 Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 75-80 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.22013 Published Online June 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp) Effect of Sucrose and Inoculating Quantity Combination on the Indole Alkaloids Synthesis of Catharanthus roseus Culture Cell Nan Zhao, Wen Chen, Zhigang Guo* Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing Email: *guozhig@mail.tsinghua.edu.cn Received: Mar. 21st, 2012; revised: Apr. 14th, 2012; accepted: Apr. 28th, 2012 Abstract: The experimental results show that, the initial pH of 6.5 is the optimum condition to the accumulation of cell biomass and the synthesis of indole alkaloids. When inoculation rate is at 20%, the content of indole alkaloids increase with the sucrose concentration increased, add 90 g/L sucrose, the content of vinblastine reached 1.7 mg/g dry cell. When the inoculation rate increased to 25% or 30%, a lower concentration of sucrose is conducive to the synthesis of indole alkaloids. 60 g/L sucrose and 25% of the inoculation rate combination is conducive to the cell biomass accumu- lation. Keywords: Catharanthus roseus; Cell Culture; Vinblastine; Terpene Indole Alkanoid 蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 赵 楠，陈 文，郭志刚* 清华大学化学工程系，北京 Email: *guozhig@mail.tsinghua.edu.cn 收稿日期：2012 年3月21 日；修回日期：2012年4月14日；录用日期：2012年4月28日 摘 要：实验结果表明，初始 pH 为6.5 时有利于细胞生物量积累和吲哚生物碱的合成。接种量在 20%时，随着 蔗糖浓度的提高吲哚生物碱的含量也提高，添加 90 g/L 蔗糖时，长春碱的含量达到了1.7 mg/g 干细胞。当接种 量提高到25%或30%时，较低浓度的蔗糖有利于吲哚生物碱的合成。60 g/L蔗糖与 25%接重量组合有利于细胞 生物量的积累。 关键词：长春花；细胞培养；长春碱；萜类吲哚生物碱 1. 引言 长春花植物体中的长春碱和长春新碱的含量仅 有百万分之几或十万分之几[1]，但是，由于长春碱或 长春新碱的特殊抗癌疗效，人们不得不花费巨额成本 从长春花植物体分离长春碱或长春新碱。为了降低长 春碱的生产成本，科学家想通过长春花细胞培养，提 高细胞中的长春碱或长春新碱含量，以实现长春碱或 长春新碱的稳定生产。近 30 年来，研究者在长春花 高产细胞系的筛选[2-4]，不同植物器官的培养与培养条 件优化[5-7]，通过诱变剂诱导和筛选抗性细胞株培养 [8-11]，通过液液两段培养，在产物合成阶段通过添加 代谢前体和诱导子等[12-17]各个方面进行了大量研究。 也确实大幅度提高了蛇根碱、阿玛碱或长春质碱的含 量。但是绝大多数研究不能从培养细胞中获得长春碱 或长春新碱。Parr[7]等从转化的发根中检测到了长春碱 的存在，但在离体培养的根中却检测不到长春碱。 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 75  蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 Miura 和Okazaki[18]在长春花细胞培养中得到了微量 的长春碱。但是到目前为止，还没有长春花细胞培养 可以获得更高长春碱含量的报告。 