 Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2012, 2, 25-29 http://dx.doi.org/10.12677/hjas.2012.22005 Published Online June 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjas) Rapid Propagation of “Lv Ling” Walnut (Juglans regia L.) through Embryo-Induced Seedlings* Xixing Liu1, Yuhong Gu2, Baoguo Li1#, Guohui Qi1, Lu Liu2, Yanz he Hui1, Lixin Dong1, Liyuan Ma1 1College of Forestry, Agricultural University of Hebei, Baoding 2College of Life Science, A g r i c u l tural University of Hebei, Baoding Email: liuxixing1234@126.com, #lbg888@163.com Received: Apr. 13th, 2012 ; re vise d: A pr. 28th, 2012; accepted: May 2nd, 2012 Abstract: The mature embryo induced axillary buds were used as explants to investigate rapid propagation of precocious thin-shelled “Lv Ling” walnut in the MS basic medium with different concentrations of plant growth regulators. The results showed that MS + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L was the most feasible medium for embryo germination, and MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L was the best for induction and multiplicatio n of the ax illary buds in all tested treatments. The 50% of rooting rate was achieved by a two-stage rooting method, namely, the shoots were first cultivated in DKW + IBA 8.0 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6.0 g/L medium for 20 days under dark condition, then transferred to DKW + sucrose 30 g/L + agar 6.0 g/L medium under light condition. After transplanting to the field, 33.3% of the seedlings survived. Keywords: Walnut; Juglans; Embryo; Axillary Buds; Hormones “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究* 刘喜星 1，顾玉红 2，李保国 1#，齐国辉 1，刘 璐2，回彦哲 1，董丽欣 1，马丽媛 1 1河北农业大学林学院，保定 2河北农业大学生命科学学院，保定 Email: liuxixing1234@126.com, #lbg888@163.com 收稿日期：2012 年4月13 日；修回日期：2012 年4月28 日；录用日期：2012 年5月2日 摘 要：以早实薄皮核桃“绿岭”成熟种胚诱导出的腋芽为外植体，MS 为基本培养基，通过调节激 素种类和浓度配比，初步研究了“绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系。比较试验结果表明：最佳种 胚萌发培养基为 MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L；最佳腋芽诱导和增殖培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L。生根采用两步生根法：先在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L暗培养 20 d，然后转入 DKW + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基中进行光照培养， 生根率为 50%。