 Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2012, 2, 15-18 http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2012.22004 Published Online April 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjbm) Construction of a T7 Phage Display cDNA Library from Lung Cancer of Smokers Wen Xue1, Li Zhong1,2*, Xianji an g Kang1, R ui Wang3 1College of Life-Science, Hebei University, Baoding 2College of Osteopathic Medicine, Pomona, USA 3The Fourth Clinical Medical College of Hebei Medical University, Shijiazhuang Email: xw568525@126.com, *lee_z@yahoo.com Received: Jan. 13th, 2012; revised: Feb. 10th, 2012; accepted: Feb. 13th, 2012 Abstract: Objective: To screen tumor markers of smokers, the T7 phage display cDNA library from the lung cancer of smokers was constructed. Methods: The mRNA was isolated from total RNA extracted from the lung cancer of smokers by RNeasy Mini Kit, and was used to synthesize double strain (ds) cDNA by the reverse transcription. Then the directional EcoRI/HindIII linkers were liquated into the ends of ds cDNA and the ds cDNA was further digested with EcoRI and HindIII, which resulted in ds cDNA with EcoRI and HindIII ends. The digested ds cDNA fragments longer than 300 bp in length were fractionated by Mini Column, and then liquated into the T7 Select 10-3b vertor with EcoRI and HindIII ends. After packaging in vitro, the T7 Select 10-3b vertor was tansformed into BLT5615 to construct the T7 phage display cDNA library. Results: Analysis showed that the library contained 1.35 × 106 clones and the titer of the applied library was 4.4 × 1010 pfu/ml. The PCR identification results of 100 clones picked at random showed that 97% clones were recombinant and 91% of recombinant clones contained cDNA fragments longer than 300 bp in length. Conclusion: A T7 phage display cDNA library from the lung cancer of smokers is successfully constructed. Keywords: Lung Cancer; Phage Display; cDNA Library; Smokers 吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA文库构建 薛 雯1，钟 理1,2*，康现江 1，王 瑞3 1河北大学生命科学学院，保定 2 College of Osteopathic Medicine, Pomona, USA 3河北医科大学第四医院，石家庄 Email: xw568525@126.com, *lee_z@yahoo.com 收稿日期：2012 年1月13 日；修回日期：2012年2月10日；录用日期：2012 年2月13 日 摘 要：目的：为筛选吸烟人群中早期肺癌肿瘤标志物，构建吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体展示 cDNA 文库。方 法：用RNeasy Mini Kit 提取吸烟者肺癌组织总RNA，分离纯化 mRNA，逆转录合成双链 cDNA，经末端修饰、 定向 EcoRI/HindIII 接头连接、接头消化，使其两端分别带有 EcoRI 和HindIII 粘性末端。用 Mini Column分离 cDNA 片段，收集 300 bp以上的双链 cDNA，与 T7Select 10-3b载体连接，体外包装后，以 BLT5615 为受体菌 得到吸烟者肺癌组织 T7噬菌体展示 cDNA 文库。结果：经测定，库容为 1.35 × 106 pfu，扩增后文库滴度为 4.4 × 1010 pfu/ml。