 Asian Case Reports in Veterinary Medicine 亚洲兽医病例报告, 2012, 1, 1-4 http://dx.doi.org/10.12677/acrpvm.2012.11001 Published Online July 2012 (http://www.hanspub.org/journal/acrpvm) Advance Research on Avian Influenza Viruses Vaccine* Wenyao Lin, Dawei Liu, Ang Li 1Guangdong De Bao Ecological Raise Co. Ltd., Yingde 2Foshan Gaoming Xin Guang Agricultural and Livestock Co. Ltd., Foshan 3Qing Xin Jinyufeng Goose Industry Co. Ltd, Qingyuan Email: 275902708@qq.com Received: May 17th, 2012; revised: May 23rd, 2012; accepted: May 28th, 2012 Abstract: Avian influenza virus (AIV) is harmful to poultry industry. Currently, prevention of avian influenza is mainly by inactivated whole virus vaccines. The paper provided a review of the research and development of AIV as a refer- ence. Keywords: Avian Influenz a Viruses; Vaccine; Advance 禽流感疫苗研究进展* 林文耀 1，刘大伟 2，李 昂3 1广东得宝生态养殖有限公司，英德 2佛山高明新广农牧有限公司，佛山 3清新县金羽丰鹅业有限公司，清远 Email: 275902708@qq.com 收稿日期：2012 年5月17 日；修回日期：2012 年5月23 日；录用日期：2012 年5月28 日 摘 要：禽流感是严重危害养禽业的重要传染病。目前在禽流感的防治方面，以传统的全病毒灭活疫苗的应用 最为广泛。本文概述了禽流感疫苗的研究现状及发展方向，为禽流感的防治提供参考。 关键词：禽流感；疫苗；进展 1. 引言 禽流感不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而 且由于禽流感可直接感染人并导致死亡，给人类健康 带来严重的威胁。据报道， 2005 年以来 H5N1 亚型禽 流感病毒逐渐在欧洲、中亚和非洲大陆流行(http://www. OIE.int; http://www.WHO.int)。尤其值得注意的是，从 2005 年开始，H5N1 亚型禽流感病毒感染人的报道逐 渐增多。截至 2011 年5月13 日，据世界卫生组织统 计，全球共有 553 人感染 H5N1 亚型禽流感病毒，其 中死亡 323 人。这提示我们，随着时间的推移，H5N1 亚型禽流感病毒对人类健康的威胁在加大。虽然目前 发病的情况仍为个例，并未形成普遍流行的态势，不具 备人传人的特性。但是随着流感病毒的进化，流感病毒 在人与人之间传播也许会变为可能，因此我们必须予以 高度重视，坚持长期积极的流感病毒监测政策，有效地 防控 H5N1 亚型高致病性禽流感的暴发。目前在禽流感 的防治方面，以传统的全病毒灭活疫苗的应用最为广 泛，但自身也存在免疫剂量大，依赖于鸡胚生产，存在 散毒隐患，影响禽流感的监测和流行病学调查等缺点。 为此，本文概述了具有应用前景的禽流感疫苗研究现状 及发展方向，为禽流感的防治提供参考。 2. 全病毒灭活疫苗 *基金项目：广东省金羽丰鹅养殖健康农业科技示范基地(2011A 020502003)。 禽流感灭活疫苗能有效地减轻免疫鸡群的损失， Copyright © 2012 Hanspub 1  禽流感疫苗研究进展 并显著减少可能存在于鸡群和环境中的病毒数量，是 防控禽流感疫情发生的主要保障。灭活疫苗具有免疫 效果确实，免疫持续期长，生产成本较低等特点。东 南亚和非洲等部分国家使用禽流感全病毒灭活疫苗 进行禽流感的防控，是当今应用最广泛的禽流感疫 苗。疫苗株主要利用反向遗传技术降低病毒的毒力， 其中 HA 和NA 基因来源于生产环境流行的禽流感病 毒，其余的 6个内部基因片段来源于高度适应鸡胚生 长的 H1N1 亚型流感病毒PR8 株[1,2]。