 Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2012, 2 19-22 http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2012.23005 Published Online July 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjbm) Anti-Tumor Activity of the Peptide from Bullacta exarata Huanle Lin, Zhiyi Li, Bo Chen, Zhongda Yi, Zefeng Wang, Jianyin Ma* School of Food and Pharmacy, Donghai Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan Email: *chymjy@zjou.edu.cn Received: May 30th, 2012; revised: Jun. 29th, 2012; accepted: Jul. 5th, 2012 Abstract: Objective: To isolate and purify the peptide from Bullacta exarata, and study its anti-tumor effect on prostate cancer. Methods: The antimicrobial peptides were hydrolyzed from soft tissues of Bullacta exa rata by trypsin, and purified by sephadex chromatography. Measured by MTT assay in vitro anti-tumor activity and cell morphology was observed by fluorescence staining. Results: The components separated from membrane (molecular weight 5 - 10 KD)and isolated by the Sephadex G-75 could inhibitse the PC-3 cells growth, and the latter stronger than the former. Conclusion: The Bullacta peptides could inhibitse the PC-3 cells growth and have anti-tumor activities on prostate cancer. Keywords: Peptides of Bullacta Exarata; Anti-Tumor; Enzymatic; Prostate Cancer 泥螺多肽抗肿瘤活性的初步研究 林焕乐，励芝伊，陈 博，易忠达，王泽峰，马剑茵* 浙江海洋学院东海科学技术学院食品与药学系，舟山 Email: *chymjy@zjou.edu.cn 收稿日期：2012 年5月30 日；修回日期：2012年6月29日；录用日期：2012 年7月5日 摘 要：目的：提取分离泥螺软体组织，探索其体外抗肿瘤活性。方法：采用胰蛋白酶酶解法获得泥螺多肽粗 提物，通过超滤膜滤过技术获得分子量在5~10 kDa的组分。用葡聚糖凝胶G-75 分离、纯化，MTT 法测定其体 外抗肿瘤活性并用荧光染色法观察细胞形态。结果：经膜分离得到的组分(分子量 5~10 KD)和经葡聚糖凝胶 G-75 分离得到的泥螺多肽对前列腺PC-3 肿瘤细胞均有一定的抑制作用，且后者强于前者。结论：泥螺多肽具有一定 的抗前列腺PC-3 肿瘤细胞的活性。 关键词：泥螺多肽；抗肿瘤；酶解；前列腺癌 1. 引言 泥螺(Bullacta exarata)，俗称“吐铁”、“黄泥螺”、 “梅螺”等[1]，隶属于腹足类后鳃亚纲软体动物，由 贝壳和软体两部分组成，为西太平洋沿岸半咸水滩涂 的习见种类，广泛分布于我国南北沿海潮间带滩涂， 是典型潮间带底栖匍匐动物，多栖息在中底潮带，泥 沙或沙泥的滩涂上，在风浪小、潮流缓慢的海湾中尤 其密集，以东海和黄海产量最多。其生物体内蛋白含 量丰富，多肽物质丰富。 一些生物活性多肽常以非活性状态存在于蛋白 质中，这些蛋白质经过蛋白酶的水解作用，使隐藏于 其中的活性肽释放出来，有可能发挥出比蛋白更多的 生物活性[2-4]。当今社会，人们受肿瘤的严重危害，寻 找低毒、高效的抗肿瘤药物迫在眉睫。而海洋物质丰 富，近年来有报道海洋天然活性成分具有一定的抗肿 瘤活性[5,6]。本文以新鲜的泥螺软体组织为对象，提取 分离了不同分子量的泥螺活性多肽，并对分子量在 5~10 kDa 的组分进行体外抗肿瘤活性的初步研究，为 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 19  泥螺多肽抗肿瘤活性的初步研究 抗肿瘤药物的研发提供参考。 2. 材料与仪器 2.1. 材料 泥螺，购于舟山南珍菜场。胰蛋白酶(国药集团化 学试剂有限公司)；葡聚糖凝胶 G-75(Pharmacia)；其 余试剂均为分析纯。 