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Material Sciences 材料科学, 2012, 2, 133-138
http://dx.doi.org/10.12677/ms.2012.23024 Published Online July 2012 (http://www.hanspub.org/journal/ms)
Preparation of Antimicrobial Silk Hydrogels for
Surgical Dressings*
Xil on g Wu 1, Y iyun Shen2, Shan Sun1, Xiu Zhang1, Shenzhou Lu1#
1National Engineering Laboratory for Modern Silk, College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou
2College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou
Email: #lushenzhou@suda.edu.cn
Received: Jun. 25th, 2012; revised: Jul. 5th, 2012; accepted: Jul. 12th, 2012
Abstract: Using quaternary ammonium salts (QAS) as initiating agents, silk fibroin aqueous solutions were induced to
gel rapidly. The structure, zeta-potential change and thermal stability properties of QAS-induced silk gel were charac-
terized by means of X-ray diffraction (XRD), infrared spectroscopy (IR), scanning electron microscopy (SEM), zeta-
potential measurements and differential thermal analysis (DTA). The results show that QAS-induced silk gelation is
accompanied by the formation of β-sheets and less negative zeta-potential values. With the observation of SEM, the
internal morphology of gel exhibited a porous three-dimensional network structure. In vitro degradation and DTA
analysis revealed that QAS-induced fibroin gel was not quite stable and disintegrated more easily in the enzyme solu-
tion. Also, QAS is amorphous or metastable crystal state in silk gel and thus easy to release and diffuse. The antibacte-
rial test in vitro suggested that silk-QAS gel showed distinctly antibacterial activities against both Gram-positive and
Gram-negative bacteria. In situ antimicrobial silk hydrogel is expected to be used for a surgical dressing.
Keywords: Silk Fibroin; Hydrogel; Quaternary Ammonium Salt; Antibacterial Materials; In-Situ Gelation
抗菌丝素蛋白水凝胶敷料
的制备*
吴锡龙 1,沈旖云 2,孙 姗1,张 秀1,卢神州 1#
1苏州大学纺织与服装工程学院,现代丝绸国家工程实验室,苏州
2苏州大学医学部药学院,苏州
Email: #lushenzhou@suda.edu.cn
收稿日期:2012 年6月25 日;修回日期:2012年7月5日;录用日期:2012 年7月12 日
摘 要:季铵盐类抗菌剂作为凝胶促进剂,诱导丝素蛋白水溶液快速原位凝胶化从而制备抗菌性丝素水凝胶敷
料。利用 X射线衍射、红外光谱、扫描电镜、zeta 电位分析、差热分析等手段对所制丝素水凝胶的结构、zeta
电位、热稳定、降解性及其抗菌性能进行了表征。研究结果表明,季铵盐会引起丝素颗粒负电位值下降,由此
促发形成的丝素水凝胶为 β-折叠片层结构,凝胶内部形貌为多孔的三维网状结构,且对革兰氏阳性菌和阴性菌
