 Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2012, 2, 27-31 http://dx.doi.org/10.12677/acm.2012.24006 Published Online December 2012 (http://www.hanspub.org/journal/acm.html) Expression of Imprinted Genes Igf2r and RB-1 in the Endometrium of Infertile Women with Metabolic Syndrome Junhao Wang1,2*, Yu Ruan1,2, Rong Li1 1Department of Reproductive Medicine, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 2Shantou University Medical College, Shantou Email: *wangjunhao1985@qq.com Received: Nov. 2nd, 2012; revised: Nov. 10th, 2012; accepted: Nov. 25th, 2012 Abstract: Objective: To investigate expression of imprinted genes Igf2r, RB-1 in the endometrium of infertile women with metabolic syndrome (MS). Methods: From Jul. 2011 to Dec. 2011 in our center, 11 infecund women with metabolic abnormalities were experimental group, a matched group of 15 normal women was choosed. Collected their prolife rative phase endometrial tissue, using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) to measure the ex- pressions of Igf2r and Rb-1 in the endometrium. Results: Igf2r and RB-1 were both expressed in the endometrium of MS and normal women. Compared with the normal women, the expression of Igf2r in the endometrium of MS was decreased (P = 0.0051), while the expression of RB-1 was incresed (P = 0.0364), significant differences were observed between experimental group and matched group. Conclusions: The expression of imprinted gene Igf2r in the endo- metrium of infertile women with MS was decreased significantly, while the expression of RB-1 was increased, the 2 imprinted genes may impair the function of endometrium of MS. Keywords: Imprinted Genes; Igf2r; RB-1; Metabolic Syndrome 印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达 水平的研究 王俊豪 1,2*，阮 钰1,2，李 蓉1 1北京大学深圳医院生殖医学科，深圳 2汕头大学医学院，汕头 Email: *wangjunhao1985@qq.com 收稿日期：2102 年11月2日；修回日期：2012 年11月10 日；录用日期：2012年11月25日 摘 要：目的：研究印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征(MS)不孕患者子宫内膜的表达。方法：选择 2011 年7 月至 2011年12 月因不孕症来我院生殖中心就诊的 MS患者 11 例作为实验组，代谢正常女性15 例作为对照组， 收集分泌期的子宫内膜组织，采用实时定量聚合酶链反应方法(RT-PCR)测定子宫内膜组织 Igf2r 和RB-1 的表达水 平。结果：Igf2r 和RB-1 在MS患者和代谢正常妇女子宫内膜中均有表达，与正常女性相比较，MS 患者子宫内 膜Igf2r 表达水平下降(P = 0.0051)，RB-1 表达水平升高(P = 0.0364)，具有显著性差异。