2.2. 主要仪器 BSA124S 型电子天平(德国，Sartorius AG公司)； DS-1 型高速组织捣碎机(上海标本模型厂)；高速冷冻 离心机 CF16RXII( 日立 HITACHI公司)；TG16-WS 台 式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)； SHB-III A循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限 公司)；旋转蒸发器RE-2000(上海亚荣生化仪器厂)； U2800 型紫外可见分光光度计(日本，HITACHI公司)； 自动部分收集器(BSZ-40-LCD)；HWS26 型微电脑电 热恒温槽(上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器 有限公司)；Spectrum 752 p 紫外可见分光光度计(上海 恒平科学仪器有限公司)；MSC300 超滤杯(超滤膜：5 kDa 和10 kDa)(上海摩速科学器材有限公司)；LGJ-18 冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)； QT-58A 智能紫外检测仪(上海琪特分析仪器有限公 司)；QT-199FC-LCD 智能自动部分收集器(上海琪特 分析仪器有限公司)。 3. 方法 3.1. 酶解 泥螺去壳，取其软体采用组织捣碎技术捣碎，于 –20℃冷藏备用。取上述经捣碎的泥螺软体组织用胰 蛋白酶酶解，选用最佳酶解条件[5]，即酶解温度 45℃， pH 8.7，料液比 1:4，酶解时间8 h，加酶量 0.48%。 经灭酶后，在转速 8500 rpm 左右，温度为4℃条件下 离心 25 min，弃去滤渣。 3.2. 酶解产物膜分离 取上述澄清液，使用超滤杯及截取分子量分别为 5 kDa 和10 kDa 的超滤膜，截取后分别获得分子量为 5~10 kDa 的酶解液，旋转蒸发，冷冻干燥获得固体粉 末。 3.3. 葡聚糖凝胶层析分离 Sephadex G-75用4℃蒸馏水溶胀 12 h，装入 2.6 cm × 100 cm 层析柱。取备用的冻干样品用3 mL 去离 子水溶解(0.1 g·mL–1)后，0.22 μm微孔滤膜过滤，上 柱。用超纯水平衡、洗脱，流速1.5 mL·min–1，每 2 min 收集 1管，即每1收集管为 3 mL的流出液，分别将 各收集管的流出液在波长280 nm处测定吸收值。收 集洗脱峰，浓缩冻干备用。 3.4. 细胞培养 选取人前列腺癌细胞 PC-3(原购自中科院上海细 胞库，由本实验室传代保存)，用含10%胎牛血清的 F12 完全培养基于 37℃，5% CO2的培养箱中培养， 细胞呈单层贴壁生长，0.25%的胰蛋白酶消化，每 2~3 天传代 1次，实验时选用对数生长期细胞。 3.5. 细胞增殖抑制率的测定 采用 MTT 法检测。取对数生长期的前列腺癌 PC-3 细胞制成悬液，接种至96 孔板，每孔 200 μL， 置5% CO2，37℃培养箱中分别培养 24 h，然后分别 加入不同浓度泥螺多肽溶液，每个浓度设 3个平行孔， 同时设不加药对照组，置 5% CO2，37℃培养箱中孵 育24 h、48 h、72 h。培养结束后，加 PBS 溶液(pH 7.2) 清洗 3次，再加 MTT 继续培养 4 h，吸弃 MTT，加 二甲基亚砜每孔150 μL，置酶联免疫检测仪在 490 nm 测吸光度，计算细胞增殖抑制指数(IR)[7]。计算公式如 下： OD OD IR 100% OD OD 阴性对照组值 实验组值 阴性对照组 值凋零孔 值 3.6. 细胞凋亡的形态学分析 取处于指数生长期的 PC-3细胞，加入适量 0.25% 胰酶消化，用含 10%进口小牛血清的 1640 培养液配 成悬液，用血球细胞板计数，配成2 × 105·mL–1，取 放有盖玻片的 6孔细胞培养板，每孔加细胞悬液 3 mL，将细胞板放在37℃，含5% CO2的培养箱中分别 孵育 24 h 后取出。将每组药液分别加入各孔中，再将 细胞板放在 37℃，含5% CO2的培养箱中分别孵育 24 h后取出细胞培养板。取出载玻片，加 1滴混合荧光 染色液：100 μg·mL–1 吖啶橙(AO)和100 μg·mL–1 嗅乙 Copyright © 2012 Hanspub 20  泥螺多肽抗肿瘤活性的初步研究 Copyright © 2012 Hanspub 21 啶(EB)混匀，压上爬满细胞的盖玻片，荧光显微镜下 观察凋亡细胞形态。 作用。 实验结果表明，5~10 kDa 组分和峰 2对前列腺 PC-3 癌细胞都有一定的抑制作用，并且随着浓度的增 加和时间的推移其抑制作用逐渐加强。峰2浓度为 30 mg· mL –1 时，对前列腺 PC-3 癌细胞抑制效果较明显。 然而当峰 2浓度为 20 mg·mL–1 时，虽有抑制效果但其 抑制效果明显低于 30 mg·mL–1 时的抑制作用，也比 5~10 kDa 组分的抑制效果差(表1和图2)。 4. 结果与分析 4.1. 葡聚糖凝胶 G-75 分离峰图 酶解后的泥螺多肽混合物，经超滤膜分离，获得 不同分子量的粗提物。选取分子量为 5~10 kDa的酶 解液，经葡聚糖凝胶 G-75柱层析分离，在280 nm 紫 外分光光度计检测下，测定其吸收峰如图 1所示。