代表疫苗株有： 重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1 亚型，Re-5 株)，其 HA 基因来源于2006 年在安徽发病鸭群分离的 A/Duck/AnHui/1/06(H5N1)株，NA 基因来源于A/ Goose/GuangD ong/1/96(H5N1)，其余的 6个内部基因 片段来源于高度适应鸡胚生长的H1N1 亚型流感病毒 PR8 株，可在全国范围内用于各种禽类；重组禽流感 病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-4株)，其 HA 基因来 源于 2006 年在山西发病鸡群分离到的 A/n Chicken/ Shanxi/2/06 (H5N1)，NA 基因来源于 A/Goose/Guang- dong/1/96 (H5N1)，该疫苗对山西、宁夏等变异株以及 我国大部分流行株的侵袭均具有抵御作用，但对青海 斑头雁株等病毒攻击的保护率只有 90%左右，因此， 该苗不能取代Re-5 株疫苗。该疫苗需在我国农业部 指定范围内应用，主要在我国北方使用[3-5]。 3. 重组活载体疫苗 不能复制或者能复制但不致病的各种病毒，包括 痘病毒、疱疹病毒、杆状病毒、腺病毒、新城疫病毒、 水泡性口膜炎病毒等，被用作向免疫系统运输流感蛋 白的载体。禽流感重组活载体疫苗的研究进展相当迅 速，效果确实，显示了诱人的应用前景。 乔传铃等(2004)将禽流感病毒 A/Goose/Guang- dong/3/96(H5N1)毒株的 HA 和NA基因同源重组到禽 痘病毒基因组中，获得了能同时高效表达这两种蛋白 的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将 rFPV-HA-NA 经 翅膀刺种途径接种 8周龄SPF 鸡，免疫后 4周，分别 用10LD50 的高致病力禽流感病毒A/Goose/Guang- dong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进 行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水 平的抗体，能够完全抵抗H5N1 和H7N1 亚型禽流感 病毒的致死性攻击；并可有效阻止病毒在泄殖腔的排 出[6]。Ge 等(2007)以新城疫活疫苗病毒作为载体，把 A/Bar-headed goose/Qinghai/3/2005(H5N1)HA基因， 插在新城疫 LaSota 疫苗株 P基因和 M基因之间，利 用反向遗传操作技术，研制出禽流感-新城疫二联活疫 苗，该疫苗可同时预防新城疫和 H5亚型禽流感[7]。 Prabakaran 等(2010)以霍乱毒素 B亚单位为佐剂，给 实验小鼠经胃肠途径投放表面展示HA(clade 2.1)蛋白 的重组杆状病毒，能保护小鼠抵抗同源毒株(clade 2.1) 和异源毒株(clade1.0，clade8 .0 )的攻击[8]。Schwartz 等 (2011) 用水泡性口膜炎病毒载体表达 A/Vietnam / 1203/2004 (H5N1)HA蛋白的疫苗免疫猕猴，能产生很 好的中和抗体应答，对异源禽流感毒株的攻击能提供 一定的交叉保护能力[9]。 病毒活载体疫苗具有类似于常规弱毒疫苗的效 果，能有效地激发免疫应答反应，具有长远的开发前 景。但会受母源抗体的干扰或因机体对活载体的免疫 反应性质(载体效应)，可限制再次免疫的效果。解决 这些问题，对病毒活载体疫苗的商业化及其未来发展 相当重要。 4. 通用型流感疫苗 一种理想的流感疫苗应该是安全的，产生的体液 免疫和细胞免疫应答应该与自然感染相当，能提供长 期有效的保护，能提供交叉保护性的通用疫苗。血凝 素hemagglutinin (HA)，神经氨酸酶 neuraminnidase (NA)，基质蛋白 matrix protein (M1)，基质蛋白matrix protein (M2)，核蛋白 nucleoprotein (NP)等成为通用流 感疫苗的研究热点，其中对HA，M2 的研究最多。 HA 蛋白由一个三聚体组成，包括一个球状头部 和一个茎部区域。流感病毒的HA 蛋白，茎部区域是 保守的。根据系统发育树分析，16 种流感亚型可以分 为两大组。每一组在茎部都有一个保守的区域，中和 抗体可以作用于这一保守区域。第一组包括 H1，H2， H5，H6，H8，H9，H11，H12，H13，H16，第二组 包括 H3，H4，H7，H10，H14，H15[10,11]。同一组里， 某个流感亚型血凝素 HA茎部的单克隆抗体可以识别 在这一组里所有的不同流感病毒，并可以介导病毒的 中和反应。最近，美国国家卫生研究院研究人员报道， 通用型流感疫苗的问世极有可能。研究人员采用启动/ 增强分步接种方式，首先用编码 A/New Caledo- Copyright © 2012 Hanspub 2  禽流感疫苗研究进展 nia/20/99(H1N1)亚型流感病毒血凝素表面蛋白茎部的 基因序列作为 DNA 疫苗来启动免疫系统，然后将季 节性流感疫苗或携带有H1N1 亚型流感病毒HA 基因 的复制缺陷型腺病毒载体疫苗作为增强剂。