结论：MS 不孕患者子宫 内膜组织印记基因 Igf2r 表达水平明显下降，RB-1 表达水平明显升高，两者可能影响 MS 患者的子宫内膜容受性。 关键词：印迹基因；Igf2r；RB-1；代谢综合征 1. 引言 随着社会经济和生活方式的改变，以肥胖和多种 代谢异常为特征的代谢综合征(MS)在全球范围的患 病率逐渐上升，目前全世界大部分国家 20%~30%的 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 27  印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达水平的研究 成年人患有代谢综合征，MS 已成为威胁人类健康的 主要公共卫生问题。MS指的是一组危险因素，包括 中心性肥胖及以下变量中的至少 2个，即血压增高、 甘油三酯增高、高密度脂蛋白降低和高血糖。其必要 条件是中心性肥胖，尽管某些肥胖育龄妇女并无生殖 障碍，但研究表明育龄期肥胖影响了生育力[1]，在辅 助生殖技术中，肥胖妇女存在低着床率、低妊娠率、 高流产率[1,2]，这些均可能与肥胖妇女子宫内膜容受性 下降有关[2-4]。内膜容受性受到基因表达的调控。Igf2r 是最早发现的母源性印迹基因，RB-1 是人类第一个分 离克隆的抑癌基因[5]。 本研究检测了因不孕症来我院生殖中心行试管 助孕的 MS 患者及代谢正常女性分泌期子宫内膜中印 迹基因 Igf2r 和RB-1 的表达，旨在初步探讨 MS 不孕 患者子宫内膜印迹基因的表达水平及其与内膜容受 性的相关性。 2. 材料与方法 2.1. 研究对象 选择 2011年7月至 2011 年12 月因不孕症来我 院生殖中心就诊的MS 患者 11 例作为实验组，同期就 诊的非代谢异常女性 15 例作为对照组。实验组纳入 标准：BMI ≥ 23 kg/m2且合并以下 2项或以上血指标 异常：1) 甘油三酯(TG)水平升高：>150 mg/dl(1.7 mmol/l)；2) 高密度脂蛋白(HDL)水平降低：女性<50 mg/dl(1.1 mmol/l)；3) 胰岛素稳态评估模型(Homeos- tasis model assessment，HOMA = [空腹胰岛素(mIU/L) × 空腹血糖(mmol/L)]/22.5) ≥ 2.14；4) 空腹血糖(FPG) 升高：≥100 mg/dl(5.6 mmol/l)，或已诊断为 2型糖尿 病。对照组纳入标准：1) BMI<23 kg/m2且无上述血指 标异常；2) 基础内分泌检测结果正常；3) 既往无不 良妊娠史。两组对象排除标准：PCOS；年 龄 > 40岁； 合并卵巢肿瘤；腹腔镜证实盆腔子宫内膜异位症；B 超发现卵巢巧克力囊肿、输卵管积液。所有研究对象 均签署知情同意书。 2.2. 方法 2.2.1. 子宫内膜标本的采集 收集所有患者分泌期的子宫内膜组织(均经病理 证实)，置于4℃ RNA Later(Ambion)中，24 h后置于 –80℃保存待用。 2.2.2. 总RNA 的提取 采用液氮研磨法将组织磨成粉末，加入 Trizol (Invitrogen 公司)混合，按 Trizol 说明书抽提总 RNA。 主要抽提步骤如下：1) 取–80℃冻存的内膜组织各 50 mg，在液氮中研磨；2) 加入1mlTrizol 试剂(Invitrogen， 美国)，继续研磨成粉末状提取RNA；3) 用氯仿、100% 异丙醇、75%乙醇分离并洗涤 RNA 沉淀。 2.2.3. 总RNA 纯度和完整性的测定 RNA 纯度测定：取 RNA水溶液 3 ul，用 DEPC 处 理水稀释至 300 ul，用紫外分光光度计测定260 nm 和 280 nm的吸光度，即OD260 和OD280，计 算OD260/ OD280 比值。 RNA 完整性测定：取RNA 水溶液 7 ul，在经DEPC 处理去除 RNA 酶污染的电泳体系中电泳(1.5%琼脂糖 凝胶，0.5 × TBE电泳缓冲液，100 V恒压恒流，15 分钟)。电泳结束后在凝胶成像仪下观察电泳条带。 2.2.4. 总RNA 逆转录 用紫外分光光度仪对提取的总 RNA 进行定量后， 取1 ug总RNA 按照试剂盒提供的说明书(TAKARA 公 司)进行逆转录。反应在BIO-RAD(UV-2450)普通 PCR 仪上进行，反应体系如下：5 × PrimeScript RT Master Mix 4 µl(内含 PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、 Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反 应Buffer)，RNA模板 2~7 µl，加RNase Free dH2O至 总体积为20 µl，全部过程在冰上操作。将20 µl 反应 体系至于 PCR 扩增仪完成反应，设置反应条件为：37℃ 15 min，85 5℃ s。然后将逆转录的 cDNA 溶液置于 –20℃冰箱保存备用。 2.2.5. 