都有很明显的抗菌效果。同时由体外降解、差热分析结果可知,季铵盐引发丝素蛋白溶液快速形成水凝胶,蛋
白酶可以在体外降解水凝胶。季铵盐在水凝胶中主要以无定形或亚稳态晶体状态存在,容易扩散释放,达到较
好的抗菌效果。抗菌性原位丝素蛋白水凝胶预计可以用于外科伤口敷料。
关键词:丝素蛋白;水凝胶;季铵盐;抗菌材料;原位凝胶化
*资助信息:江苏省高校自然科学科学基金项目(10KJB540002);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目。
#通讯作者。
Copyright © 2012 Hanspub 133
抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备
Copyright © 2012 Hanspub
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1. 引言
水凝胶是一种三维的交联网孔结构并具有超过
90%的水含量[1], 因其良好的生物相 容性在临床医 学
领域具有广泛的应用,可作为隐形眼镜,生物传感器
薄膜,人工皮肤,药物释放载体等[1,2]。其中,作为外
科伤口敷料,水凝胶因其自身结构特性而具有独特的
优势:能允许气体交换、吸收伤口多余渗液并保持创
面的湿润、止痛和减少炎症、更换方便、能控制药物
缓慢释放以使伤口局部达到适宜的药物浓度等[3-5]。而
蚕丝是一种具有优良生物相容性的天然高分子材料,
作为外科手术缝合线已经使用了近百年,对机体无过
敏或免疫反应[6]。然而,水凝胶类敷料对于细菌的隔
离作用不强,会选择性允许革兰氏阴性菌生长[7]。对
于皮肤表层伤口、烧伤、软组织挫伤的创面等外科伤
口而言,细菌在伤口处的生长繁殖会加重伤口感染、
疼痛,从而阻碍伤口的痊愈。因此开发具有一定抗菌
效果的水凝胶材料可以弥补这个缺点,对于拓宽丝素
水凝胶的临床应用也具有极为重要的意义。季铵盐类
抗菌剂是一类研究较多的阳离子活性杀菌剂,广泛应
用于外科手术和医疗器械的消毒,如新洁尔灭等,其
主要是通过吸附于细菌表面,穿透细胞壁并对其有裂
解作用,导致菌体团聚和分裂从而达到较好的杀菌效
果[8,9]。本文采用丝素蛋白作为水凝胶基质材料,以季
铵盐类抗菌剂作为凝胶促进剂,促使丝素蛋白溶液快
速原位凝胶化,同时改善丝素凝胶的抗菌性能,利用
扫描电镜、X射线衍射、红外光谱、zeta 电位测试和
差热分析(DTA)等手段对凝胶结构、热学性能及其体
外降解性能进行了研究。
2. 材料与方法
2.1. 材料制备
将家蚕生丝在 0.02 M Na2CO3中煮沸 30 min并用
去离子水漂洗以除去丝胶蛋白.然后将脱胶丝溶解于
9.3 M LiBr 水溶液中,并将其置于截留分子量为 8~10
kD 的透析袋中透析三天,经离心过滤得到4.0 wt%浓
度的丝素溶液。
将三种常见的季铵盐类(QAS)抗菌剂十二烷基二
甲基乙基溴化铵(EDDAB)、洁尔灭(BC)、杜灭芬(DB)
配制成 10 wt%的水溶液,再分别以10/90、5/95、1/99
的比例与丝素溶液充分混合均匀,室温下迅速形成一
系列具有不同季铵盐浓度的丝素凝胶。用打孔模具将
其制成一定尺寸的样品,用作体外降解和抗菌测试,
并分别以纯丝素凝胶作为对照。
2.2. 凝胶结构表征
将按上述方法制备的其中三种季铵盐/丝素(5/95)
凝胶样品、纯丝素凝胶和丝素溶液分别冷冻干燥,并
研磨成微小的粉末颗粒,用80 目筛子筛选出的微粒
用于 X射线衍射(XRD)测试,采用铜靶,超能探测计
数器记录2θ = 5˚ - 45˚之间的衍射强度曲线。红外吸收
光谱(FTIR)测定采用KBr 压片法,测试 400~4000 cm–1
的吸光度。
将丝素水凝胶放入液氮中,速冻固定,真空干燥,
扫描电镜观察凝胶的截面形貌。
2.3. Zeta电位变化
将新鲜丝素溶液分别以100/0、95/5、90 /10、85/15、
80/20的比例与 10%的EDDAB 水溶液共混,并在液
体快速混合器上快速涡旋混合充分,立即吸取 1 ml
置于样品池中,在常温下测其zeta 电位值。每个样品
各进行五次测试,去除两个较大偏差值,取中间值的
平均值为最终的测试结果。
2.4. 体外模拟降解
用模具制备尺寸为 5 ± 2 mm(直径) × 5 mm(高)的
丝素/EDDAB(95/5)凝胶块并将其分别浸入含 5 U/ml
蛋白酶ⅩⅣ的PBS溶液(浴比为1/10)、PBS和纯水中,
以纯丝素凝胶作为对照样品。所有试样放置于 37℃的
恒温培养箱中降解,每24 h 换液一次。在特定时间点
6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 时,分别取
出相应样品、擦干、称重、计算降解重量剩余率。每
个样品测定 3个平行样,取平均值。
2.5. 差热分析
利用差热分析法(DTA)研究 EDDAB 分布在丝素
凝胶中的晶体状态。分别取纯 EDDAB、丝素/ED-
DAB(95/5)凝胶冻干样品、纯丝素冻干凝胶和EDDAB
的物理混合物(EDDAB 成分重量占 5%)各约 5 mg,在
35℃~400℃范围内,以 10℃/min 的升温速率加热,在
氮气流下进行DTA 分析。
抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备