根据我们的前期实验得知，在细胞培养液中添加 蛇根碱合成途径的酶抑制剂可以有效地抑制蛇根碱 的合成，同时大幅度提高了长春质碱的含量[19]，在此 基础上再添加长春碱合成途径中的前体和诱导子等 进行综合调控，就能促进长春碱的合成。本文在以上 研究的基础上，再次探讨 pH 、接重量、培养基含糖 量对长春碱及其他吲哚类生物碱合成的影响。 2. 材料与方法 2.1. 细胞培养方法 长春花细胞系是本实验室诱导并驯化培养 2年的 C03 细胞系，实验采用固–液两步法。继代或细胞扩 增培养基为改良 Murashige & Skoog(MS)固体培养基， 添加 0.5 mg/L BA(6-苄氨基嘌呤)，0.5 mg/L NAA(萘 乙酸)，30 g/L 蔗糖，5.5 g/L 琼脂，pH 调节为 5.6~5.8。 继代培养采用50 mL 培养基/200 mL 三角瓶，在12℃ 高压灭菌 18 分钟后冷却备用，每瓶接种 6~7 块大小 均匀且处于生长旺盛期的细胞团，接种量为鲜重 1.5 g ± 0.1 g/瓶。25℃，避光培养，每 3周继代培养一次。 实验用细胞是通过扩增培养获得的生长旺盛的长春 花细胞。 长春碱合成培养采取细胞悬浮培养方式，合成培 养基采用1/2 改良MS 培养基，添加0.5 mg/L BA，0.5 mg/L NAA，30 g/L 蔗糖，100 mg/L 色氨酸、50 mg/L 丙酮酸钠、50 mg/L马钱子苷和 30 mg/L氯化铈，再 在无菌条件下利用 0.42 μm孔径的无菌过滤膜过滤加 入0.6 mg/L维生素 C、5 μg/L 乙酰辅酶A、20 μg/L 过氧化氢、0.5 μM/L 苯丙三氮唑和 8.4 mg/L 萘普生等 代谢调节因子后备用。 2.2. pH实验设计 将上述长春碱合成培养液750 mL分成 5组，分 别将其 pH 值在无菌条件下调整为 4.5、5.0、5.5、6.0 和6.5，然后将每组150 mL培养液分装在三个200 mL 三角瓶中，既 50 mL/瓶，在超静工作台中每瓶接种 10 g细胞，之后固定在 110 rpm旋转培养装置上进行悬 浮培养，培养周期为 5天，培养温度为 25℃ ± 1℃。 2.3. 细胞接种量和蔗糖添加量的均匀实验设计 在1/2 改良MS 培养基中，添加 0.5 mg/L BA，0.5 mg/L NAA和2.1 中所列出的代谢前体、诱导子和酶 抑制剂的基础上，选取了三种接种量20 %、25%、30%， 三种蔗糖含量30 g/L、60 g/L、90 g/L，进行均匀实验 设计(见表 1)，实验分为九个组合，pH 分别调整为 6.5， 每组实验为 3个200 mL三角瓶，每瓶分装50 mL培 养液，每瓶接种10 g 细胞，之后固定在 110 rpm 旋转 培养装置上进行悬浮培养，培养周期为 5天，培养温 度为 25℃ ± 1℃。 2.4. 长春花生物碱的提取 采用超声萃取与摇床萃取相结合的方法对长春 花吲哚生物碱进行提取，条件如下：收获上述各实验 处理的细胞，经冷冻干燥至恒重并称干重，然后研磨， 精确称取样品200 mg，置 于25 mL 磨口锥形瓶内，加 入5 mL 甲醇，摇匀，用超声提取 30 min，放在摇床 上抽提 12 h(100 rpm，25℃)，离心获取上清液。同时 将细胞残渣再次加入 5 mL萃取液，重复第一次抽提 步骤。合并二次萃取液，旋转蒸发至干，再用 5 mL 色谱级甲醇稀释并定容为 5 mL，再用 0.45 μm微孔滤 膜过滤到分析用小瓶中待测。 2.5. 长春花生物碱的检测 本实验利用 HPLC 对长春花细胞中的吲哚生物碱 进行定量分析。HPLC 分析条件如下：利用 SHIMADZU-CLASS-10Avp 型高效液相色谱，色谱柱 为岛津公司Shim-pack C18反相柱PREP-ODS (H)KIT (4.6 × 250 mm)，流动相：A：含有 3.1 g/L 乙酸铵和 5 mL/L 甲酸的纯水溶液，B：为色谱级甲醇，等比洗脱： A:B = 1:1，流动相流速：0.8 mL/min，紫外检测器检 测波长：260 nm，柱箱温度：40℃。 长春质碱、文多灵、长春碱、它波宁的标准品购 于上海康爱生物制品有限公司，样品纯度大于 98%。 Table 1. Uniform experimental combination of sucrose content and inoculation rate 表1. 蔗糖含量和接种量的均匀实验组合 Inoculation rate 30 g/L sucrose 60 g/L sucrose 90 g/L sucrose 20% 1 2 3 25% 4 5 6 30% 7 8 9 Copyright © 2012 Hanspub 76  蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 3. 结果与讨论 3.1. pH对细胞生长和吲哚类生物碱合成的影响 如图 1所示，当初始 pH 降低到 4.5 或5.0时，鲜 细胞重量有所减少。