引物的设计 在Pubmet Gennebank的查找内参照 β-actin和目 的基因 Lgf2r 和RB1 的mRNA 序列，有南京金斯瑞生 物科技有限公司合成，将合成引物按说明书配置成浓 度为 20 µM 的工作液。见表1。 2.2.6. 实时定量 PCR，采用 SYBR Green I相对定量法 (SYBR Green I，TAKARA) 反应按照 RNA 定量 RT-qPCR 检测试剂盒说明书 (TAKARA 公司)，在 ABI Prism 7000实时荧光定量 Copyright © 2012 Hanspub 28  印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达水平的研究 Table 1. Upstream and downstream primers of the genes 表1. 各基因的上下游引物 基因 上游引物 下游引物 β-actin CCTGTGGCATC- CACGAAACTA TGTCAGAAAGGGTGTAACG CAA Igf2r GGTATTTTGAGGGTGTA A ATTGTA AACCCTAACACAAC- TAAACAACAT RB-1 AATGGTA- CATCTTCCAGGGTCT GAAGTTTCTGCACAGC TGGA PCR 仪上完成。PCR 反应体系：总反应体系20 µl，SYBR Premix Ex TaqTM 10 µl，ROX Reference Dye 0.4 µl， 靶基因上游 0.4 µl，靶基因下游 0.4 µl，模板cDNA1 µl， 无RNase 水7.8 µl。反应条件：预变性95℃ 30 s，PCR 反应 95℃ 5 s，60 31℃ s，共 40 个循环。每个样品的 目的基因表达以 β-actin 作为内参照。为减少操作误 差，重复三孔，设置无 cDNA 样品空白管为阴性对照。 反应完成后，按照公式 2–ΔΔCt 法计算出 MS患者内膜 Igf2r 和RB-1基因的相对表达量，ΔΔCt = (CtIgf2r/ RB-1-Ctβ-actin) 实验组-(CtIgf2r/RB-1-Ctβ-actin) 对照 组。 2.3. 统计学分析 采用 SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。Ig f2r， RB-1 经K-S 检验为非正态分布，采用非参数检验 Mann-Whithney U 法比较两组目的基因的表达差异。P < 0.05 为差异有统计学意义。 3. 结果 3.1. 两组患者一般资料的比较 两组患者的年龄、不孕类型、不孕年限、不孕原因、 基础 FSH、LH、E2、T均无显著性差异(P > 0.05)， 实验组的BMI 高于对照组(P < 0.01)，符合病人入选 的基本特征，见表 2。 3.2. RNA抽提与质控 组织总 RNA 用Trizol 法抽提，提取后于 1.5%琼 脂糖凝胶上样电泳，紫外照胶仪下观察，可见 18 s、 28 s 两条条带非常清晰，而且28 s/18 s 约2倍，说明 RNA 完整性好，见图1。同时紫外分光光度计检测示 OD260/OD280 比值介于 1.6~2.0之间，表示 RNA 纯 度符合要求。 Table 2. General characteristics of the experimental an d control groups 表2. 实验组与对照组基本情况 实验组(n = 15) 对照组(n = 11)P 年龄(y) 30.45 ± 4.37 31.47 ± 4.03 NS BMI(kg/m2) 26.46 ± 2.24 19.69 ± 1.45 <0.01 不孕类型 NS 原发不孕(%) 46.31 39.42 继发不孕(%) 53.69 60.58 不孕年限(y) 4.66 ± 2.43 3.67 ± 4.02 NS 不孕原因 NS 盆腔或输卵管因素(%) 76.42 69.36 男方因素(%) 23.58 30.64 基础 FSH(U/L) 6.58 ± 1.33 5.75 ± 2.02 NS LH (U/L) 4.19 ± 2.48 4.57 ± 4.34 NS E2 (pg/ml) 38.45 ± 19.28 47.97± 27.28 NS T (ng/ml) 0.60 ± 0.22 0.68 ± 0.22 NS 28S 18S Figure 1. Two obvious bands of 28 s and 18 s could be seen in the 1.5% agarose gel elec trophoresis for the detection of RNA integrity 图1. 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性如图可见明亮的 28 s、 18 s条带 3.3. RT-qPCR检测实验组和对照组子宫内膜组 织Igf2r，RB-1 的表达 Igf2r，RB-1 在所有研究对象子宫内膜组织均有表 达，经Mann-Whithney U 法分析得出：实验组的Igf2r 表达水平低于对照组，RB-1 表达水平高于对照组，均 具有显著性差异(P < 0.05)。