 Botanical Research 植物学研究, 2013, 2, 1-5 http://dx.doi.org/10.12677/br.2013.21001 Published Online January 2013 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) Genetic Diversity of Stemona shandongensis Populations* Lei Zhang, Yan Ma, Dekui Zang# Forestry College, Shandong Agricultural University, Taian Email: #zangdk@sdau.edu.cn Received: Sep. 7th, 2012; revised: Sep. 15th, 2012; accepted: Sep. 28th, 2012 Abstract: Genetic diversity and genetic structure of 120 individuals of four Stemona shandong ensis popula- tions were investigated by AFLP method. A total of 282 bands were observed with 8 primer combination, in- cluding 137 polymorphic bands. The percentage of polymorphic bands was 48.58%. In species level, Nei’s gene diversity index was 0.1441; Shannon’s information index was 0.2485; total gene diversity was 0.1646; population gene diversity was 0.1682, gene differentiation coefficient was 0.0210. UPGMA cluster based on AFLP makers was similar to the cluster based on morphological traits; there was no significant correlation between genetic distance and geographic distance. The results showed that there was genetic differentiation among populations, and it could express by morphological characteristics. Keywords: AFLP; Stemona shandongensis; Genetic Diversity; Population 山东百部遗传多样性分析* 张 雷，马 燕，臧德奎# 山东农业大学林学院，泰安 Email: #zangdk@sdau.edu.cn 收稿日期：2012 年9月7日；修回日期：2012 年9月15 日；录用日期：2012 年9月28 日 摘 要：利用 AFLP 分子标记技术对山东百部 4个居群 120个样品进行了遗传多样性分析。8对引物 组合共扩增出282 条清晰可辨条带，其中多态性条带137 条，多态性位点百分率 48.58%；在种级水平 上，Nei’s基因多样性指数为 0.1441 ，Shannon 多态性信息指数为 0.2485；居群总遗传 多样 性(H t)为 0.1646，居群内遗传多样性为0.1682，基因分化系数为 0.0210。UPGMA 聚类表明，AFLP聚类结果与 表型分化聚类结果一致，居群间具有一定程度的遗传分化，并通过表型性状表现出来。 关键词：AFLP；山东百部；遗传多样性；居群 1. 引言 的遗传结构和遗传多样性分析[4-10]。本研究拟采用 AFLP分子标记，以居群为单位，通过分析山东百部 的遗传多样性水平和遗传结构，探讨影响其遗传多样 性和遗传结构的因素，分析濒危原因，并提出保护策 略。 山东百部(Stemona shandongensis)为百部科百部 属植物，与直立百部(S. sessilifolia)和蔓生百部(S. japonica)近缘，产于山东中部低山丘陵[1-3]，分布区狭 窄且受人为干扰严重，已处于濒危状态，应及时采取 措施加以保护。因此，开展山东百部的保护生物学研 究已极为迫切。分子标记技术已广泛应用于植物居群 2. 材料与方法 2.1. 取样方法 *基金项目：山东省自然 科学基 金(Y2006D12)；山东省农 业良种工 程重大课题(鲁农良字[2010]6 号)。 *通讯作者。 