 Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2012, 2, 25-28 http://dx.doi.org/10.12677/aac.2012.23005 Published Online August 2012 (http://www.hanspub.org/journal/aac.html) Determination of p-Toluenesulfonamide Content in Gliclazide Lekun Wei Pharmaceutical Industry Research Institute of Shandong Province, Jinan Email: wlk1212@163.com Received: Aug. 6th, 2012; revised: Aug. 15th, 2012; accepted: Aug. 24th, 2012 Abstract: Objective: To establish a method for the determination of p-Toluenesulfonamide content in Gliclazide. Methods: Using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method with an Agilent ZORBAX Eclipse XDB C8 column. External standard method for quantitative. Results: The liner range of impurity p-Toluenesulfonamide was 0.4 - 1.2 g/ml, which showed good linearity (r = 0.9993). The average recovery was 99.1%. Conclusions: The method is simple, accurate and sensitive. It can be used for the determination of p-Toluenesulfonamide limit in Gliclazide. Keywords: High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Gliclazide; p-Toluenesulfonamide 格列齐特中对甲苯磺酰胺含量的测定 魏乐坤 山东省医药工业研究所，济南 Email: wlk1212@163.com 收稿日期：2012 年8月6日；修回日期：2012年8月15 日；录用日期：2012 年8月24 日 摘 要：目的：建立格列齐特中对甲苯磺酰胺含量的测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C8 柱，用外标法定量。结果：待测杂质对甲苯磺酰胺在 0.4~1.2 µg/ml 范围内线性关系良 好(r = 0.9993)，平均回收率(n = 9)为99.1%。结论：此方法简单、准确、灵敏度高，可用于格列齐特中对甲苯磺 酰胺的杂质检查。 关键词：高效液相色谱法；格列齐特；对甲苯磺酰胺 1. 引言 格列齐特为磺酰脲类降血糖药物。适用于成人非 胰岛素依赖型 2型糖尿病患者，在国内外应用广泛。 对甲苯磺酰胺为对甲苯磺酰脲(合成格列齐特的起始 原料)中的主要杂质，也是格列齐特生产过程中引入的 主要杂质之一，对该杂质的控制中国药典未规定，在 欧洲药典[1]中列出对甲苯磺酰胺为需控制的杂质，但 未给出检测方法。 中国是世界上原料药出口大国，对于出口欧洲的 产品均需要向欧盟提出注册认证申请，并提交药品主 文件(Drug maser file)，然而如何对欧洲药典列出的所 有杂质进行分析和控制，是药品主文件的核心内容[2]， 按照国外注册 ICH 指南[3]的要求，需要对药品生产中 可能的杂质进行鉴定和控制。 本文参考的相关文献[4] ，提出用高效液相色谱 (HPLC)方法对甲苯磺酰胺进行检测，通过对各种色谱条 件的选择，最终采用欧洲药典专论中格列齐特检测项下 的色谱方法对该杂质的含量进行检测(采用欧洲药典色 谱条件更容易为欧洲官方认可，对通过欧洲的注册文件 评审有较强的现实意义)，同时参照中国药典验证要求[5] 和ICH 分析方法验证指南[6]，对分析方法进行了验证， 验证结果表明方法的灵敏度高，结果准确，可对该杂质 进行有效控制，可以对保证产品质量，有针对性的加强 产品生产过程中的质量控制提供参考。 Copyright © 2012 Hanspub 25  格列齐特中对甲苯磺酰胺含量的测定 2. 仪器与试药 2.1. 仪器 Agilent 1260液相色谱仪(美国安捷伦公司)，四 元 泵，VWD 紫外检测器，Agilent化学工作站；Mettler AB265-S 电子天平(梅特勒–托利多公司)。 2.2. 试药 乙腈(色谱纯试剂)；三乙胺(优级纯试剂)；三氟乙 酸(优级纯试剂)；对甲苯磺酰胺(进口试剂，Alfa Aesar 公司生产)。 3. 方法与结果 3.1. 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C8(25 cm × 4 mm)不锈钢色谱柱；检测器:VWD 紫外检测器;流 动相：由三乙胺:三氟乙酸:乙腈:水(0.1:0.1:45:55) 组 成；流速：0.9 ml/分钟；检测波长：235 nm；进样量： 20 µl。 3.2. 溶液制备 供试品溶液：取格列齐特样品 50 mg，精密称定， 溶于 23 ml乙腈中，用水稀至 50 ml。 对照品溶液：取对甲苯磺酰胺 10 mg，精密称定， 溶于 50 ml乙腈中，加水稀释到 100 ml；精密吸取1 ml， 加乙腈:水(45:55，V/V)的混合溶液稀释至 100 ml。 3.3. 专属性实验 称取 50 mg 对甲苯磺酰胺，加流动相溶解并稀释 至100 ml，分 取1 ml，与 1 ml 供试品溶液混合均匀后 进样，记录色谱图(见图 1，图中峰 1为甲苯磺酰胺， 峰2为格列齐特，倒峰为溶剂峰)，由图谱可知，对甲 苯磺酰胺与格列齐特在该色谱条件下可有效分离，与 甲苯磺酰胺相邻位置无其他杂质峰的干扰。 3.4. 