见图 2。采用 2–ΔΔCt 法计 算出实验组 Igf2r和RB-1 基因的相对表达量：对照组 平均 Igf2r 表达约为实验组 4.92 倍，实验组平均RB-1 表达约为对照组3.25 倍。 4. 讨论 印迹基因是父源或母源特异等位基因的差异表 Copyright © 2012 Hanspub 29  印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达水平的研究 P = 0.0051 (a) P =0.0364 (b) Figure 2. Graphs show the relative expression of the 2 target genes, the horizontal lines indicate the average number. Datas are non- normal through the Kolmogorov-Smirnov test, nonparametric Mann-Whitney U tests are used for comparison of the expression differences of target genes. P < 0.05 makes the significant differ- ences 图2. 图中所示的是各目的基因相对表达量，横线表示均数。RB-1， Igf2r 经K-S检验为非正态分布，采用非参数检验 Mann-Whithney U法比较各组目的基因的表达差异。P < 0.05为显著性差异 达，两个等位基因呈不同的活性状态，不符合孟德尔 所提出的双亲来源的两个等位基因需同等表达的经 典遗传学。基因印迹现象最初源于1984 年小鼠的单 亲生殖胚胎学实验[6]，虽然其只占基因组很小的部分， 但其适度表达对胚胎正常生长、发育及生物行为发展 是必要的。DNA 甲基化是基因印迹发生和维持的主要 机制，由于各种原因引起的印迹基因异常表达如过 高、过低、缺失或甲基化异常均可导致疾病的发生。 Igf2r 位于小鼠 17 号染色体，从妊娠后平均 6.5 天 时开始进行母源表达[7]，其表达产物是胰岛素生长因 子的负调控因子。Barlow DP等[8]首先证明 Igf2r 在胚 胎生长和发育中起作用，Igf2r 功能缺失的小鼠出现过 度生长。羊胚体外培养显示Igf2r 印迹缺失，导致胚 胎羊过度生长、病死率增加[9]。本研究利用RT-PCR 技术测定不孕症中 MS 患者和代谢正常患者子宫内膜 中Igf2r mRNA和RB-1 mRNA的表达，发现与代谢 正常妇女相比，MS 患者子宫内膜组织 Igf2r mRNA 表 达水平明显下降。Igf2r 表达的下降可能与Dnmt1 的 下降有关。Dnmt1 具有维持细胞在分裂增生中 DNA 甲 基化稳定的作用。MS 患者可能由于体内内分泌紊乱、 慢性炎症累积影响了Dnmtl 的活性。Dnmt1 下降使 Igf2r 中DMR区域的甲基化水平下降，而 DRM 区的 甲基化水平下降会导致Igf2r 的表达下降[10]。文献表 明肥胖与子宫内膜增生和子宫内膜癌有明显的相关 性，肥胖患者的激素紊乱、高胰岛素血症和胰岛素抵 抗是影响子宫内膜增生、子宫内膜癌的重要因素[11]， 而Igf2r 下降可能是此环节中的重要影响因子。Igf2r 的下降又进一步促进MS 患者子宫内膜的炎症化，从 而形成恶性循环影响MS 患者子宫内膜功能。 RB-1 为母源性抑癌印迹基因，其为细胞周期的负 调控因子。通过与转录因子结合调节细胞增殖和分化 所需基因的表达，与细胞分化、细胞衰老、细胞凋亡、 细胞周期和生长抑制等细胞生长发育有关[12]。本研究 中MS患者 RB-1 mRNA表达水平较代谢正常妇女明 显升高，具体原因不明，但 MS 患者 RB-1 下降提示 RB-1 可能参与调节子宫内膜细胞周期，抑制子宫内膜 细胞的生长，促进其衰亡。 MS 患者辅助生殖技术助孕率较低的机理尚未明 确，可能与子宫内膜容受性有关。内膜容受性可能依 赖于某些特定基因定期及周期性的表达[13]，Igf2r 和 RB-1 均为可能基因。Igf2r 和RB-1 的印迹可能与子宫 内膜正常分化、蜕膜化及胚胎着床后滋养层细胞的入 侵有关。本研究中 MS患者的 Igf2r mRNA表达明显 升高，RB-1 mRNA表达明显下降，此可能影响子宫 内膜“着床窗口期”父系与母系基因产物之间的生理 平衡，继而影响子宫内膜细胞的免疫原性及内膜的容 受性。 Copyright © 2012 Hanspub 30  印记基因 Igf2r 和RB-1 在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达水平的研究 Copyright © 2012 Hanspub 31 综上所述，MS 不孕患者子宫内膜中 Igf2r 和RB-1 的基因印迹发生了改变，此可能影响子宫内膜容受 性，从而导致 MS患者辅助生殖技术助孕率不良结局， 但其在子宫内膜中的具体作用还有待进一步研究。