当初始 pH 调整在 5.5~6.5 时，鲜 细胞和干细胞的重量均有所增加，而且随着pH 的升 高而增加。实验结果表明，较高的初始 pH 值有利于 长春花细胞的生物量积累。 图2表示了不同初始 pH条件对吲哚生物碱合成 的影响。在初始 pH 为5.5 时，各种吲哚生物碱的含 量均较低。当初始 pH值为 4.5 或6.5 时，长春碱的含 量达到最高的0.16 mg/g，是其他 pH 值处理的 2~6 倍。 长春碱在较低或较高 pH 条件下合成能力增强的原因 还需要进一步研究。长春质碱在初始 pH 为5.0 时的 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 fresh weight/g pH inoculation fresh weight gained fresh weight gained dry weight dry weight/g Figure 1. Effect of different initial pH on cell growth of Catharan- thus roseus 图1. 不同初始 pH 对长春花细胞生长的影响 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 0 1 2 3 4 5 6 Catharanthine&Vindoline(mg/g dryweight) pH Vinblastine&Tabersonie(mg/g dry weight) Catharanthine Vindoline Vinblastine Tabersonine Figure 2. Effect of d if f erent initial pH on Catharanthus roseus in- dole alkaloid synthesis 图2. 不同初始 pH 对长春花吲哚生物碱合成的影响 合成量最多，是其他 pH 处理的 2.5~3 倍，表现出极 大的 pH 偏好性。但在此pH 条件下其他生物碱的合 成量均较少。这可能是由于长春质碱合成途径中的相 关酶在 pH 为5.0 时活性较高，由于长春质碱的合成 与它波宁和文多灵分别在两个不同的分支途径，长春 质碱的过量合成，反而会抑制文多灵或长春碱的合 成。文多灵虽然在初始pH 为6.0 时合成量最高，但 是由于文多灵是合成长春碱的前体，所以各pH 处理 之间没有显著性差异。它波宁是合成文多灵的前体， 在pH 为6以下时其合成量没有显著差异，在初始pH 为6.5 时合成量较多。根据以上实验结果，为了提高 最有经济价值的长春碱含量，兼顾到其他生物碱的含 量以及生物量的积累，长春花生物碱合成的最佳初始 pH 应该设定在6.5 左右。 3.2. 细胞接种量和培养基糖含量对吲哚类 生物碱合成的影响 蔗糖不仅为细胞提供碳源，而且在提高培养液渗 透压，维持细胞内外渗透压平衡以及物质传质等起着 重要作用。细胞的接种量不但会直接影响到生物碱的 总产量，同时也会影响到培养液的渗透压。因此细胞 接种量和蔗糖的交互作用，会影响细胞生物量积累和 吲哚生物碱的合成。为了优化出接种量和蔗糖浓度的 最佳参数，我们采取了二因素三水平的均匀试验设计。 细胞接种量和蔗糖浓度组合对于长春花细胞生 长的影响如图 3，可以明显看到随着接种量的增加， 生物量(干细胞)也有所增加。在含糖量相同的情况下， 20% 25% 30% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 dry wei ght/g inoculation rate 30g/L surcose 60g/L surcose 90g/L surcose Figure 3. Effect of inocul a t i o n r a te and sucrose content on cell biomass 图3. 不同接种量和蔗糖浓度对细胞生物量的影响 Copyright © 2012 Hanspub 77  蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 例如添加30 g/L 蔗糖时，25%接种量处理的生物量 (0.52 g/瓶)比20%接种量处理(0.37 g/瓶)提高了1.4 倍 (接种量提高了 1.25 倍)；30% 接种量处理的生物量 (0.64 g/瓶)比20%接种量处理(0.37 g)提高了1.7 倍(接 种量提高了 1.5 倍)。因此说明 25%和30%的接种量均 促进了生物量积累。当蔗糖含量为 60 g/L 时，25%接 种量处理的细胞干重(0.8 g/瓶)与30%接种量处理基本 相同，比20%接种量处理(0.52 g/瓶)提高了约 1.5 倍。 结果表明25%接种量较有利于生物量积累。结合接种 量和蔗糖浓度进行分析，在细胞接种量为 20%时，随 着蔗糖浓度的提高，生物量积累有所增加。表明在接 种量较低的情况下，提高蔗糖浓度，不但可以为细胞 提供更充分的营养物质，而且由于培养液渗透压的改 善而促进了生物量积累。