结 果表明，第15 管~19 管的流出液出现 1个吸收峰，第 42 管~58 管的流出液又出现 1个吸收峰，葡聚糖凝胶 洗脱得到的两个峰分离较好，记为峰1、峰 2。由于 本实验室前期的研究中，已通过正交法得到了泥螺活 性肽的最佳酶解条件，并且已对3 kDa 组分进行了初 步的抗癌活性研究[8]。因此本实验在此基础上采用 G75葡聚糖凝胶对 5~10 kDa多肽产物进行分离、纯 化，并测定其体外抗肿瘤活性。 4.3. 细胞凋亡的形态学分析 图3正常 PC-3细胞，核染色质呈均匀黄绿色， AO/EB 染色 × 400。 图4浓度为 20 mg·mL–1 的泥螺多肽作用于 PC-3 细胞 24 h，晚期凋亡细胞较多，核染色质固缩，呈桔 红色。但有部分细胞属于早期凋亡，细胞膜完整，核 染色质固缩，呈现黄绿色，AO/EB 染色 × 400。 图5浓度为 30 mg·mL–1 的泥螺多肽作用于 PC-3 细胞 24 h，随着浓度的增加，细胞死亡增多，且核染 色质固缩，呈均匀一桔红色，AO/EB染色 × 400。 4.2. 细胞增殖抑制率的测定 泥螺多肽作用PC-3 细胞 24 h后，细胞经 AO、 B双染色，在荧光显微镜下可见 4种细胞。活细胞： E 按照 2.5方法所示观察对 PC-3 细胞株的增殖抑制 Figure 1. Sephadex G-75 gel chromatography of the Bullacta peptides (5~10 kDa) 图1. 泥螺多肽 5~10 kDa组分葡聚糖凝胶 G-75 峰图 Table 1. Inhibition rate of Bullacta peptides on PC-3 cells 表1. 泥螺多肽 5-kDa 组分和峰 2对前列腺 PC3癌细胞的抑制率 峰2 5~10kDa 时间 30 mg/mL 20 mg/mL 30 mg/mL 20 mg/mL 24 47.85% 8.47% 26.78% 20.12% 48 60.43% 15.16% 35.49% 26.41% 72 73.60% 19.64% 41.65% 33.35%  泥螺多肽抗肿瘤活性的初步研究 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 0 244872 T(H) IR(%) 峰2 30mg/ml 峰2 20mg/ml 5-10KDa 30mg/ml 5-10KDa 20mg/ml Figure 2. Effects of Bullacta peptides on the proliferation of PC-3 cells 图2. 泥螺多肽 5~10 kDa组分和峰 2对前列腺 PC3 癌细胞的抑制率与时间关系 Figure 3. Normal cells with EB/OB staining 图3. 正常细胞 AO/EB 双染荧光显微镜观察图 Figure 4. Low concentration of Bullacta peptides with EB/OB staining 图4. 低浓度多肽作用下 AO/EB双染荧光显微镜观察图 Figure 5. High concentration of Bullacta peptides with EB/OB staining 图5. 高浓度多肽作用下 AO/EB双染荧光显微镜观察图 核染色质呈均匀黄绿色；早期晚期凋亡细胞：细胞数 较少，细胞膜完整，但核染色质固缩，呈黄绿色荧光； 晚期凋亡细胞：核染色质固缩，呈桔红色；死亡细胞： 细胞染成均一桔红色。并且随着泥螺多肽剂量的增加， 晚期凋亡和死亡细胞逐渐增多，晚期凋亡细胞核浓聚， 被染成桔红色，而死亡细胞被染成均一的桔红色。 5. 小结 本实验结果提示，采用胰蛋白酶酶解泥螺软体组 织，并经超滤膜分离得到分子量为 5-10kDa 的粗提物， 进一步通过 G75 葡聚糖凝胶柱层析分离，所得到的多 肽产物对前列腺 PC-3细胞具有一定的抗肿瘤活性。 其抗肿瘤活性多肽的进一步分离纯化以及作用机制 还有待于深入研究。 参考文献 (References) [1] 李晔, 苏秀榕, 李太武. 泥螺抗菌肽的初步研究[J]. 台湾海 峡, 2005, 2(24): 145-149. [2] Y. Kohama, K. Suetsuna, Y. Wako, et al. Angiotensin I convertingenzyme inhibitors in fish water-soluble protein hydro- lysates prepared by bioreactor. Food Science and Technology Research, 1999, 5: 378-380. [3] K. Suetsuna, J. R. Chen. Dentification of ntihypertensive pep- tides from peptic digest of two microalgae, Chlorella vulgaris and Spirulina platensis. Marine Biotechnology, 2001, 3(4): 305- 309. [4] F. Guerard, L. Dufosse, D. L. Broise, et al. 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