 Pharmacy Information 药物资讯, 2012, 1, 11-14 http://dx.doi.org/10.12677/pi.2012.12003 Published Online November 2012 (http://www.hanspub.org/journal/pi.html) The Study on the Chemistry Properties of Tannin in Chinese Medicine Filipendula* Shuxia Miao1, Yuguang Lv2#, Hongzhi Miao3, Yuanxu W ang3, Hong Cui1, Chunhui Shi1, Xin’an Wang1, Ye Li2 1Clinical Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 2College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 3Jiamusi Infectious Diseases Hospital, Jiamusi Email: #yuguanglv@163.com Received: Sep. 28th, 2012; revised: Oct. 10th, 2012; accepted: Oct. 18th, 2012 Abstract: Study on the extraction of tannin and quantitative determination process, and understanding the activity of tannin in the Filipen dula. Respectively, to extract the tannin from the Filipendula with 30% methanol, 50% acetone wa- ter and distilled water and to detect the content of tannin with complex quantity. Using different solvents extract the tannin from the same quantity of Filipendula, 30% methanol ex traction is the best at last. Method of measurement with the complex ways in tannin, with 30% methanol is better. By the study of tannins in the Filipendula, the tannin com- pounds in pharmaceutical respect play a bigger role. Keywords: Filipendula; Tannin; Quantitative Determination 中药蚊子草中鞣质化学性质的研究* 缪淑霞 1，吕玉光 2#，苗洪志 3，王元旭 3，崔 红1，石春卉 1，王新安 1，李 烨2 1佳木斯大学临床医学院，佳木斯 2佳木斯大学药学院，佳木斯 3佳木斯市传染病医学院，佳木斯 Email: #yuguanglv@163.com 收稿日期：2012 年9月28 日；修回日期：2012 年10 月10 日；录用日期：2012 年10 月18 日 摘 要：研究蚊子草中鞣质的提取以及定量工艺，并了解蚊子草中的鞣质的活性。分别用 30%的甲醇，50%丙 酮水，水分别提取 5 g蚊子草中的鞣质，用络合量法测定鞣质的含量。用不同的溶剂提取等质量蚊子草中鞣质, 用络合量法测定其中提取的大小，最后甲醇的提取率最好。在用络合量法测量鞣质的方法中，用 30%的甲醇效 果较好。通过对蚊子草中的鞣质的研究，使鞣质类化合物在医药方面发挥更大的作用。 关键词：蚊子草；鞣质；结构鉴定 1. 引言 蚊子草[Filipendul a pal mate (Pall) Maxim]系蔷薇科 蚊子草属植物，又名合叶子、黑白蚊子草，全草入药， 主要成分分布于我国北方省份[1]。近年来对于蚊子草 属植物也做了一些药理方面的研究，并取得了积极进 展和多方面的研究成果，证明其具有多种生理活性， 该植物具有退热和消炎的功效，在防治心血管疾病以 及抗肿瘤方面具有潜在的疗效。蚊子草也可用于发 汗，治疗痛风、风湿、烧伤等症，在妇科止血方面也 *资助信息：黑龙江省科技厅科研项目(B201015)，黑龙江省中医药 管理局科研项目(ZHY12-Z195)，黑龙江省教育厅科研项目(11551482)， 2012 年佳木斯大学研究生创新 科研项目专项资金(YJSCX2012- 037JD)，佳木斯大学重大培育及面上科研项目(LZP2011-003, L2010-144)，佳木斯大学 2012 年“大学生创新创业训练计划”校 级项目(A-37)和校级培育项目(A-25)。