免疫后的 实验小鼠和白鼬能抵抗从1934 年到 2004 年出现的所 有H1N1 亚型流感病毒毒株。提示我们不同流感病毒 毒株的血凝素茎部相对保守，针对血凝素茎部产生的 抗体能识别和中和多种流感毒株。这一研究成果为通 用型流感疫苗的研发奠定了基础[11]。Steel 等(2010)用 含有完整HA 基因的疫苗和缺少球形状头部，只含有 HA 基因茎部区域的疫苗分别免疫小鼠，发现只含有 HA 基因茎部的疫苗能产生较好的交叉保护能力[12]。 相关研究表明，针对特异亚型或者不同亚型流感病毒 的茎部区域产生的抗体对不同的流感毒株都具有交 叉保护能力[13,14]。 基质蛋白 M2 胞外区M2e(M2 extradomain, M2e) 为24个氨基酸，M2e 具有极高的保守性。对来源于人， 禽，猪，马等 716 株不同的 A型流感病毒的分析表明， M2e 的24 个氨基酸同源性高达 94%[15]。M2e 特异性 抗体虽然不能中和病毒，但是可以通过抗体介导的细 胞毒作用(ADCC)清除受感染的细胞，减少病毒的复制 [16,17]。基于 M2e 的流感疫苗研究进展迅速，某些产品 现在已经进入临床试验。赛诺菲巴斯德公司 M2e的实 验疫苗 ACAM-FLU-A是使用 M2e和载体相连的方式， 基因融合 M2e 和B型乙肝病毒核心抗原(HBc)，利用 重组病毒样颗粒(VLP)方式表达 M2e。ACAM-FLU-A 可以保护 70%的白鼬抵抗 H5N1 亚型高致病性禽流感 毒株的攻击[18] 。(http://www.bioportfolio.com; http:// www.sciencedaily.com)。美国 VaxInnate 公司的 M2e 与 鞭毛蛋白融合的流感疫苗已经进入临床二期，疫苗对 18~49 岁的健康志愿者是安全的，具有很好的免疫原 性(http://www.vaxinnate.co m)。 5. DNA疫苗 DNA 疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗，是指利用 DNA 重组技术将病原微生物的保护性抗原基因克隆 到真核表达载体上，并通过宿主细胞的表达系统合成 抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。 有关质粒 DNA 疫苗在禽流感预防和治疗作用的研究 报道不断增加，其中我国学者对禽流感DNA 疫苗进 行了相当多的研究，实验结果令人鼓舞。姜永萍等 (2004)构建表达高致病力禽流感病毒分离株 A/Goose/ Guangdong/1/96(H5N1)HA 基因的 DNA 疫苗质粒 pCIHA5，4周龄SPF 鸡免疫后3周用高致病性禽流感 GD/1/96(H5N1)的10 LD50 以肌肉注射途径攻毒，结果 表明 pCIHA5 虽具有较为稳定的免疫原性和免疫保护 性，但其免疫后HI 抗体产生水平明显低于灭活疫苗， 而且其免疫后抗体反应水平有一定的个体差异[19]。通 过对 HA 密码子进行优化和采用鸡 β-actin启动子表达 载体 pCAGGS，可显著提高 H5 亚型禽流感 DNA疫 苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效 果，对免疫鸡产生100%完全保护(不发病、不致死、 不排毒)，可以成为预防 H5 亚型HPAIV 的技术储备 候选疫苗[20-22]。 6. 新型弱毒疫苗 不同于冷适应株(25℃~26 ℃下鸡胚中连续传代得 到减毒毒株)，目前研究的新型弱毒疫苗主要集中在流 感病毒的非结构蛋白 NS1。NS1 蛋白与流感病毒的复 制有关，抑制宿主的固有免疫应答，阻止宿主产生干 扰素。通过改变或基因敲除 NS1 蛋白而制备的流感疫 苗株能阻止病毒的复制，提高体液免疫和细胞免疫反 应，产生高水平的干扰素和其他细胞因子[23,24]。早期 的临床研究表明，健康志愿者鼻内接种 NS1 缺失流感 疫苗 DeltaNS1-H1N1具有很好的耐受性，产生的中和 抗体可以中和异源禽流感变异毒株[25]。 7. 结语 目前，禽流感预防主要采用全病毒灭活疫苗，该 疫苗存在着免疫剂量大，并且依赖于鸡胚生产，灭活 不彻底，干扰流行病学的血清学监测等缺点。更令人 担心的是禽流感病毒不仅变异迅速，而且出现不同亚 型病毒同时流行的现象。传统的禽流感疫苗难以提供 有效的交叉保护，不利于疫病的防控。理想的禽流感 疫苗应该对各种亚型的禽流感病毒都有效。通用型流 感疫苗对不同亚型流感病毒都具有广泛交叉免疫保 护能力，因此，通用型流感疫苗将会是流感疫苗未来 的研究方向。 参考文献 (References) [1] T. 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