2.6. 抗菌性能测试
测试方法参照抗菌性能评价标准(GB/T 20944.1-
2007),采用琼脂平皿扩散法并加以改进。将培养好的
两种试验菌液(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)以2 × 108
CFU/ml的菌浓度用涂布方式接种到琼脂培养基上,
然后将尺寸为10 ± 2 mm(直径) × 5 mm(高)的凝胶小
块分别均匀地按压在琼脂培养基上,立即放入 37℃的
恒温培养箱中培养 24 h,测定抑菌带宽度并用显微镜
观察试样下面与琼脂接触区域的细菌繁殖情况。为便
于观察比较,对于相同种类并含不同浓度季铵盐的丝
素凝胶试样及其对照样置于同一个培养皿中,并相间
90˚左右放置。
3. 结果与讨论
3.1. 季铵盐引发丝素结构变化
由三种季铵盐引发的丝素结构变化如图 1所示。
新鲜的丝素溶液(a曲线)为一宽峰,代表丝素为无定形
结构,而其他所有丝素凝胶样品在衍射角20.5˚处都呈
现出显著的衍射峰,在9.1˚和24.2˚附近也出现较弱的
峰且丝素–EDDAB 凝胶的这两个峰更加明显,强度
相对较强,这些特征衍射峰表明三种季铵盐–丝素凝
胶中丝素均为Silk II(β-折叠)结晶结构[10]。根据丝素凝
胶样品的红外光谱(图1(B))可以看出,对样品a(丝素
溶液),1656 cm–1,1539 cm–1,1241 cm–1 分别是酰胺
I,酰胺 II 和酰胺 III 谱带的红外吸收峰,代表丝素为
无规卷曲结构。而对于其它凝胶样品,特征吸收峰出
现在 1628 cm–1,1525 cm–1,1233 cm–1 附近,显示出
丝素蛋白典型的β-折叠结构[11]。由此可见,季铵盐引
发丝素溶液的凝胶化过程,伴随着丝素蛋白构象由无
规线团向β-折叠结构的转变。
用扫描电镜观察丝素–EDDAB 凝胶截面形貌情
况,如图 2所示,凝胶内部为紧密相连的多孔结构(孔
径 ≤ 5 µm),并且孔间相互贯通形成空间网状结构。
5 1015202530354045
A
20.5

c
b
a
e
2

Diffrac ti on in te n sit y (cp s)
d
1800 1600 1400 1200 100080
0
e
T
rans m
itt
ance
(%)
a
b
c
d
B
Wav enumber
(
cm
-1
)
1628 1525
1656 1539
1233
1241
Figure 1. WAXD curves (A) and FTIR data (B) collected from (a) Silk solution; (b) Pure silk gel and QAS-induced silk gels; (c) Silk-DB gel;
(d) Silk-BC gel; (e) Silk-EDDAB gel. All the concentrations of QAS in silk gels are 5 wt%, the concentration of fibroin was 4 wt%
图1. 丝素/季铵盐水凝胶的结构,X-射线衍射曲线(A)和红外光谱图(B):(a) 纯丝素溶液;(b) 纯丝素凝胶;(c) 丝素–杜灭芬凝胶;(d) 丝
素–洁尔灭凝胶和;(e) 丝素–EDDAB 凝胶(季铵盐占总质量的 5%,丝素蛋白浓度为 4 wt%)
Figure 2. SEM images for freeze-dried silk h yd rogels prepared with 5% EDDAB
图2. 丝素/EDDAB(95/5)冻干凝胶的截面形貌
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抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备
3.2. Zeta电位的变化
利用 zeta 电位分析仪测得丝素溶液 zeta电位值随
EDDAB 加入浓度的变化情况如图3所示,纯丝素溶
液zeta 电位为(–4.32 ± 0.08) mV (n = 3),随着EDDA B
浓度的提高,季铵盐会抵消丝素蛋白颗粒所带的净负
电荷,混合溶液体系中zeta 电位会变大(趋向于零),
表明整个丝素溶液体系向零电位趋近,导致丝素蛋白
大分子间易发生凝聚,也为纤维状丝素蛋白分子链间
的缔合创造条件,这可能与丝素溶液的快速凝胶化有
一定关系。
3.3. 凝胶的体外降解
季铵盐(EDDAB)引发的丝素凝胶样品在水、
PBS(pH = 7.4)、蛋白酶ⅩⅣ液中降解 3天(如图4(A)),
酶液中前12 h降解较快,12 h 时降解剩余至 60%,而
后降解速率明显减缓,36 h 时达 50%左右,最终 72 h
内降解剩余 38.6%;而 在PBS 和纯水中也有一定程度
的降解,PBS 中前 36 h 内降解较缓,此后降解速度加
快,在72 h内降解剩余率为60.3 %,在纯水中最终降
。而纯丝素凝胶降解 7天(如图 4(B)),
在PBS 和纯水中都未有显著的降解,而在酶液中剩余
率还有 83%左右。可见,由季铵盐(EDDAB)快速诱发
形成的丝素凝胶与纯丝素凝胶相比,更容易被降解,
而且降解的速度也比较快。
3.4. 凝胶的热学性能
由差热分析(图5(a))可知,EDDAB 的熔化吸热峰