诱导生根的组培苗移栽到大田后成活率为 33.3%。 关键词：核桃；核桃属；胚；腋芽；激素 1. 引言 核桃(Juglans regia L.)为胡桃科核桃属多年生落 叶果树，与扁桃、板栗、腰果并称为世界 4大干果， 果实具有较高的营养价值及良好的医疗保健功能，日 益受到广大消费者的青睐[1]。我国是核桃原产地之一， 栽培历史悠久，分布广泛，种质资源丰富[2]。“绿岭” 核桃是河北农业大学李保国教授等在河北绿岭果业 *基金项目：国家林业公益性行业科研专项(201004093)、河北省科 技支撑项目(11230115D)。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 25  “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 有限公司从“香玲”核桃中选育出的优良变异品种， 具有壳薄、优质、早实和丰产的优良特性，深受果农 欢迎，但苗木繁育跟不上该品种的产业发展需求。核 桃组织培养是迅速繁殖种苗、保存和选育优良品种的 重要手段。关于核桃组织培养，前人已有研究[3-17]， 但是，薄皮核桃的组培研究相对较少，利用“绿岭” 核桃成熟种胚诱导出的腋芽为外植体开展腋芽快繁 以往未见报道。因此，本研究以“绿岭”核桃成熟种 胚诱导出的腋芽为外植体，利用固体组织培养技术， 对“绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁途径进行研究， 既可望提高“绿岭”核桃种胚的繁殖速度和增殖系数， 又对核桃种质资源保存和苗木的快速繁殖提供一定 的参考意义。 2. 材料与方法 2.1. 材料 以“绿岭”核桃(J. regia “Lv Ling”)的成熟干燥坚 果为材料，其青皮果实于 2010 年9月5号采自河北 省邢台市临城县绿岭果业有限公司示范园。 2.2. 方法 2.2.1. 灭菌 将“绿岭”青皮核桃用刀剥掉青皮得到坚果，坚 果先用自来水冲洗干净，再用 30%的次氯酸钠(含3% 有效氯)清洗 1遍，用蒸馏水冲洗 3遍，再用75%的酒 精清洗 1遍，最后用蒸馏水冲洗 3遍，放在通风干燥 无菌处晾干备用。 接种前，取“绿岭”核桃坚果，放入超净工作台 内的大烧杯中。先用 30%的次氯酸钠消毒 5 min，无 菌水冲洗 3次，每次 1 min，然后用 75%的酒精消毒 30 s，无菌水冲洗 3次，每次 1 min。最后用核桃钳子 小心夹开坚果取出胚，将胚置于培养皿中，用 75%的 酒精消毒 1 min，无菌水冲洗 3次，每次 1 min。滤纸 吸干水分后将胚接种于培养基上。 2.2.2. 种胚萌发培养基的筛选 在MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L的培养基中 分别添加不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的IBA(吲 哚丁酸)，不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的NAA(萘 乙酸)(表1)，以筛选最适宜胚萌发培养的激素浓度。 先将胚暗培养 7 d，再光照培养。每个处理接种 10 个 胚，3次重复。接种第 10 d统计萌发数，计算种胚萌 发率。接种第 30 d统计成苗率。 萌发率(%) = (萌发种胚数/接种种胚数) × 100% 成苗率(%) = (成苗数/接种种胚数) × 100% 2.2.3. 腋芽萌发培养基的筛选 将种胚萌发长成的组培苗切成带有 1~2 个腋芽的 茎段，长约2 cm。选用生长基本一致的茎段，分别接 种于 MS + 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基和 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上。每个处理接种 10 个茎段，3次重复。 每2周继代 1次，接种第 20 d 统计腋芽萌发数，计 算腋芽萌发率，接种第 30 d 统计增殖系数。 腋芽萌发率 = (萌发腋芽数/接种腋芽数) × 100% 增殖系数 = (萌出的腋芽茎段数/组培苗的株数) × 100% 2.2.4. 生根培养基的筛选 将腋芽诱导的茎段先接在 DKW + IBA 5.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂6.0 g/L和DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基上，暗培养 12 d和20 d，转入 DKW + 蔗糖 30 mg/L + 琼脂 6 g/L培养基中。 3周后统计生根数，计算生根率。每处理接种 10 个茎 段，3次重复。 生根率 = (生根茎段数/接种茎段数) × 100% 2.2.5. 组培苗的炼苗移栽 组培苗生根约 40 d后，将生根苗的瓶盖打开，在 光照培养箱(温度为 25℃、光照强度为 2000 lx，光周 期为 16 h/d)里炼苗 2~3 d。然后取出小苗，移栽于沙： 土(1:1)基质中。在光照培养箱里培养15 d后，在室温 下炼苗 5 d，然后于 5月18 日移栽到大田。