PCR鉴定从原始文库中随机挑取的100 个噬菌斑，重组率为 97%，重组体中 91%的插入片段长度 >300 bp。结论：成功构建了吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库，为下一步筛选吸烟人群中早期肺癌肿瘤标 志物奠定基础。 关键词：肺癌；噬菌体展示；cDNA 文库；吸烟者 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 15  吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库构建 Copyright © 2012 Hanspub 16 1. 引言 肺癌是严重危害人类生存和健康的恶性肿瘤之 一，全球每年死于肺癌的人数达 100多万，并且有明 显上升趋势。大量系统的流行病学调查资料和科学实 验证明，肺癌与吸烟的关系最为密切[1]。在吸烟诱导 肺部恶变过程中，细胞会产生新抗原及过度表达的抗 原，从而激发机体的免疫应答。在肺癌早期，肿瘤抗 原水平很低，利用常规蛋白检测方法无法检测到时， 免疫系统就能监测到特异蛋白的存在，引发免疫反 应，产生大量的抗体。因此，可以通过检测血清中自 身抗体含量来进行肺癌的早期诊断。噬菌体展示技术 是一种将外源蛋白或多肽基因与噬菌体特定蛋白基 因在其表面进行融合表达的新技术[2]。利用这一技术 将病人的异常基因融合表达为异常蛋白，并借助蛋白 质芯片的高通量筛选和抗原抗体特异性结合原理来 确定肿瘤标志物[3]。噬菌体展示与蛋白质芯片相结合 的技术已经在肿瘤标志物筛选方面取得了很大的成 功[4]。为筛选吸烟人群中早期肺癌肿瘤标志物，我们 构建了吸烟者肺癌组织 T7噬菌体展示 cDNA 文库。 2. 材料和方法 2.1. 材料 3例肺癌组织由河北医科大学第四医院提供，均 为男性吸烟患者，处于 III、IV 期。RNeasy Mini Kit 购自 QIAGEN 公司；PolyATtract® mRNA Isolation System III 购自 Promega 公司；Orient Express Random Primer cDNA Synthesis Kit，T7Select10-3b Cloning Kit，Mini Column Fractionation Kit购自Novagen 公司。 2.2. 方法 2.2.1. 总RNA 的提取和 mRNA 分离纯化 从RNAlater 保存的组织中剪取一块不大于 30 mg 的组织(本实验)，根据 RNeasy Mini Handbook 进行 RNA 提取，最后用 RNase-free Water 洗脱，得到总 RNA。凝胶电泳检测总 RNA质量，紫外分光光度法 检测总 RNA 的浓度，并分析其纯度。根据 PolyATtract® mRNA Isolation System III说明书从上述总 RNA 中分 离纯化 mRNA ，用真空冷冻干燥机将其冻干，加入 10 µL RNase-free Water重溶。凝胶电泳检测 mRNA 质量， 紫外分光光度法检测 mRNA 的浓度，并分析其纯度。 2.2.2. cDNA双链合成及 cDNA 与EcoR1/HindIII接 头连接 按照 Orient Express Random Primer cDNA Synthesis Kit 说明书取 4 µg的mRNA 作为模板，加入1 µg的 HindIII Random Primers，在逆转录酶 MMLV 的作用 下合成 cDNA 第一条链。在第一条链的反应体系中加 入1.6 U RNaseH，再加入 50 U DNA Polymerase I和 甲基化 dNTP，合 成cDNA 第二链。苯酚抽提反应物， 异丙醇沉淀，溶于 10 µLTE。向上述合成的双链 cDNA 溶液中加入 1.5 U T4 DNA Polymerase补平双链 cDNA 末端。取上述末端补平的双链 cDNA10 µL，加入2 µL Directional EcoRI/HindIII Linkers，在 T4 DNA 连接酶 的作用下 16 ℃连接过夜。然后分别加入 EcoRI和 HindIII 各100 U，37℃温育 2 h消化接头，得到两端 分别带有 EcoRI 和HindIII 粘性末端的双链 cDNA。 2.2.3. cDNA片段大小分离 按照 Mini Column Fractionation Kit 操作说明书， 将上述消化产物上样于 Mini Column，对 cDNA 片段 进行分离，去除未连接的接头及小片段cDNA ，收集 长度在 300 bp 以上的双链 cDNA。 2.2.4. cDNA与T7Selec10-3b 载体连接及体外包装 根据 T7Select® System Manual将上述分离得到的 cDNA 与T7Select10-3b Vector Arms按照摩尔比3:1 混 合，在 T4DNA 连接酶的作用下，16℃连接过夜。取 连接产物 5 µL 与25 µL 包装蛋白混合，22℃温育 2 h， 加入 270 µL 灭菌的 LB 终止反应，得到大量具有感染 性的 T7 噬菌体颗粒。加入 20 µL 氯仿，4℃保存，并 测其滴度。 2.2.5. T7噬菌体展示文库的鉴定 根据 T7Select® System Manual对T7 噬菌体展示 文库进行鉴定。 2.2.5.1. 文库容量测定 将宿主菌 BLT5615 接种于 LB 培养液，37℃摇床 培养至 OD = 1。取 10 µL 的包装产物用灭菌 LB稀释 1 × 102~1 × 106倍。每个梯度取 100 µL，与 250 µL 宿 主菌、3 mL 预热的上层培养基混合，铺于已加入羧卞 青霉素的琼脂平板上，37℃倒置培养 3~4 h，待长出 清晰的噬菌斑时，计算文库库容。  吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库构建 2.2.5.2. 