMV 栽培大豆种质资源的 SCAR 标记指纹图谱分析[J]. 高技术通讯, 1998, 8(10): 49-53. [39] J. Basam, P. M. Gresshoff. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio Tech- nology, 1991, 9: 553-557. [40] S. G. Coply. Efficient detection of DNA poly morphisms by fluorescent RAPD analysis. Biotechniques, 1999, 22(4): 690-692, 694, 696. [41] J. Ramser, K. Weising, C. Viktor, et al. Increased informative- ness of RAPD analysis by detection of microsatellite motifs. Biotechniques, 1997, 23(2): 285-290. [42] M. Zabeau, P. Vos. European Patent Application 92402629. (Pu b- lication number: 0534858 A), 1992. [43] 李珊, 赵桂仿. AFLP分子标记及其应用[J]. 西北植物学报, 2003, 23(5): 830-836. [44] 王世伟等. AFLP技术在微生物分类鉴定、基因标定及遗传多 样性方面的应用[J]. 生物技术, 2003, 13(5): 42-43. [45] K. S. Boumedine, A. Rodolakis. AFLP allows the identification of genomic markers of ruminant Chlamydia psittaci strains use- ful for typing and epidemiological studies. Research in Microbi- ology, 1998, 149(10): 735-744. [46] A. W. G. Wurff, Y. L. Chan, N. M. Straalen, et al. TE-AFLP: Combining rapidity and robustness in DNA fingerprinting. Nu- cleic Acids Research, 2000, 28(24): 105. [47] 万春玲, 谭远德. AFLP的一种改进方法[J]. 南京师大学报, 1999, 22(2): 88-91. [48] M. T. Cervera, J. C. Cabezas, J. C. Sancha, et al. Application of AFLPs to the characterization of grapevine (Vitis vinifera L.) genetic resources. Theoretic and Applied Genetics, 1998, 9 7(1 -2) : 51-59. [49] C. W. Bachem, et al. Visualization of differential gene expres- sion using a novel method of R NA fingerprinting based on AFLP : Analysis of gene expression during potato tuber development. Plant Journal, 1996, 9(5): 745-753. [50] M. Orita, H. Iwahana, H. Kanazawa, et al. Detection of poly- morphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-st ran d conformation polymorphisms. Proceeding of National Academy of Science USA, 1989, 86(8): 2766-2770. [51] D. H. Lee, Y. G. Zo and S. J. Kim. Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by PCR- single-strand-conformation polymorphism. Applied and Envi- ronmental Microbiology, 1996, 62(9): 3112-3120. [52] C. L. Zhang, Y. H. Wang, H. Chen, et al. Enhance the efficiency of single-strand conformation polymorphism analysis by short polyacrylamide gel and modified silver staining. Analytical Bio- chemistry, 2007, 365(2): 86-287. [53] 杨志惠, 周斌, 贾静等. PCR-SSCP分析参数的研究[J]. 沪州 医学院学报, 2005, 28(5): 391-393. Copyright © 2012 Hanspub 19  分子生物技术在污泥微生物群落多样性研究中的应用 Copyright © 2012 Hanspub 20 [54] M. Orita, H. Iwahana. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation poly- morphisms. Proceeding of National Academy of Science USA, 1989, 86: 2766-2770. [55] 汤贤春, 路健, 李学英. PCR-SSCP 技术在基因多态分析中的 应用[J]. 中国西部科技, 2010, 9(6): 55-56. [56] 王岩, 沈锡权, 吴祖芳等. PCR-SSCP技术在微生物群落多态 性分析中的应用进展[J]. 生物技术, 2009, 13(9): 84-87. [57] 鲍立新, 李建政, 赵焱, 郑国臣. 厌氧活性污泥微生物群落的 SSCP 分析条件优化[J]. 科技导报, 2008, 26(2): 28-32. [58] 王爱杰, 阚洪晶, 于振国等. SSCP技术分析活性污泥微生物 群落结构的条件优化及检验[J]. 微生物学通报, 2008, 35(7): 1164-1169. |