 Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 45-49 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.21008 Published Online March 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp) Research of Determination Conditions and Enzyme Stability of Arthrospira SOD* Yulan Bao1, Shuyuan Li1,2, Chen Qiao1,3 1Inner Mongolia Ordos Xinyuli Spirulina Industry Group, Ordos 2Inner Mongolia Normal University, Hohot 3Inner Mongolia Kasetsart University, Hohot Email: bapyulan.happy@163.com Received: Nov. 11th, 2011; revised: Dec. 3rd, 2011; accepted: Dec. 21st, 2011 Abstract: To obtain the basic data of extracting and purifying the SOD enzyme preparation from Arthrospira, the de- termination conditions and enzyme stability of Arthrospira SOD in alkaline lake in Erdos plateau were studied by the method of pyrogallol auto-oxidation. The results showed that SOD met its ultimate absorption at 320 nm in UV area. The optimum pH in Tris-HCl buffer was 8.2 and its optimum temperature is 25˚C. This enzyme remained stable in the range of pH = 6 - 10. Its activity began to fall over 40˚C when the enzyme was preserved at different temperature for 20 min, and to fall over 35˚C for 60 min. Enzyme activity began to decline after 2 days and almost nothing at the seventh day at room temperature in light. Its activity lost absolutely at the ninth day when the enzyme was stored at room tem- perature without light. Keywords: Arthrospira; SOD; Pyrogallol Auto-Oxidation; Determination Conditions; Enzymes Stability 钝顶节旋藻 SOD 活性测定条件及稳定性的研究* 包玉兰 1，栗淑媛 1,2，乔 辰1,3 1鄂尔多斯市新宇力藻业集团有限公司，鄂尔多斯 2内蒙古师范大学，呼和浩特 3内蒙古农业大学，呼和浩特 Email: baoyulan.happy@163.com 收稿日期：2011年11月11 日；修回日期：2011 年12 月3日；录用日期：2011 年12 月21日 摘 要：采用邻苯三酚自氧化法研究了鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻 SOD活性的测定条件以及酶的稳定性，为 进一步从钝顶节旋藻中提取、纯化SOD 酶制剂提供可参考的基础数据。结果显示，SOD 在紫外光区 320 nm 处 有最大吸收值；在Tris-HCl 缓冲溶液中最适pH 值为 8.2，最适温度为25℃。该酶的 pH 值稳定性范围为 6~10； 在不同温度下保温 20 min时，高于 40℃时酶活性开始下降，保温60 min时，高于 35℃时酶活性开始下降；室 温下存放2 d 后活性开始下降，7 d 时活性基本丧失；室温下避光保存9 d时SOD 活性完全丧失。 关键词：钝顶节旋藻；超氧化物岐化酶(SOD)；邻苯三酚自氧化法；测定条件；酶稳定性 1. 