先盖上遮 阳网(遮光度为 80%)，注意保持土壤湿润，5 d后撩起 一侧，再过 2 d后撩起另一侧，直到把 4侧都撩起为 止，然后选择阴天去掉遮阳网。在光照培养箱培养第 15 d时记录成活苗数，计算成活率Ⅰ；移栽到大田第 30 d时记录成活苗数，计算成活率Ⅱ。 成活率 = (成活株数/移栽株数) × 100% 2.2.6. 培养条件 以上所有培养基高压灭菌前的pH 值均为 5.8~ 6.0，在121℃下高压灭菌20 min。培养温度为 25℃ ± Copyright © 2012 Hanspub 26  “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 2℃，光周期为 16 h/d，光照度为 2000~2500 lx。 3. 结果与分析 3.1. “绿岭”核桃种胚萌发的诱导 不同培养基下“绿岭”核桃种胚萌发和成苗的情 况如表 1所示。处理1、处理3和处理 4种胚萌发率 最高为 93.3%，处理 9的种胚萌发率最低为 67.7%， 二者差值为 25.6%；处理 1和处理 3成苗率最高为 90.0%，处理 2、处理 7和处理 9成苗率最低为 43.3%， 二者差值为 47.7%。 不同培养基下“绿岭”核桃种胚萌发诱导的生长 情况如表 2所示。由表 2可知处理 1的种胚生长情况 优于其他处理的生长情况。 Table 1. Embryo germination and seedling growth of “Lv Ling” walnut 表1. “绿岭”核桃种胚萌发和成苗的情况 处理 Treatment 培养基 Medium 萌发率(%) Germination rate 成苗率(%) Seedling rate 1 MS 93.3 90.0 2 MS + IBA 0.5 mg/L 83.3 43.3 3 MS + IBA 1.0 mg/L 93.3 90.0 4 MS + IBA 1.5 mg/L 93.3 66.7 5 MS + IBA 2.0 mg/L 83.3 66.7 6 MS + NAA 0.5 mg/L 83.3 50.0 7 MS + NAA 1.0 mg/L 83.3 43.3 8 MS + NAA 1.5 mg/L 83.3 83.3 9 MS + NAA 2.0 mg/L 67.7 43.3 注：表中的培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Table 2. Embryo germination and induction of “Lv Ling” walnut 表2. “绿岭”核桃种胚萌发诱导的生长情况 培养时间 (天) Culture time (d) 7 21 28 处理 1的生 长状况 Treatment 1 胚根迅速伸 长，上胚轴开 始伸长 苗高约 3 cm， 叶片未展开， 主根长约 2~3 cm，呈乳白色 幼苗高 3~4 cm，复叶 2~3 片，多数已生侧根 处理 2~9 的 生长状况 Treatment 2 to 9 胚根很短 苗高约 2 cm， 叶片未展开， 茎基有少量 愈伤 幼苗高约 3 cm，复叶 2~3 片，主根较短呈锥 状，茎基有少量愈伤， 少数有侧根 注：处理 1~9 分别为MS；MS + IBA 0.5 mg/L；MS + IBA 1.0 mg/L；MS + IBA 1.5 mg/L；MS + IBA 2.0 mg/L；MS + NAA 0.5 mg/L；MS + NAA 1.0 mg/L； MS + NAA 1.5 mg/L；MS + NAA 2.0 mg/L。表中的培养基均加入 30 g/L的蔗 糖和 6 g/L的琼脂。 综合种胚萌发率、成苗率和种胚的生长情况来 看，在本试验范围内，最适的“绿岭”核桃种胚萌发 培养基为 MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L。 3.2. “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽萌发的诱导 “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽萌发和增殖的情况 如表 3所示。由表3可知，接种在 MS + 6-BA 1.0 m g/L + NAA 0.2 m g/L培养基上的茎段，培养15 d 后，腋芽 开始萌动，萌发率为 60%，增殖系数为 2.12；接种在 MS + 6-BA 2.0 m g/ L + NAA 0.2 mg/L培养基上的茎段， 培养 10 d 后，腋芽开始萌动，腋芽萌发率为 80%，增 殖系数为 3.54。两者萌发率相差 20%，增殖系数相差 1.42。20 d以后，腋芽萌出的小茎尖长 1~2 cm ( 图1)。 综合萌发率、增殖系数和茎段腋芽的萌发状况可得出 最适宜腋芽诱导和增殖的培养基是MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L。 3.3. “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段生根的 诱导 “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段生根的过程如 图2所示，由图 2可见，茎段基部先出现小根尖，然 后发育成主根，随后又长出侧根。