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 11  中药蚊子草中鞣质化学性质的研究 有良好的疗效[2]。随着人们对蚊子草植物的研究不断 深入，已经从该植物中发现了多种成分，主要包括黄 酮化合物，鞣质类化合物，挥发油类成分，脂类化合 物，蚊子草中还含有肝素，叶中含有维生素 C，果实 中含有生物减，此外，蚊子草中还发现了水晶蓝素等 化学成分[3-10]。蚊子草属植物抗肿瘤作用研究表明： 其花提取物中的类黄酮成分具有抑制肿瘤扩散的作 用，该属植物中的水杨酸盐和鞣质，通过中断细胞分 裂的方法抑制肿瘤细胞的增值。蚊子草属植物中挥发 油类以及黄酮类化合物成分具有抗微生物活性的作 用。对于蚊子草属植物抗氧化和清除自由基作用的研 究发现，其主要的抗氧化成分为水杨酸类衍生物，鞣 质，黄酮类化合物，其中槲皮素-4-葡萄糖苷在体外具 有明显抑制黄嘌呤氧化酶的作用。蚊子草属中的黄酮 类化合物和香豆素类物质具有较好的护肝作用。蚊子 草属植物花粉中富含黄铜醇类化合物，具有抗动脉粥 样硬化，降低胆固醇，降低血压，保护缺血心肌的作 用。蚊子草属植物还具有抗炎，抗凝，抗栓和促纤溶 的作用。药用植物中鞣质的研究在天然药物化学中已 成为非常活跃的领域，其在医药行业的抗肿瘤治疗中 也显示相当诱人的前景。在可水解的鞣质的研究发方 面取得了引人瞩目的成就，确定了很多课水解鞣质的 结构，并发现了不少新的生物活性[11-13]。这些成就的 取得为进一步深入广泛开展鞣质类研究工作展示了 光明的前景，利用得天独厚的几千年的临床应用经 验，充分利用现代科学技术结合传统的医疗实践经 验，开辟这一古老而年轻的领域的而研究工作，就一 定能使药用鞣质的研究工作重放光彩，使鞣质类化合 物在医药方面发挥更大的作用。正确地利用这些有效 成分及其特性是充分发挥蚊子草药用价值的重要因 素之一。 有关蚊子草化学成分的报道较少，为了更好的开 发和利用药用资源，我课题组对蚊子草提取物进行了 系统的化学成分研究，研究结果发现蚊子草含有化学 成分为黄酮化合物，鞣质，酚类，糖，苷和醌类化合 物[14]，本文仅对蚊子草中的鞣质化合物的提取工艺和 化学性质进行了研究。 2. 实验部分 2.1. 仪器与材料 2.1.1. 仪器 RE52-5AA 旋转蒸发仪；上海亚荣生化仪器厂 JT10001 电子天平；上海精科电子天平仪器有限 公司 超声波清洗器；昆山超声仪器有限公司 恒温数显水浴锅；常州国华电器有限公司 2.1.2. 材料 甲醇(分析纯)；天津市科密欧化学试剂有限公司 丙酮(分析纯)；沈阳市华东试剂厂 鉻黑-T；沈阳市试剂三厂 氯化铵；齐齐哈尔市试剂三厂 三氯化铁；天津市凯通化学试剂有限公司 醋酸铅；天津市博士迪化工有限公司 氧化钙；沈阳市华东试剂厂 乙酸锌；天津市红岩化学试剂厂 EDTA；哈尔滨新达化工厂 蚊子草；黑龙江省佳木斯地区 2.2. 提取分离 鞣质的含量测定：精密称取样品粉末50 g三份 ， 分别用 30%的甲醇，50%的丙酮，蒸馏水溶液 500 ml， 在85℃的水浴条件下回流提取三次，每次 30 min，(第 一次回流提取之前先用 30%的甲醇等冷浸30 分钟)。 放冷，抽滤，合并滤液，于35 左右水浴温热 15 min。 精密吸取醋酸锌标准液(1 mol/L) 25 ml于500 ml容量 瓶中，振荡 1分钟，置上述水浴温热 30 min，间歇振 荡数次。冷却至室温，用30 %甲醇，50%丙酮，蒸馏 水定容。摇匀后放置过夜。用双层干滤纸抽滤，弃去 初滤液，抽滤 3次，续滤液备用。精密吸取 25 ml续 滤液于 500 ml锥形瓶中，加蒸馏水300 ml，pH = 10 的氨–氯化铵缓冲溶液25 ml，鉻黑-T 指示剂少许， 用0.05 mol/LEDTA-2Na滴定至溶液由紫红色变纯蓝 色，记录消耗 EDTA-2Na 的体积数，同时做空白对照 试验，按下列计算公式计算： 鞣质% = F0.1565 (Vs – V0) × M × 20 W × 100% 0.1565 为1摩尔每升醋酸锌标准溶液消耗量于鞣质含 量的比例常数，V0为空白试验消耗的EDTA-2Na 的体 积，M为EDTA-2Na 的体积的浓度，W为样品重，F 为校正因子。 Copyright © 2012 Hanspub 12  中药蚊子草中鞣质化学性质的研究 2.3. 实验的成分的预实验 实验的成分的预实验见表1，通过预实验证明蚊 子草中含有鞣质。 3. 实验定量 3.1. 样品溶液的制备 将500 ml容量瓶中的样品溶液分别移取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml的锥形瓶中，分别向 五个锥形瓶中加入 1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml缓 冲溶液，然后分别加入50/3 ml，100/3 ml，150/3 ml， 200/3 ml，250/3 ml的蒸馏水，分别加入少量指示剂络 黑-T。 3.2. 