引言 钝顶节旋藻(Arthrospira plaensist)是一种光合自 养的原核生物，属于蓝藻门(Cyanopyta) 、颤藻科 (Oscillatoriaceae)、节旋藻属(Arthrospira)[1]，习 惯 上又 被称作钝顶螺旋藻。1996 年内蒙古农业大学螺旋藻课 题组首次在鄂尔多斯高原碱湖发现了天然生长的钝 顶节旋藻，其形成的水华完全能够被螺旋藻产业利 用，打破了我国螺旋藻养殖业一直使用引进藻种的历 *基金项目：国家自然科学基金(批准号：30460104)。 Copyright © 2012 Hanspub 45  钝顶节旋藻 SOD 活性测定条件及稳定性的研究 史。节旋藻含有藻多糖、藻蓝蛋白、γ-亚麻酸、胡萝 卜素、多种氨基酸、超氧化物岐化酶等多种生理活性 物质，因而被世界卫生组织和联合国粮农组织称为 “21 世纪人类最佳保健品和最理想的食品”[2]。 生物体代谢活动中会产生活性氧，活性氧过多的 累积会引起人体包括癌症等许多疾病，正常情况下， 人体内活性氧的产生和清除处于一种动态平衡，SOD 是生物体内抗氧化系统的重要酶。该酶可以清除体内 多余的超氧阴离子，具有抗辐射、防衰老以及防治肿 瘤和抗炎等药用功效[3]。钝顶节旋藻细胞内的Fe-SOD 活性高，其良好的开发应用前景激发了人们广泛的研 究热情。测定 SOD 活性的方法很多，目前邻苯三酚 自氧化法因仪器简单、操作简便被广泛应用，但其测 定条件对测定结果影响很大。本文采用邻苯三酚自氧 化法不仅测定了鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻粗酶 液SOD 的活性，并对其测定条件进行了摸索，建立 了稳定的测定系统，同时对该酶的稳定性进行了研 究，以期进一步对鄂尔多斯高原碱湖钝顶节旋藻 SOD 的开发利用提供可参考的基础数据。 2. 实验材料与方法 2.1. 材料 实验材料为钝顶节旋藻，从鄂尔多斯高原察汗淖 尔碱湖中采集，经分离纯化后用Zarrouk 培养液于室 温下每间隔 1 h 通空气15 min 进行培养，于对数生长 期取材。 2.2. 方法 2.2.1. SOD粗酶液的制备 捞取新鲜节旋藻样品，用蒸馏水冲洗数次，滤纸 吸取多余水分。按每克鲜藻加入50 mmol/L、pH 7.8 磷酸缓冲溶液4 mL，在冰浴中超声波破碎，破碎条件 为功率 60 w，超声 1 s，间隔 2 s，共超声 15 min。再 将破碎液在 4℃、10000 × g 下离心20 min，取上清液 备用。 2.2.2. 邻苯三酚自氧化速率的测定 按李永利等[4]的方法测定邻苯三酚自氧化速率， 略有改动。在试管中加入25℃保温 20 min 的Tris-HCl 缓冲液(45 mmol/L、pH 8.2) 4.5 mL，再加25℃预热过 的0.01 mL邻苯三酚溶液，迅速摇匀倒入比色皿中， 空白对照用 0.01 mL、10 mmol/L HCl代替邻苯三酚， 用岛津 UV-1800 紫外可见分光光度计在320 nm波长 处每隔 0.5 min 测一次 A值，连续测定 4 min。 波长选择：用分光光度计对邻苯三酚自氧化反应 在2 min、4 min、6 min、8 min、10 min 时的初始中间 产物进行波长扫描，确定吸收峰。 浓度选择：通过控制加样量使反应体系的邻苯三 酚溶液终浓度达到 0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.15 mmol/L、0.20 mmol/L、0.25 mmol/L、0.30 mmol/L、 0.35 mmol/L、0.40 mmol/L、0.45 mmol/L、0.50 mmol/L、 0.55 mmol/L、0.60 mmol/L、0.65 mmol/L、0.70 mmol/L、 0.75 mmol/L、0.80 mmol/L，测其自氧化速率与时间的 线性关系。 2.2.3. 酶活性的测定 按邻苯三酚自氧化速率测定方法测定酶活性。先 加入 0.01 mL粗酶液，再加 0.01 mL预热过的邻苯三 酚溶液，空白对照用蒸馏水代替粗酶液，在 320 nm 处测 A值，共测定 4 min。酶活力单位定义为：1 mL 反应液中1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的 酶量为一个活力单位(U)。单位体积中的酶活力(U/mL) 按下式计算： 320nm 320nm 320nm Amin Bmin 50% Amin 单位体积活力 = 酶样液稀释倍数 反应液总体积 酶样液体积 (A320nm/min 为邻苯三酚自氧化速率，B320nm/min 为SOD 抑制下的邻苯三酚自氧化速率，邻苯三酚自氧化速率 需控制在0.07 OD/min 左右)。 2.2.4. 酶的动力学研究 2.2.4.1. 温度对酶活性的影响及其热稳定性研究 在0℃~70℃范围内(间隔5℃)，于不同温度下分 别测定 SOD 活性，观察温度对酶的影响，确定酶的 最适温度。 