在 DKW + IBA 5.0 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上暗培养 12 d的茎段基部形成愈伤少，生根率为 10%；而暗培养 20 d的茎段基部愈伤较多，生根率为 30%。在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上暗 培养 12 d的茎段基部有愈伤，基部叶片也有愈伤化现 象，生根率为 20%；而暗培养 20 d的茎段基部长的愈 伤较多，生根率为 50%。因此，在本试验范围内，适 宜生根培养的方法是先在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗 糖30 g/L + 琼脂6.0 g/L暗培养 20 d，然后转入 DKW + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基中进行光照培养。 Table 3. Axillary buds germinati on an d mult i p lica t ion o f “Lv Ling” walnut 表3. “绿岭”核桃腋芽萌发和增殖的情况 培养基 Medium 萌动时间 Germination time 萌发率(%) Germination rate 增殖系数 Multiplication coefficient MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 m g/L 培养 15 d后 60 2.12 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 m g/L 培养 10 d后 80 3.54 注：表中的培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Copyright © 2012 Hanspub 27  “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 Copyright © 2012 Hanspub 28 注：左右图分别为 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L和MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L培养基上 接种培养第 20 d 腋芽的诱导及生长情况。培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Figure 1. Axillary bud growth from in vitro cultured seedling’s stem segment of “Lv Ling” walnut 图1. “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽生长的情况 注：从左往右分别为组培苗茎段在生根培养基中接种 28 d、35 d、46 d的照片。 Figure 2. Root induction and growth of in vitro cultured seedling’s axillary bud of “Lv Ling” walnut 图2. “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段的生根过程 3.4. 移栽 将生根的组培苗移栽于沙：土(1:1)基质中，光照培 养箱里培养 15 d时成活率为 80%。移栽到大田的组培 苗，在遮阳网下长得好，去掉遮阳网后叶片有暂时萎 蔫现象，适应条件后有的正常生长，有的植株叶片变 干枯。移栽到大田后成活率为33.3%，较低，这可能 同保定地区 5月温度高、湿度小的不良气候相关，不 利于组培苗移栽成活。 4. 结论与讨论 在植物组织培养中，基本培养基、激素浓度和品 种是影响茎段快繁的重要因素。田爱梅、王国强[3]研 究表明新疆大牧马核桃室外实生苗和山西太谷实生 晚实核桃室内苗的茎段在改良 DKW + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L + 抗坏血酸 5 mg/L培养基上腋芽萌发 效果好，而山西太谷实生晚实核桃成年树的茎段在改 良DKW + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 抗坏血 酸5 mg/L培养基上腋芽萌发效果好。刘兰英[4]将“ 薄 壳香”核桃嫁接苗茎段接种在 1/2 DKW + 6-BA 1~2 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 抗坏血酸 2~5 mg/L培养基 上，培养 7~10 d时腋芽开始萌动生长。苗玉青等[5] 将“温 185”薄皮核桃枝条接种到 DK W + 6-BA 1 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂7 g/L培养基 上，腋芽萌发率为 60%，且较粗壮。