选取济南莲台山、泰山三阳观、淄博大贤山和淄 Copyright © 2013 Hanspub 1  山东百部遗传多样性分析 博唐山 4个保存相对完整的居群，每个居群内随机选 取30 个样品，居群内个体间的采样间距在 30 m以上 以最大限度降低植株间的亲缘关系，保证取样均匀 性。选择生长正常，无病虫害的单株，采其新鲜叶片 迅速放入装有变色硅胶的封口袋中进行快速干燥，用 于DNA 提取。 电泳分离检测，得到AFLP 的DNA 指纹图谱。利用 GeneScan 3.1软件将 8对荧光引物产生的电泳胶图转 换为(0,1)矩阵。根据 PCR 扩增的结果，有带计为1， 无带则计为 0。用 POPGENE version 1.32 软件[12]计算 多态性带数、多态性位点百分率(%)、观测等位基因 数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多样性指数 (H)、Shannon 多态性信息指数(I)、总遗传多样性(Ht)、 居群内遗传多样性(Hs)、基因分化系数(Gst)、Nei’s 遗 传一致度(IN)、遗传距离(D) 等遗传多样性参数，用 NTSYS2.10 软件[13,14]对4个居群进行非加权算术平均 法聚类 UPGMA。 2.2. 实验方法 2.2.1. 总DNA 制备 采用改进的CTAB 法[11]从硅胶干燥的幼叶中 提 取总 DNA。 2.2.2. AFLP分析 3. 结果与分析 利用北京鼎国生物技术公司的试剂盒及其操作 指南进行。各样品基因组 DNA 的酶切和接头的连接 在同一反应中进行。20 μL反应体系中含有DNA 模板 4 μL(50 ng·μL–1)，Adapter 1 μL，EcoR I/Mse I (4 U·μL–1)2 μL，10 × Reaction buffer 2.5 μL，ATP(10 mmol·L–1)2.5 μL，4 Ligase(4 U·μL–1)1 μL，AFLP- Water 7 μL。将上述混合液在0.5 mL 离心管中混匀离 心数秒，37℃保温 5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。 3.1. 山东百部的遗传多样性 筛选出 8对扩增多态性较高、且带形清晰的引物 组合，扩增后得到 282条清晰可辨条带，其中多态性 条带 137条(图1)，多态性位点百分率为 48.5816%， 平均每对引物扩增出 35.25 条带，其中 17.125 条具有 多态性。同一引物组合所检测不同位点的遗传多样性 程度存在较大的差异(表1)。扩增带数最多的引物是 E-AGC/M-CAA ，为 47 条，带数最少的是引物 E-AGG/M-CAC ，为 23条；多态性检出率最高的是 E-ACA/M-CTC，多态率达 59.0909%，多态性检出率 最低的是E-ACA/M-CAG，多态率为 37.0370%。 预扩增反应体系为 25 μL。含Pre-ampmix 1 μL， dNTPs 1 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA po- lymerase(2 U·μL–1)0.5 μL，AFLP-Water 18 μL。预 扩 增 反应程序为：94℃变性 2 min；94℃变性30 s，56℃复 性30 s，72℃延伸 80 s，循 环30 轮；72℃延伸 5 min。 预扩增产物稀释20 倍，–20℃保存备用。 8对引物组合所检测位点的有效等位基因数的范围 为1.1137~1.2104；Nei’s 基因多样性变异范围为0.0738~ 0.1319；Shannon 信息指数的变异范围为 0.1203~ 0.2099(表2)。表明山东百部不同样品间 AFLP 分子标 记多态性较高，存在较为丰富的遗传多样性。 选择性扩增反应用荧光标记的经过筛选的 8对引 物(表1)进行选择性扩增。反应体系为 25 μL，含预扩 增稀释样品 2 μL，dNTPs 2.5 μL，10 × PCR buffer 0.5 μL，EcoR I引物 1 μL，Mse I引物(荧光标记)1 μL， TaqDNA polymease(2 U·μL–1)0.5 μL，AFLP-Water 17.5 μL。 多态位点百分率(P)是分子标记中广泛应用的多 样性指标。山东百部在物种水平的多态位点百分率为 93.98%，而4个居群的多态位点百分率排序为唐山居 群(POP4) < 三阳观居群(POP2) < 大贤山居群(POP3) < 莲台山居群(POP1)(表3)。Shannon 信息指数(I)和 Nei’s 基因多样性指数(H)结果则显示，莲台山居群最 高，三阳观居群最低，4个居群的排序为三阳观(POP2) < 唐山(POP4) < 大贤山(POP3) < 莲台山(POP1)。 选择性扩增PCR 扩增程序按下列参数 PCR循环： 94℃ 2 min；一轮扩增参数：94℃ 30 s，65℃ 30 s， 72℃ 80 s；以后每轮循环退火温度递减 0.7℃或 1℃， 扩增 12 轮；接着按下列参数扩增 23 轮：94℃ 30 s， 55℃ 30 s，72℃ 80 s；最后延伸 72℃ 5 min。 