将酶液在 0℃~70℃(间隔5℃)范围内分别保温20 min 和60 min，再在最适温度下测其活性，确定酶的 热稳定性，每项测定至少重复3次。 2.2.4.2. pH 对酶活性的影响及其稳定性 在pH 6.8、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、 8.6、8.8、9.0 的磷酸盐-Tris-HCl 缓冲液中分别测定 Copyright © 2012 Hanspub 46  钝顶节旋藻 SOD 活性测定条件及稳定性的研究 SOD 活性，观察 pH 对酶的影响，确定其最适 pH。 酶液分别在 pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11的柠檬酸–磷酸二氢钾–巴 比妥缓冲液[5]中保温1 h，然后在 25℃下测定其酶活 性，确定酶的pH 稳定性，每项测定至少重复 3次。 2.2.4.3. 酶的时间稳定性 将酶液分别放置在室温、自然光照下和室温、避 光条件下保存，每天定时在 25℃，pH 8.2 的Tr is-HCl 缓冲体系测其活力，每项测定至少重复 3次，观察其 时间稳定性。 3. 结果与分析 3.1. 邻苯三酚自氧化速率的条件 3.1.1. 波长 图1显示，邻苯三酚反应初始中间产物吸收值随 时间的增加而增大，但吸收峰一直在320 nm处，故 测定邻苯三酚自氧化速率时波长应选择为320 nm。 3.1.2. 邻苯三酚浓度的选择 从图 2看出，邻苯三酚自氧化速率随着反应体系 终浓度的增加而变大，终浓度 < 0.2 mmol/L时，其自 氧化速率与时间呈线性关系( = 0.9979、 = 0.9974、 = 0.9950)；终浓度 > 0.2 mmol/L时， 其自氧化速率与时间的线性相关程度降低，随时间的 延长逐渐趋于抛物线(R2 ≤ 0.9937)，且终浓度越大这 种变化趋势越明显。因此，用邻苯三酚自氧化法测定 SOD 活性时终浓度应不超过0.2 mmol/L。 2 0.05 R2 0.10 R 2 0.15 R 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 200 300 400 50 0 波长/nm 吸收值 2min 4min 6min 8min 10min Figure 1. Scan on the wavelenth of the Intermediate fr om the pyrogallol autoxidation 图1. 邻苯三酚自氧化中间产物的波长扫描 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.51.0 1.52.0 2.5 3.03.5 4.0 时间/min 吸收值 0.05mmol/L 0.10mmol/L 0.15mmol/L 0.20mmol/L 0.25mmol/L 0.30mmol/L 0.35mmol/L 0.40mmol/L 0.45mmol/L 0.50mmol/L 0.55mmol/L 0.60mmol/L 0.65mmol/L 0.70mmol/L 0.75mmol/L 0.80mmol/L Figure 2. The pyrogallol autoxidation rate at different final con- 图2. 在不同终 酚自氧化速率 3.2. SOD动力学研究 3.2.1. 温度对 SOD 活性的影响及其热稳定性 (图 3A)。 说明较高 3C 呈半梯形图，在0~35℃(40℃)范围 内，S 3.2.2. pH对SOD 活性的影响及其 pH 稳定性 (图4 大于 SOD 活性基本稳定， pH < centrations 浓度下邻苯三 温度对钝顶节旋藻 SOD 的影响呈钟罩形曲线 0℃时，SOD 活性维持较高水平；<25℃时，SOD 活性随温度的升高而增加；>25℃时，随温度的升高 SOD 活性减小；25℃时SOD 活性达到最高，为 162 U/mL。低于 25℃时SOD活性的变化比高于 25℃时 SOD 活性变化较为缓慢，温度对 SOD 影响 比较明显。 图3B 和图 OD 的活性较稳定；>35℃(或40℃)时SOD 活性 开始几乎呈线性下降，65℃(或70℃)时SOD 活性丧 失；其中，保温60 min与20 min 相比，SOD活性开 始下降点和活性消失点均低 5℃。表明，酶在高温水 浴里保温的时间越长，SOD稳定性越差。 pH 对钝顶节旋藻SOD 的影响曲线也呈钟罩形 A)。由图可知，SOD 的活性在 Ph 8.2时达到最 大值，缓冲溶液的 pH值在 8.2 以下时酶的活性随着 pH 的增大而升高， 8.2 时随着 pH的增大而降低， 确定此酶的最适pH 为8.2。 图4B 显示，pH 6~10 之间 6 时，随着缓冲溶液的 pH 增大 SOD 活性逐渐增 加，pH > 10时酶活力呈线形下降，pH 13时SOD 活 性完全丧失。 