文库重组率的测定 用灭菌牙签从原库滴度测定平板上随机挑取单 个噬菌斑，加入 100 µL、10 mmol/L EDTA中，短暂 震荡后，65℃热击 10 min，冷却至室温后，14,000 g 离心 3 min，取上清2 µL 作为模板，加入试剂盒中的 T7 上下游引物进行PCR 扩增。扩增条件为 94℃预变 性5 min；94℃ 50 s，50℃ 1 min，72℃ 1 min 10 s， 35 个循环；72℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测 文库插入片段大小，并计算重组率。 2.2.5.3. 文库扩增 将包装产物适当稀释，与宿主菌液混合，铺板培 养，待长出噬菌斑后，加入噬菌体提取缓冲液，4℃ 存贮过夜。次日收集噬菌体提取缓冲液，加入氯仿， 离心后收集上清。取10 µL上清，按上述方法测定扩 增后噬菌体展示文库的滴度。在扩增产物中加入 1/10 体积 80%灭菌甘油，分装后–70℃保存。 3. 结果 3.1. 总RNA 的提取和 mRNA 的分离结果 用RNeasy Mini试剂盒从吸烟者肺癌组织中提取 总RNA，经紫外分光光度法检测，产量为 400 µg， OD260/OD280 = 1.9，说明提取的 RNA 纯度较高，1% 琼脂糖凝胶电泳显示，28S 和18S rRNA 条带均清晰， 说明提取的总 RNA 质量好，未发生降解。 分离纯化的 mRNA 产量为 5.3 µg，收率为 1.33%， OD260/OD280 = 2.12，1%琼脂糖凝胶电泳图可看出 mRNA 呈弥散状，分布均匀。表明分离的 mRNA质 量较高，可以进行 cDNA 的合成。 3.2. T7噬菌体展示文库质量鉴定 文库稀释后，经噬菌斑测定，原始文库的库容为 1.35 × 106 pfu，扩增后文库的滴度为 4.4 × 1010 pfu。 对随机挑取的 100 个噬菌斑进行 PCR 检测，文库的重 组率为 97%，重组体中 91%的插入片段长度>300 bp， 说明所建文库质量较高。 Figure 1. Total RNA isolated from lung cancer tissue of smokers 图1. 吸烟者肺癌总 RNA电泳结果 Figure 2. Agarose gel electrophoresis of mRNA 图2. mRNA电泳图 Figure 3. PCR analysis of random plaques from T7 phage display cDNA library 图3. cDNA文库随机克隆的 PCR 结果 Copyright © 2012 Hanspub 17  吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体 cDNA 文库构建 4. 讨论 构建高质量的 cDNA文库的关键环节是要获取高 质量完整的 mRNA 并通过有效途径制备全长双链 cDNA。由 于RNA 酶广泛存在，并使 RNA 容易降解， 所以必须要保证操作环境无 RNA酶的污染。本文采 用试剂盒提取400 µg 高质量完整的总RNA，通过 PolyATtract® mRNA Isolation System III 纯化得到5 µg mRNA，高于合成 cDNA 所要求的起始量4 µg，可以 进行下一步合成反应。使用 Mini Column Fractionation 分离 cDNA 片段，去掉多余的接头和小片段，短片段 太多会严重影响后面的连接转化效率及文库质量。载 体与插入片段的连接效率对构建高质量的 cDNA 文库 起着重要作用，我们把cDNA 与载体以摩尔比为 3:1 进行连接、包装。从理论上讲，当一个 cDNA 文库具 有106以上的库容时，就能以 99%的概率保证文库中 包含有细胞表达出的任何一种mRNA 序列信息[5]。本 实验所建文库库容为 1.35 × 106 pfu，符合理论要求。 据SCOP 数据库推算，如果文库中 cDNA 插入片断达 到300 bp 以上，就可以代表蛋白质的各个功能域[6]。 而本实验中 91%的插入片段长度>300 bp，因此所建文 库质量较高，能够有效运用于后续的肿瘤标志物筛 选。 目前，用于多肽、蛋白质展示的噬菌体系统主要 有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4 噬菌 体展示系统和 T7 噬菌体展示系统[7]。本研究应用T7 噬菌体展示系统构建了吸烟者肺癌组织 T7 噬菌体展 示cDNA 文库。该文库和常规 cDNA 文库相比，文库 容量更为丰富。T7 噬菌体复制周期短，细胞质蛋白组 装、操作和储存方便；T7 噬菌体很稳定，可以采用各 种试剂以将噬菌体从固相结合物上释放下来并仍然 保持很高的感染活性，可以用于大规模亲和淘洗；而 且T7 是裂解性噬菌体，展示在 T7 表面的多肽或蛋白 质不需要通过细胞膜分泌出来，从而使更多的序列可 能被展示[8]；更有可能获得含有完整开放阅读框的 cDNA 片段。 T7 噬菌体展示系统可以在其表面以高、中、低拷 贝展示不同分子量、不同亲和力的蛋白质。该技术发 展迅速，并被应用于生命科学及药物研究的许多领 域。Zhong 及其研究小组构建了非小细胞肺癌 T7 噬 菌体展示技术，将蛋白芯片技术与噬菌体展示技术结 合，筛选出 5个噬菌体展示蛋白的肿瘤标志物组合， 敏感性和特异性分别为 90%和95%[9]。Gnanasekar M. 等通过 T7 噬菌体 cDNA 文库筛选出 5个Brugia Malayi 的疫苗候选分子[10]。 5. 结论 本文构建了吸烟者肺癌组织T7 噬菌体展示文库， 为我们以后应用蛋白质芯片技术在吸烟人群中筛选 早期肺癌肿瘤标志物打下基础。 6. 致谢 河北医科大学第四医院对本实验提供了大量的 便利和支持，作者在此表示衷心地感谢。 参考文献 (References) [1] A. 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