实验结果计算 计算公式：鞣质% = 0.1556 [VZn × CZn – VEDTA-2Na × CEDTA-2Na] × 20/M × 100%，实验数据见表 2。 平均值 = B1 + B2 + B3 + B4 + B5/5 标准偏差： 5 1 sX 21iXn 变异系数 RSD s X。 4. 结果与讨论 4.1. 提取溶剂的选择 在提取物制备中，文献报道也用 50%的丙酮或蒸 馏水提取，预实验发现丙酮提取样品会同时提取出大 量叶绿素，影响终点颜色的变化，且其空白试验也有 沉淀生成，而水提物不容易通过滤纸，且测试结果偏 低，并且从变异系数的角度看，30%的甲醇提取鞣质， 误差较小，所在提取鞣质并才用络合量测定鞣质的含 量时 30%的甲醇效果较好，实验数据见表3。 4.2. 络合沉淀金属离子的选择 在以金属的有机或无机的盐类鞣质做含量测定 时，文献上早已有不少叙述[15]，但多采用铜盐、铅盐 等，在方法上无外乎重量法，不仅操作复杂，而且他 们的专属性也不高，与若干非鞣质化合物成分均生成 沉淀，误差较大，结果很不准确，在本方法的条件下 锌盐有较高的选择性，与文献记载相符，锌在螯合物 化学中属于第一类形成体，能与元素周期表中第六族 Table 1. The tannin of Filipendula in the experiment 表1. 蚊子草中鞣质成分的预实验 类别 三氯化铁 醋酸铅 石灰水 火柴梗实验 水解鞣质 蓝 沉淀 青灰色 无现象 缩合鞣质 绿 沉淀 无现象 紫红色 Table 2. Data of experiment 表2. 实验数据 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 消耗 EDTA-2Na 1 2 3 4 5 甲醇 0.27 ml0.68 ml 0.92 ml 1.31 ml1.63 ml 丙酮 0.35 ml0.75 ml 0.95 ml 1.25 ml1.65 ml 水 0.35 ml0.88 ml 1.17 ml 1.35 ml1.85 ml Table 3. Results of experiment 表3. 实验结果 含量平均值 标准偏差 变异系数 回收率 甲醇 51.7081 3.3634 2.1898 51.7081 丙酮 52.6262 2.0982 3.9562 52.6262 水 51.4786 1.9830 3.8521 51.4786 第一元素(氧)形成最稳定的络合物，一般认为锌的离 子半径较小，电离势较大，在锌形成的螯合物中共价 键成分较多，且具有环状结构到等因素，故可知锌离 子与鞣质所形成的多核络合物具有足够的稳定性，可 运用其进行定量。 4.3. 络合沉淀的选择 络合沉淀的条件沉淀温度在 30℃~65℃之简均无 明显变化；当温度升高时，水解性鞣质的 Zn2+络合量 增加，乃由于鞣质在碱性溶液中加热引起水解，生成 没食子酸并继而与锌离子发生沉淀所致。缩合鞣质无 明显影响。此外，亦有可能因加热后影响格合物的稳 定常数(Kf)之故。络合物沉淀的生成经 20 分钟即可达 完全，久置后亦使氧化分解，但因没食子酸(或其它多 元酚)在该温度下(35℃ ± 2℃)未能与 Zn2+形成沉淀，所 以其值反趋下降。缩合鞣质不因酸碱分解，故无变化。 pH 值对络合物的形成颇为重要，金属离子与鞣 质生成络合物是金属离子取代-OH 基中的氢离子，通 过带电荷的氧与金属离子键合(进而与另一-OH 基键 合)，可见络合物的稳定常数Kf与[H+]间的密切关系。 实验表明，在酸性条件下(pH 低于 5)无沉淀生成；中 性时络合物沉淀极不稳定；弱碱性(pH 8~9)pH因锌盐 呈氢氧化物沉淀析出。本法选择在 pH 11 ± 0.2的氢氧 Copyright © 2012 Hanspub 13  中药蚊子草中鞣质化学性质的研究 Copyright © 2012 Hanspub 14 化氨溶液中进行沉淀，不仅使氢氧化锌沉淀溶解，促 进鳌合反应的完成与稳定，还可使鞣质与其它成分(如 生物碱)的化合物分解，进而与Zn2+络合沉淀。研究过 程中还发砚，沉淀剂的用量与试品溶液的稀释度对结 果有显著的影响。沉淀剂必须有足够的过量方可得稳 定的结果，此与反应的平衡有关试品溶液的加入须有 相当的稀释度，因为鞣质水溶液系一胶体溶液，胶粒 的大小及分散度与溶液的浓度有关，而它们可直接影 响反应的进行。 4.4. 关于操作方法 络合沉淀直接在容量瓶中进行，并以剩余滴定测 定Zn2+的络合量，可免除沉淀转移、洗涤、烧灼、溶 解等许多复杂的程序。经试验证实，此与不直接在容 量瓶中沉淀无显著差异。剩余滴定稍多加指示剂(1~2 ml)可使终点更为明显。关于空白对照检验(包括Zn++ 的格合沉淀与剩余滴定二方面)我们以皮粉吸附除去 鞣质后的样品溶液同法进行侧定,结果均不消耗 Zn++。 实验还表明，试品溶液(未加 Zn 沉淀)也不消耗EDTA， 因而省略了空白对照试验[16]。 4.5. 温度的设定 相关文献报道，基于鞣质遇热不稳定的化学性 质，鞣质加热提取 30 min或者 1 h，其含量将明显降 低，药典规定加热 30 min，吕湘林等采用水蒸汽抽提 1~2 h，都将造成结果偏低，本法采用温热条件浸提， 可避免加热处理，减少鞣质的分解。 