但是其影响效果并非成正 比。也就是说，当蔗糖浓度提高到 90 g/L 时，其生物 量并没有按比例增加。当细胞接种量提高到 25%或 30%时，在培养液中添加 60 g/L蔗糖更有利于生物量 积累，而添加90 g/L 蔗糖的生物量反而有所减少。这 可能与过高的蔗糖浓度会过度提高培养液的渗透压 有关。实验结果表明，培养液中添加60 g/L蔗糖有利 于生物量积累。从接种量考察，在添加 60 g/L 蔗糖时， 25%和30%接种量的处理之间没有显著差异。说明 30% 接种量处理由于细胞密度的增加所造成的营养竞争 以及渗透压升高而不适合生物量积累。因此，25%接 种量与 60 g/L 蔗糖组合比较有利。 细胞接种量与培养液含糖量对长春花细胞吲哚 生物碱合成的影响如图 4~6。从图 4可以看到，在蔗 糖浓度为30 g/L 的前提下，四种生物碱的含量随着接 种量的提高而增加。当接种量提高到 30%时(2.2 mg/g 干重)，长春质碱的含量是20%接种量(0.5 mg/g干重) 的4倍多。而接种量为 25%(0.8 mg/g干重)时的含量 也是 20%接种量的 1.6 倍。文多灵在三种不同的接种 量处理中(20%、25%、30%)，后一组相对于前一组均 提高了 2倍。长春碱和它波宁的含量则随着接种量的 提高而显著增加。两者在 30%接种量时的长春碱和它 波宁含量分别比 20%接种量处理提高了约 7倍(为0.54 mg/g 干重)和9倍(为0.84 mg/g 干重)。实验结果表明， 在含糖量较低情况下，增加细胞的接种量能够促进长 春花吲哚生物碱的合成。 图5表示了蔗糖浓度为60 g/L 时吲哚类生物碱的 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 20% 25% 30% 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Catharanthine&Vindoline(mg/g dryweight) inoculation rate(30g/L surcose) Catharanthine Vindoline Vinblastine Tabersonine Vinblastine&Tabersonie(mg/g dry weight Figure 4. When sucrose is 30 g/L, effect of different inoculation rate on alkaloid synthesis 图4. 蔗糖含量为 30 g/L时不同接种量对生物碱含量的影响 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 20% 25% 30% 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 Catharanthine&Vindoline(mg/g dry weight) inoculation rate(60g/L surcose) Catha ranthine V ind olin e V inb las t in e Tabersonine Tabersonie&Vinblastine (mg/g dry weight) Figure 5. When sucrose is 60 g/L, effect of different inoculation rate on alkaloid synthesis 图5. 蔗糖含量为 60 g/L时不同接种量对生物碱含量的影响 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 20% 25% 30% 0 1 2 3 4 5 6 Catha ranth i n e&Vind ol i n e(mg/g dryweight) inoculation rate(90g/L surcose) Catharanthine Vindoline Vinblastine Tabersonine Vinblastine&Tabers onie(mg/g dry weight) Figure 6. When sucrose is 90 g/L, effect of different inoculation rate on alkaloid synthesis 图6. 蔗糖含量为 90 g/L时不同接种量对生物碱含量的影响 合成情况。结果表明，吲哚生物碱的含量除长春质碱 Copyright © 2012 Hanspub 78  蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 外，均随着接种量的提高而增加。这可能与长春质碱 的合成与其他三种生物碱的合成分别在不同的代谢 支路有关。文多灵的含量在30 %和25%接种量处理时 分别比 20%接种量处理提高了大约 5倍(为0.8 mg/g 干重)和3倍(为0.54 mg/g干重)。