Copyright © 2012 Hanspub 47  钝顶节旋藻 SOD 活性测定条件及稳定性的研究 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0510 15 20 2530 35 4045 50 5560 65 70 温度/℃ 活性/(U/mL) 0 20 40 60 80 100 相对活性/% A B C Figure 3. Effect of temperature on SOD activity and thermal sta- bility 图3. 温度对 SOD活性的影响(A)及其热稳定性(B、C)曲线 B：保 C：保温20 m in；温60 min 0 20 40 60 80 100 120 140 160 3.0 5.0 6.8 7.2 7.6 8.0 8.4 8.8 9.2 10.0 12.0 pH 活性/(U/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 相对酶活性/% A B Figure 4. Effect of pH on SOD activity and pH stability 图 3.2.3. 酶的时间稳定性 藻SOD 活性的时间稳定性 曲线 活性的测定是建立在邻苯三酚自氧化的基 础上 4. pH对SOD 活性的影响(A)及其 pH稳定性(B)曲线 图5显示，钝顶节旋 是半梯形图，粗酶液在室温、自然光照下放置2 d 后SOD 活性呈线性下降，第6 d时SOD活性只剩 20%，7 d 时其活性完全丧失；而室温、避光保存时， SOD 活性 4 d后才开始下降，第9 d 时SOD 基本无活性。 4. 讨论 SOD ，对 SOD 粗酶液性质的测定结果显示其最适温 度为 25℃、最适pH 为8.2，因而测定邻苯三酚自氧 化速率条件选择了 25℃和pH 8.2，这与多数文献[3,4,6,7] 报道的一致。但波长扫描结果显示，邻苯三酚的最大 吸收波长为 320 nm，这与刘华等[6]和孙雪奇等[7]报道 的测定波长一致，比许亚娟等[3]和李永利等[4]报道的 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 123456789 时间/d 相对酶活性/% 室温保存 室温避光保存 Figure 5. Time stability of SOD activity 定波长 325 nm要低，可能和实验环境不同或与仪 斯高原碱湖钝顶节旋藻 SOD 的最 适温 文超等在测定乍得湖钝顶螺旋藻纯酶液的温 度稳 H 6.8 时， 钝顶螺旋藻是纯天然耐低温、 图5. SOD活性的时间稳定性 测 器的差异有关。 本文对鄂尔多 度和 pH 值的测定与夏文超[8]和韩文清[9]等人对 乍得湖钝顶螺旋藻(严格讲也是钝顶节旋藻)测定的结 果一致，表明这两种藻虽然原产地不同，但毕竟属同 一物种，其SOD 的很多性质如最适温度和pH 是一致 的。 夏 定性提出，酶活性在不同温度下保温10 min 时， 55℃以下活性基本稳定，温度升高至60℃时酶活力开 始下降。本文研究结果显示，将粗酶液在 55℃保温 20 min 和60 min 时SOD 活性仅剩57%和20%。分析 结果不同的原因：一是 SOD 活性除了与保温温度有 关以外还与保温时间的长短有关，在较高温度下保温 的时间越长其活性消失的会越快；其次乍得湖钝顶螺 旋藻原产地属于亚热带，其耐热性要比鄂尔多斯高原 碱湖钝顶节旋藻强；还可能与所用 SOD 样品有关， 提纯的酶液含杂质少，热稳定性比粗酶液强。 测定 pH对SOD活性影响时(图4A)，在p 测出的 SOD 的活性几乎为 0，而从 SOD的pH 稳定性曲线(图4B)可看出，pH 在6~7 时SOD 活性较 高，由此推测，pH 6.8的偏酸环境下SOD 仍具有活 性，只是邻苯三酚的自氧化受到影响，导致测定结果 为0。这也与文献[10]报道的邻苯三酚在酸性条件非常 稳定这一结果相符。 鄂尔多斯高原碱湖 Copyright © 2012 Hanspub 48  钝顶节旋藻 SOD 活性测定条件及稳定性的研究 Copyright © 2012 Hanspub 49 广温 参考文献 (References) ]. 上海: 上海科学技术出版 螺旋藻铁型超氧化物歧化酶 研究[J]. 中 自氧化法测定 SOD 活性 湖钝顶螺旋藻 SOD 氧化物歧化酶——邻苯三酚自氧化测活方法的改 源[J]. 型藻种[11]，为北方节旋藻产业的发展奠定了基 础，本文的实验结果为进一步分离纯化 SOD 提供了 可参考的基础资料。 [1] B. 福迪. 罗迪安, 译. 藻类学[M 社, 1980: 24. 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