曾斌等[6]将新疆 野生核桃田间实生苗茎段接种到 DKW + 6-BA 1 mg/L 培养基上腋芽萌发效果好。张进等[7]研究表明室内“汾 阳”核挑实生苗茎段腋芽萌发最佳激素组合为改良 DKW + 6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L + IBA 0.02 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7 g/L。李明军等[8]研究发现 1/2 MS + 6-BA 0.5~4 mg/L + NAA 0.01~0.5 mg/L不同组 合均能促进黑核桃腋芽或顶芽的萌发与生长。王琴[9] 将温室栽培的“华亭”绵核桃、“武威”薄皮核桃的 实生苗单芽茎段分别接种在 DKW + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.05 mg/L和DKW + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.01 mg/L 培养基上，平均增殖新生芽数分别为 9.5和5.5。 宋锋惠等[10]将黑核桃树上的当年生幼嫩枝条、室内花  “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 盆栽培的顶芽已半木质化的黑核桃幼苗带 2~3 个芽的 茎尖和茎段接种到 1/2 MS(改良) + 6-BA 1. 5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 5 g/L的诱导培 养基中，增殖倍数为 2倍左右。本研究先将“绿岭” 核桃成熟种胚接种在 MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂 6 g/L 培养基上，然后将组培苗茎段接种在 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培 养基上，腋芽萌发率为 80%，增殖系数在 2.12~3.54 之间，这与其他人的研究结果不同。基于以往研究和 本试验的结果，可总结出：在进行核桃实生苗茎段、 田间枝条、组培苗茎段诱导腋芽萌发的研究中，可以 尝试以改良 DKW、1/2 DKW、DKW、MS、1/2 MS 为基本培养基，在培养基中附加0.5~2 mg/L的6-BA、 0.01~0.05 mg/L的IBA 和0.01~0.5 mg/L的NAA。 核桃属于较难生根的树种，生根是核桃离体快繁 的重要环节，目前多采用两步诱导生根法，在进行核 桃组培苗茎段生根的培养中，以改良DKW、1/4 DKW、1/2 DKW、DKW 为基本培养基，先在附加 IBA 1~10 mg/L的培养基中暗培养 8~20 d，然后在无激素 的培养基上光照培养 15~30 d诱导生根。田爱梅、王 国强[3]得出新疆大牧马核桃、山西太谷实生晚实核桃 组培苗茎段在改良 DKW + IBA 5 mg/L培养基上培养 7 d后转入无激素的改良DKW 培养基中生根率为 50.1%。刘兰英[4]发现“薄壳香”核桃组培苗茎段在 1/2 DKW + NAA 2 mg/L + IBA 2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基上培养 8~10 d后转到用培养液浇灌 的蛭石培养基中，其成活率为 70%。苗玉青等[5]研究 表明“温185”薄皮核桃组培苗茎段在 1/2 DKW + IBA 1 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7 g/L培养基上培养 30 d，生根率达 70%以上。曾斌等[6]采用间接诱导生根法， 用50 mg/L IBA浸渍处理新疆野生核桃试管苗基部 60 min，然后在无激素的1/2 DKW培养基中先黑暗培养 2周，再在 16 h/d光照下培养，试管苗生根率达96% 以上。裴东等[11]研究结果可知 6个早实核桃品种试管 嫩茎在 1/4 DKW + IBA 5~10 mg/L的培养基中黑暗培 养10~15 d，再转移至不含 IBA 的DKW 培养基中， 嫩茎生根率为 60.5%~89.7%。王清民等[12]把“新早丰” 试管嫩茎先在 1/4 DKW + IBA 5 mg/L培养基上暗培 养10~15 d，然后转到无激素的 1/4 DKW培养基中光 培养 14~20 d，生根率为73%~83%。本研究表明“绿 岭”核桃组培苗茎段先在 DKW + IBA 8.0 mg/L中暗 照 培养 20 d，然后转入无任何激素的 DKW 培养基中进 行光照培养，生根率为 50%。生根率较低，可能与品 种、培养基的类型和暗培养的天数有很大关系，因此， “绿岭”核桃组培苗茎段的生根培养有待进一步研究 和优化。 5. 致谢 作者感谢张雪梅、李杰、齐昆、胡志伟、张彦卿、 魏常燕等在本研究过程中提供的热心帮助和支持；同 时感谢河北绿岭果业有限公司在试验取材过程中提 供的各种方便。 参考文献 (References) [1] 李保国, 齐国辉. 绿色优质薄皮核桃生产[M]. 北京: 中国林 业出版社, 2007: 48-49. 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