而长春碱的含量在 30%和25%接种量处理时分别比 20%接种量处理提高 了大约 13 倍(为0.78 mg/g干重)和5倍(为0.27 mg/g 干重)。实验结果表明，60 g/L 蔗糖浓度与 30%接种量 组合有利于各种长春花吲哚生物碱的合成。 当蔗糖浓度达到90 g/L 时，长春花吲哚生物碱的 含量随着接种量的增加而降低(图6)。20%接种量处理 大幅度提高了各种生物碱的含量。如长春质碱的含量 提高到 4.8 mg/g，文多灵的含量达到 2.2 mg/g，长春 碱的含量提高到1.7 mg/g，它波宁的含量达到了 0.95 mg/g 。 以上实验结果结合生物量积累(图3)可以看到，在 蔗糖浓度达到90 g/L 时，20%接种量处理的细胞生长 几乎不受抑制，但接重量提高到 25%或30%时，细胞 的生长受到了抑制，同时吲哚生物碱的含量也随之减 少。这是由于高糖浓度和高接种量组合大幅度提高了 培养体系的渗透压以及造成细胞之间发生营养竞争， 从而严重影响了细胞的物质代谢能力。此外，由于高 糖浓度增加了培养液的粘性而影响了气体传质；而细 胞量的增加过度地消耗了溶液中的溶氧而引起供氧 不足，因此就严重影响了长春花细胞吲哚生物碱的合 成。虽然，60 g/蔗糖与 30%接种量组合有利于生物量 积累，但是 90 g/L 蔗糖和20%接种量组合更有利于长 春碱的合成。 此外，我们再纵向观察上述实验结果(图4~6)， 并结合细胞的生物量积累可以看到，当接种量为 20% 时，随着蔗糖浓度的提高，各类生物碱的含量均大幅 度提高。而接种量增加到 25%或30%时，这种规律则 被打破。比如在25 %或30%接种量处理时，它波宁的 含量随着蔗糖浓度的增加而减少。长春碱最大峰值出 现在 60 g/L 蔗糖浓度处理。在接种量为 25%时，长春 质碱的含量随着蔗糖浓度的升高而增加，而在接种量 为30%时，其含量却随着蔗糖浓度的升高而降低。文 多灵虽然在接种量相同的情况下，其含量随着蔗糖浓 度的提高而增加，但是其增加幅度很有限。本实验证 明，接种量和蔗糖浓度与长春花细胞的生物碱合成密 切相关。其原因可能是通过渗透压调节细胞对物质的 吸收、通过培养体系的粘度而影响气体传质、通过细 胞的耗氧量而影响细胞代谢能力等多因素综合调控 长春花细胞的生物碱合成。 4. 结论 实验结果表明，初始pH 在6.5 时有利于细胞生 物量积累以及各类吲哚类生物碱的合成。初始 pH 为 5.0 有利于长春质碱的合成。接种量与蔗糖浓度具有 互补作用。当接种量在20 %时，提高蔗糖浓度有利于 长春花吲哚类生物碱的合成。当接种量提高到 25%或 30%时，较低的蔗糖浓度有利于吲哚类生物碱的合成。 虽然 60 g/L蔗糖与 25%接重量组合有利于细胞生物量 的积累，但是在此条件下的生物碱合成能力较弱。综 合考虑 90 g/L蔗糖与20%接种量组合最适合于长春碱 等吲哚类生物碱的合成。 参考文献 (References) [1] 刘红蕾, 张玉臻, 陶文沂. 营养及环境因子对农杆菌诱导的 长春花发根生长和生物碱生成的影响[J]. 药物生物技术, 2003, 10(2): 155-158. [2] S. Brown, R. C. Cresswell. Selection study on Catharanthus ro seus. Physiol Veg, 1984, 22: 254-271. [3] 孙祥海. 植物次生代谢物的细胞培养技术研究进展[J]. 龙岩 学院学报, 2005, 23(6): 60-67. [4] 郭胜娟, 杨春燕, 冯玲玲等. 长春花愈伤组织的诱导与增殖 [J]. 华中师范大学学报, 2004, 38(2): 228-230. [5] 孙敏, 伍春莲, 汪洪等. 多因子正交试验对长春花离体培养 条件的筛选[J]. 西南师范大学学报(自然科学版), 2002, 27(2): 202-205. [6] 黄小龙, 谢达平. 植物代谢工程的研究现状[J]. 生物学杂志, 2003, 20(2): 11-14. [7] A. J. Parr, A. C. J. Peerless and J. D. Manill. Alkaloid production by transformed root cultures of Catharanthus roseus. Report Plant Cell, 1988, 7(5): 309-312. [8] A. Pietrosiuk, M. Furmanowa and B. Łata. Catharanthus roseus: Micropropagation and in vitro techniques. Phytochemistry Re- views, 2007, 6(2-3): 459-473. [9] J. A. Morgan, J. V. Shanks. Determination of metabolic rate- limitations by precursor feeding in Catharanthus roseus hairy root cultures. Journal