精密度实验 取对照品溶液，按上述条件分别进样 20 µl，连续 进样 6次，记录峰面积，结果见表 1，计算相对标准 偏差 RSD(%)，结果 RSD为1.2%，表明方法精密度 良好。 3.5. 线性关系考察 取对甲苯磺酰胺 10 mg，精密称定，溶于 50 ml 乙腈中，加水稀释到 100 ml，摇匀；分别精密吸取 0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2 ml，加乙腈:水(45 :55，V/V)的混合 溶液稀释至 100 ml，摇匀。按规定条件分别进样 20 µl， 记录色谱图，以溶液浓度 C对峰面积 A作线性回归(见 图2)，计算回归方程及相关系数，结果回归方程为 A = 16.4C – 0.14, 相关系数 r = 0.9993。 对甲苯磺酰胺溶液在 0.4~1.2 µg/ml.浓度范围内 与峰面积呈良好的线性关系。 3.6. 回收率试验 精密称取对甲苯磺酰胺约 8.0 mg (80%)、10.0 mg Figure 1. The resolution chromatograms of p-Toluenesulfonamide & Gliclazide 图1. 对甲苯磺酰胺与格列齐特分离图谱 Table 1 . The results of prec i s io n testing 表1. 精密度实验结果(n = 6) 测定次数 1 2 3 4 5 6 平均 峰面积 16.2 15.7 15.9 16.0 15.7 15.9 15.9 Figure 2. The linearity chart of p-Toluenesulfonamide 图2. 甲苯磺酰胺工作曲线 Copyright © 2012 Hanspub 26  格列齐特中对甲苯磺酰胺含量的测定 (100%)、12.0 mg (120%)各三份，溶于 50 ml 乙腈中， 加水稀释到 100 ml，分别精密吸取 1.0 ml，置预先称 有100 mg 格列齐特样品的 100 ml 容量瓶中，加乙腈: 水(45:55，V/V)的混合溶液溶解并稀释至 100 ml，摇 匀，作为回收率试验溶液；另精密称取甲苯磺酰胺约 10.0 mg，溶于 50 ml 乙腈中，加水稀释到 100 ml，精 密吸取 1.0 ml，加乙腈:水(45:55，V/V)的混合溶液溶 解并稀释至 100 ml，摇匀。作为回收率对照溶液；分 别精密量取上述回收率试验溶液和对照溶液 20 µl，按 规定条件分别进样，记录色谱图，计算，结果见下表 (表2)，平均回收率(n = 9)为99.1 %，RSD(n = 9)为 1.3%。 3.7. 检测限和定量限 取回收率项下对照溶液稀释30倍，按分析方法 规定条件进样，信噪比约 3:1，检测限 0.033 μg/ml (0.003%)。取回收率项下对照溶液稀释 15 倍，按分析 方法规定条件进样，信噪比约10:1，定量限为 0.067 μg/ml (0.007%)。 3.8. 样品的测定 分别取格列齐特连续三批样品(1101002 ， 1101003 ，1101 004)，按拟定的分析方法检查其中的对 甲苯磺酰胺含量，结果所有批号均检出该杂质，该杂 质含量分别为 0.03%，0.02%和0.04%。对甲苯磺酰胺 对照溶液的图谱见图 3(主峰为对甲苯磺酰胺，倒峰为 溶剂峰)，样品检测图谱见图 4(峰1为甲苯磺酰胺，峰 2为格列齐特，未积分峰为其他杂质峰，倒峰为溶剂 峰)。 Tabl e 2 . The results of recovery testing 表2. 回收率试验结果 序号 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 1 8.18 8.02 98.04 2 8.38 8.16 97.37 3 8.11 7.98 98.40 4 10.16 10.20 100.39 5 10.47 10.20 97.42 6 10.73 10.70 99.72 7 12.57 12.56 99.92 8 12.19 12.26 100.57 9 12.31 12.30 99.92 Figure 3. The chromatograms of p-Toluenesulfonamide reference solution 图3. 对甲苯磺酰胺对照溶液的图谱 Figure 4. The chromatograms of Gliclazide sample solution 图4. 格列齐特样品溶液图谱 4. 讨论 格列齐特中的杂质对甲苯磺酰胺来源是通过对 甲苯磺酰脲(格列齐特的合成的起始原料)引入到该产 品中[7]。上述实验过程表明，该杂质在格列齐特中每 批均可检出，在合成工艺和产品检测中对该杂质进行 控制是完全必要的，对该杂质的控制有利于提高产品 质量，对药品生产企业有效控制产品中的杂质，提高 产品质量，保证用药安全均具有重要意义。对于指导 生产，优化工艺均具有指导意义。 格列齐特为中国药典和欧洲药典收载品种，本文 参照了中国药典和欧洲药典有关杂质控制的要求，采 用高效液相色谱法对格列齐特中的特殊杂质对甲苯 磺酰胺进行检查，方法的回收率、精密度及检测限等 均达到要求，同时由于该杂质为欧洲药典载明需要控 制的杂质，确定该杂质的控制方法对产品在欧洲高端 市场的注册认证均具有较强的现实意义。 参考文献 (References) [1] Ph.Eur (欧洲药典). 7.0. Copyright © 2012 Hanspub 27  格列齐特中对甲苯磺酰胺含量的测定 Copyright © 2012 Hanspub 28 [2] 裴中阳, 梁毅. 原料药出口 DMF 注册文件中的杂质研究[J]. 机电信息, 2011, 10(29): 32-35. [3] ICH Guideline. Impurities in new drug sustances Q3A (R2). [4] 唐淼荣, 章小波. 高效液相色谱法测定邻、间、对甲苯磺酰胺 [J]. 色谱, 1996, 14(2): 144. [5] ChP(中国药典). 2010. Vol II. 附录 XIX A. [6] ICH Guideline. Validation of analytical procedures: Test and methodology Q2(R1). [7] 王国安. 格列齐特欧洲药典列出杂质的探讨[J]. 宁波化工, 2006, 3(4 ): 16-23. |