5. 结论 通过对实验的各个方面的分析，方法的验证，试 验条件的选择，不同溶剂在提取鞣质的反方面表现其 优缺点，这一部分有实验方法限制，得出的结论是在 选用络合量测定鞣质的含量时，比较回收率，平均值 以及变异系数等个个方面，采用 30%的甲醇效果尤其 好，补充了丙酮提取时带来的叶绿素问题，同时也补 充了蒸馏水不容易通过滤纸的缺点，同时提取率也 高，综合分析用甲醇提取方法较好。并且通过对提取 物进行化学试剂的鉴定，为以后鞣质的鉴定工作提供 了很好的理论和实践依据，并判断了水解鞣质和缩合 鞣质的鉴别方法，提供了很好的理论依据。 6. 致谢 在此感谢黑龙江省科技厅科研项目(B201015)，黑 龙江省中医药管理局科研项目(ZHY12-Z195)，黑龙江 省教育厅科研项目(11551482)，2012 年佳木斯大学研 究生创新科研项目专项资金(YJSCX2012-037JD)，佳 木斯大学重大培育及面上科研项目(LZP2011-003， L2010-144)，佳木斯大学 2012 年“大学生创新创业训 练计划”校级项目(A-37)和校级培育项目(A-25) 对本 文研究工作的大力支持。 参考文献 (References) [1] 吉林省中医中药研究所. 长白山植物药志[M]. 长春: 吉林人 民出版社, 1982: 539. [2] 江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海: 上海人民出版社, 1997: 1092. [3] 金哲雄, 杨戈, 朴英爱. 蚊子草鞣质类成分研究[J]. 中国中 药杂志, 1994, 19(1): 32-33. [4] 孙允秀, 毛坤元, 姜文普. 蚊子草挥发油的结构鉴定和定量 分析[J]. 吉林大学自然科学学报, 1992, 1: 119-121. [5] 王玲玲, 刘斌, 石任兵. 荷叶黄酮类化学成分研究[J]. 北京 中医药大学学报, 2008, 31(2): 116-118. [6] 周娟, 胡英杰, 肖敏勋. 贯叶金丝桃的黄酮类成分研究[J]. 广州中医药大学学报, 2006, 23(5): 416-418. [7] 董建勇, 贾忠建. 赶山鞭中黄酮类化学成分研究[J]. 中国药 学杂志, 2005, 40(12): 897-899. [8] 殷志琦, 叶文才, 赵守训. 贯叶连翘的化学成分研究[J]. 中 草药, 2001, 32(6): 487- 4 88. [9] 杨念云, 段金廒, 李萍. 金钱草中黄酮类化合物的分离与结 构鉴定[J]. 中国药学杂志, 2006, 41(21): 1261-4261. [10] 杨锦竹, 曲晓宇, 李东飞, 刘银燕, 杨晓虹. 蚊子草化学成分 的研究[J]. 中国药物化学杂志, 2010, 20: 307-309. [11] C. BenNasr, N. Ayed and M. Metche. Quantitative determination of the polyphenoli-ccontent of pomegranate peel. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung iund-Forschung, 1996, 203(4): 186- 190. [12] K. Maceda, M. Fukuda. Arbutin: Mechanism of its depigment- ing action inhumammelanocyte culture. Journal of Pharmacol- ogy and Experimental Therapeutics, 1996, 276 (2): 765 - 768. [13] R. M. Halder, G. M. Richards. Topica.agents used in theman- agement of hyperpigmentation. Skin Therapy Letter, 2004, 9(6): 1-3. [14] 石春卉, 缪淑霞, 吕玉光, 苗洪志等. 中药蚊子草中醌类化学 成分的研究[J]. 分析化学进展, 2012, 2: 21-24. [15] I. Paran, R. W. Michelmore. Development of reliable PCR-based marker linkedtodowny mildew resistance genes in lettuce. Theo- retical and Applied Genetics, 1993, 85(8): 332-337. [16] M. Mars, M. Marrakchi. Diversity of pomegranate (Punica granatum L.) germplasm in Tunisia. Genetic Resources and Crop Evolution, 1999, 46(5): 174-178. |