of Biotechnology, 2000, 79(2): 137-145. [10] A. Dutta, J. Batra, S. Pandey-Rai, et al. Expression of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway genes corresponds to ac- cumulation of related alkaloids in Catharanthus roseus (L.) G. Don. Planta, 2005, 220(3): 376-383. [11] 谢从华, 柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2004: 74-149. [12] M. El-Sayed, R. Verpoorte. Methyljasmonate accelerates catabo- lism of monoterpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus during leaf processing. Fitoterapia, 2005, 76(1): 83-90. [13] K. H. Jung, S. S. Kwak. Development of 2-Stage culture process by optimization of inorganic salts for improving catharanthine production in hairy root cultures of Catharanthus roseus. Jour- nal of Fermentation and Bioengineering, 1994, 77(1): 57-61. Copyright © 2012 Hanspub 79  蔗糖与接种量组合对长春花培养细胞吲哚生物碱合成的影响 Copyright © 2012 Hanspub 80 [14] M. J. Xu, J. F. Dong. Nitric oxide stimulates indole alkaloid production in Catharanthus roseus cell suspension cultures through a protein kinase-dependent signal pathway. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 37(1): 49-53. [15] M. J. Xu, J. F. Dong. O2– from elicitor-induced oxidative burst is necessary for triggering phenylalanine ammonia-lyase activation and catharanthine synthesis in Catharanthus roseus cell cultures. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36(2-3): 280-284. [16] Z J. hao, W. H. Zhu and H. Qiu. Enhanced catharanthine pro- duction in Catharanthus roseus cell cultures by combined elici- tor treatment in shake flasks and bioreactors. Enzyme and Mi- crobial Technology, 2001, 28(7-8): 673-681. [17] 曹阳, 侯军, 郑珍贵等 . 长春花细胞大型生物反应器培养的 初步研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2002, 30(2): 87-90. [18] Y. Miura, K. Hirata, N. Kurano, et al. Alkaloid production in multiple shoot culture of Catharanthus roseus. Biological Che- mistry, 1987, 51(5): 611-614. [19] Z. G. Guo, Y. Liu and X. H. Xing. Enhanced catharanthine bio- synthesis through regulation of cyclooxygenase in the cell sus- pension culture of Catharanthus roseus (L.) G. Don. Process Biochemistry, 2011, 46(3): 783-787. |