此 为利用分子生物学方法重建印迹来提高子宫内膜容 受性提供了新思路。 参考文献 (References) [1] Y. Linne. Effects of obesity on women reproduction and com- plications during pregnancy. Obesity Reviews, 2004, 5(3): 137- 143. [2] F. Hall, A. Neubert. Obesity and pregnancy. Obstetrical & Gy- necological Survey, 2005, 60(4): 253-260. [3] M. Mitchell, D. T. Armstrong, R. L. Robker, et al. Adipokines: Implications for female fertility and obesity. Reproduction, 2005, 130(5): 583-597. [4] J. Bellver, M. A. Melo, E. Bosch, et al. Obesity and poor repro- ductive outcome: The potential role of the endometrium. Fertil- ity and Sterility, 2007, 88( 2): 446-451 [5] A. Naumova, C. Sapienza. The genetics of retinoblastoma, re- visited. American Journal of Human Genetics, 1994, 54(2): 264- 273. [6] R. G. Edwards. Genetics, epigenetics and gene silencing in dif- ferentiating mammalian embryos. Reproductive BioMedicine On- line, 2006, 13(5): 732-753. [7] P. E. Szabó, J. R. Mann. Allele-specific expression and total ex- pression levels of imprinted genes during early mouse develop- ment: Implications for imprinting mechanisms. Genes & Devel- opment, 1995, 9(24): 3097-108 [8] D. Lonmann. Imprinting of the RB1 gene and parent-of-origin effects in retinoblastoma. Medizinische Genetik, 2010, 2: 429- 433. [9] L. E. Young, K. Fernandes, T. G. McEvoy, S. C. Butterwith, C. G. Gutierrez, C. Carolan, P. J. Broadben, J. J. Robinson, I. Wilmut and K. D. Sinclair. Epigenetic change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture. Nature Genetics, 2001, 27(2): 153-154 [10] S. Xie, Z. Wang, M. Okano, M. Nogami, Y. Li, W. W. He, K. Okumura and E. Li. Cloning, expression and chromosome loca- tions of the human DNMT3 gene family. Gene, 1999, 236(1): 87- 95. [11] D. Lucifero, C. Mertineit, H. J. Clarke, T. H. Bestor and J. M. Trasler. Methylation dynamics of imprinted genes in mouse germ cells. Genomics, 2002, 79(4): 530-538. [12] D. Lonmann. Imprinting of the RB1 gene and parent-of-origin effects in retinoblastoma. Medizinische Genetik, 2010, 2: 429- 433. [13] P. Bischof, A. Meissue and A. Campana. Mechanisms of endo- metrial control of trophoblast invasion. Journal of Reproductive Fertile Supple, 2000, 55: 65-71. |