2.3. 数据处理 山东百部居群总遗传多样性(Ht)为0.1682，居群 取选择性扩增后的样品在 ABI 377自动测序仪上 Copyright © 2013 Hanspub 2  山东百部遗传多样性分析 Copyright © 2013 Hanspub 3 Figure 1. AFLP fingerprinting patterns of Liantaishan S. shandongensis populatio n u sing the primer combination E-ACA/ M-CTC 图1. 利用E-ACA/ M-CTC引物组合对山东百部莲台山居群的 AFLP 扩增图谱 Table 1. Polymorphism of AFLP bands obtained by selective amplification based on the eight primer-combinations 表1. AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性 序号 No. 引物组合 Primer combination 总带数 Total band number 多态性带数 Polymorphic band number 多态性位点百分率 Polymorphic band percentage (%) 1 E-ACA/M-CTC 44 26 59.0909 2 E-ACG/M-CAA 39 21 53.8461 3 E-AGC/M-CAA 47 24 51.0638 4 E-ACA/M-CAA 40 20 50.0000 5 E-AGC/M-CTA 33 16 48.4849 6 E-AGG/M-CAC 23 9 39.1304 7 E-ACA/M- CAG 27 10 37.0370 8 E-ACG/M-CAG 29 11 37.9310 合计 Total 282 137 376.5842 平均 Average 35.25 17.125 48.5816 Table 2. Estimates of genetic dive rsity of S. shandongensis populations (Mean ± SD) 表2. 山东百部遗传多样性各度量指标(平均值 ± 标准差) 引物组合 Primer combination 观测等位基因数 Observed number of alleles (Na) 有效等位基因数 Effective number of alleles (Ne) Nei’s 基因多样性指数 Nei’s gene diversity (H) Shannon 多态性信息指数 Shannon information index (I) E-ACA/M-CTC 1.5972 ± 0.4916 1.2104 ± 0.3052 0.1319 ± 0.1695 0.2099 ± 0.2449 E-ACG/M-CAA 1.5278 ± 0.5004 1.1981 ± 0.3073 0.1229 ± 0.1686 0.1946 ± 0.2443 E-AGC/M-CAA 1.5139 ± 0.5010 1.1936 ± 0.2941 0.1217 ± 0.1671 0.1921 ± 0.2449 E-ACA/M-CAA 1.4907 ± 0.5011 1.2090 ± 0.3276 0.1259 ± 0.1764 0.1961 ± 0.2535 E-AGC/M-CTA 1.4861 ± 0.5010 1.1574 ± 0.2858 0.0980 ± 0.1570 0.1571 ± 0.2284 E-AGG/M-CAC 1.4028 ± 0.4916 1.1350 ± 0.2834 0.0814 ± 0.1529 0.1289 ± 0.2209 E-ACA/M- CAG 1.3704 ± 0.4840 1.1137 ± 0.2354 0.0738 ± 0.1363 0.1203 ± 0.2037 E-ACG/M-CAG 1.3704 ± 0.4840 1.1156 ± 0.2300 0.0762 ± 0.1355 0.1244 ± 0.2045  山东百部遗传多样性分析 Table 3. Genetic diversity of four S. shandongensis populations detected by AFLP (Mean ± SD) 表3. AFLP检测山东百部 4个居群遗传多样性水平(均值 ± 标准差) 居群 Population 多态位点百分率 Percentage of polymorphic loci (P)/% 观测等位基因数 Observed number of alleles (Na) 有效等位基因数 Effective number of alleles (Ne) Nei’s 