在194℃,分解峰在251℃左右。丝素凝胶与EDDAB
物理混合物的吸热峰叠加,丝素蛋白的分解峰出现在
290℃附近(图5(b)),同时 192℃、248℃附近出现
EDDAB 的熔化峰和分解峰,说明物理混合状态下
EDDAB 的物理状态并没有发生改变。而丝素–EDDAB
凝胶中没有出现 EDDAB的吸收峰(图5(c)),只有丝
素凝胶的吸热分解峰(296℃),说 明EDDAB 在丝素凝
胶中其结晶状态发生了变化,可能以无定形或亚稳晶
体状态存在,与丝素蛋白分子间形成一定的相互作用
力;另外也可以看出丝素–EDDAB 凝胶热稳定性比
纯丝素凝胶高(分解峰 296℃ > 290℃)。
解剩余率为71%
100/095/590/10 85/15 80/20
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
Zeta potential (mv)
SF/EDDAB
Figure 3. Zeta potentials for 4 wt% SF s ol uti on s with different concentrations of EDDAB (n = 3)
图3. 不同浓度 EDDAB 对丝素溶液 zeta 电位的影响
Figure 4. Degradation of silk/EDDAB (95/5) gel (A) and pure silk gel (B) in vitro (incubated at 37˚C)
图4. 丝素–EDDAB 凝胶(95/5)(A)和纯丝素凝胶(B)的体外降解(37℃)
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抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备
Figure 5. DTA thermograms of ( a) Pure EDDAB; (b) Physical
mixture of pure silk gel and EDDAB and (c) Silk-EDDAB gel
图5. 差热分析(DTA):(a) 纯EDDAB;(b) 冻干丝素凝胶和
EDDAB 的物理混合物;(c) 丝素–EDDAB 凝胶
Figure 6. Inhibition zone assay on agarose plates with E. coli (up-
per panels) and S. aur eus (down panels). The concentrations of
quaternary ammonium salts in gels (A, D. Silk-EDDAB Gel; B, E.
Silk-BC Gel; C, F. Silk-DB Gel) were 10%, 5% 1%, 0%, respec-
tively, from the left on a clockwise direction
图6. 抑菌性能测试(上排:大肠杆菌;下排:金黄色葡萄球菌)。
凝胶中季铵盐浓度从左逆时针方向依次为 1 0%, 5% 1% , 0% (A、
D. EDDAB
Table 1. Inhibition zone diameters of antimicrobial silk gels
表1. 抗菌丝素凝胶抑菌圈直径
E. coli (mm) S. aureus (mm)
;B、E. 洁尔灭;C、F. 杜灭芬)
Gel
10% 5% 1% 0% 10% 5% 1%0%
EDDAB 11 7.5 0 0 18.5 14.5 11.50
BC 8 5.5 0 0 16.5 12.5 4 0
DB 7.5 4.5 0 0 8.5 6 1.90
3.5. 凝胶的抗菌性能
从抑菌照片
言,纯丝素凝胶均未产生抑
在逐渐增加,说明在形
胶的过程中三 铵盐仍保持抑菌性能,且
散释放,使得抗菌效果愈加
显著
,且与自然
成的纯丝素凝胶相比更容易降解。
2) 季铵盐在丝素凝胶中是以无定形或亚稳态晶
型存在,较容易地向外扩散释放,季铵盐–丝素凝胶
对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很明显的抗菌效果。
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与琼脂接触区域的细菌繁殖情况,菌落直径相比周围
区域减少接近一半,说明纯丝素凝胶本身抗菌效果有
限;而三种季铵盐–丝素凝胶与琼脂接触区域均无细
菌繁殖,说明均有较好的抗菌效果,且随着季铵盐浓
度的提高,凝胶抑菌圈宽度也
成丝素凝 种季
随其浓度增大而不断地扩
。
抑菌圈直径由表 1可知,在相同季铵盐浓度下,
混有 EDDAB 和洁尔灭的丝素凝胶对两种革兰氏细菌
的抗菌效果都明显优于杜灭芬/丝素凝胶,这可能与不
同季铵盐的扩散释放程度和其自身抗菌性能差异有
关。总体上,三种丝素–季铵盐水凝胶对金黄色葡萄
球菌的抗菌效果相对更好。特别地,当各自浓度为1%
时,对于大肠杆菌均未产生明显的抑菌带,而对于金
黄色葡萄球菌抑菌效果则比较显著。
4. 结论
1) 季铵盐能够促发丝素凝胶原位成型
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