基因多样性指数 Nei’s gene diversity (H) Shannon 多态性信息指数 Shannon information index (I) POP1 91.67% 1.9167 ± 0.2770 1.2492 ± 0.27700.1705 ± 0.1443 0.2848 ± 0.2040 POP2 74.54% 1.7454 ± 0.4367 1.1586 ± 0.20210.1158 ± 0.1233 0.2036 ± 0.1857 POP3 78.24% 1.7824 ± 0.4136 1.2359 ± 0.24900.1627 ± 0.1432 0.2712 ± 0.2080 POP4 70.83% 1.7083 ± 0.4556 1.1671 ± 0.20390.1218 ± 0.1253 0.2117 ± 0.1901 物种水平 Species level 93.98% 1.9398 ± 0.2384 1.2019 ± 0.22330.1441 ± 0.1312 0.2485 ± 0.1904 Table 4. Genetic distance between populations of S. shandongensis 内遗传多样性(Hs)为0.1646。根据总遗传多样性(Ht) 和居群内遗传多样性(Hs)计算不同居群间的遗传分化 水平，基因分化系数(Gst) 0.0210，即表明总的遗传变 异中只有2.10%的变异存在居群间。 表4. 山东百部居群间遗传一致度和遗传距离分析 POP1 POP2 POP3 POP4 POP1 - 0.9969 0.9926 0.9934 POP2 0.0031 - 0.9947 0.9946 POP3 0.0074 0.0053 - 0.9952 POP4 0.0066 0.0054 0.0048 - 3.2. 居群间遗传一致度和UPGMA聚类分析 对山东百部居群 Nei’s 遗传一致度(IN)和遗传距 离(D)进行计算，结果表明居群遗传一致度 0.9926~ 0.9969，遗传距离 0.0031~0.0074(表4)，说明居群间 的相似程度较高，遗传距离较小。莲台山(POP1)和三 阳观(POP2)遗传相似性最高、遗传距离最小，而莲台 山(POP1)和大贤山(POP3)遗传相似性最低、遗传距离 最大。根据Nei’s 遗传一致度进行 UPGMA 聚类(图2) 显示，莲台山(POP1)和三阳观(POP2)首先聚为一类， 然后与大贤山(POP3)聚为一类，而唐山居群(POP4)单 独聚为一类。 Figure 2. UPGMA cluster of f our S. shandongensis populations based on AFLP mak e rs 4. 讨论 图2. 山东百部 4个居群基于 AFLP 分析的UPGMA 聚类结果 遗传变异和环境之间的关系一直是植物居群遗 传学研究中普遍关注的问题。山东百部 4个居群除地 理和气候差异外，依存的群落类型各不相同，济南莲 台山为于黄栌、黄榆混交林，泰安三阳观为麻栎、栓 皮栎混交林，淄博大贤山为侧柏疏林，而淄博唐山为 刺槐疏林[15]。洪锐民认为通过无性繁殖的植物并不比 有性繁殖的植物可遗传变异少，无性繁殖的植物通常 在居群内和居群间能保持相当大的变异，环境异质性 可能在构建无性繁殖植物居群变异中起重要作用[16]。 山东百部既可进行有性繁殖，也可无性繁殖，从其分 布特点[17]推断，居群遗传分化主要取决于生境的异质 性。 类结果[15]一致，表明由于地理隔离，山东百部通过对 不同环境长期适应产生了遗传分化，并通过表型性状 表达出来。虽然地理距离近的居群能聚类在一起(莲台 山和三阳观)，但也出现例外(唐山单独聚为一类)，这 说明居群间遗传分化并非由单一因子影响，应该是多 因子综合作用的结果。 山东百部居群面积较小，分布区内人为活动频 繁，居群片断化趋势明显，若不能有效控制将导致遗 传多样性的丧失[18]。因此在保护策略上首应当保护其 自然分布区的生境，特别是一些特殊生境的个体。对 于分布集中的区域进行封育性保护，减少人为活动干 扰，逐步恢复其居群个体数量。 山东百部居群间的 AFLP聚类结果与表型分化聚 Copyright © 2013 Hanspub 4  山东百部遗传多样性分析 参考文献 (References) [1] 臧得奎, 彭卫东. 百部属一新种[J]. 植物研究, 1996, 16(4): 413-414. [2] Z.-H. Ji, B. E. Duyfjes. E. stemona. In: Z. Y. Wu, P. H. Raven and D. Y. Hong, Eds., Flora of China, Beijing: Science Press, St. Louis: MBG Press, 2000, 24: 70-72. 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