 Botanical Research 植物学研究, 2013, 2, 40-45 http://dx.doi.org/10.12677/br.2013.21007 Published Online January 2013 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) Preliminary Study on Agrobacterium-Mediated Transformation of DR1372 Gene into Brassica napus L.* Siwei Zhang1, Wenb o Zhou1, Xin Zhang1, Cuina Chen1, Qilin Dai1, Jin Wang2# 1School of Life Science and Engi neering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 2Biotechnology Research Institut e, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing Email: weiweizhibei@1 63 .com, #wjdsz@vip.sina.com Received: Jan. 2nd, 2013; revised: Jan. 10th, 201 3; ac ce pted: Jan. 1 6th, 2013 Abstract: The DR1372 containing a special domain called WHy was cloned from Deinococcus radiodurans. This WHy domain may be involved in the mechanism of drought resistance. In this study, the plant expres- sion vector DR1372-pBI121 was constructed and introduced into Brassica napus L. mediated by Agrobacteria. Several factors affecting genetic transformation efficiency were explored and the Agrobacterium-mediated genetic transformation system was set up in Brassica napus. This study provides essential materials fo r later research on DR1372 gene. Keywords: DR1372; Brassica napus L.; Genetic Transformation; Drought-Tolerance 农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜* 张思维 1，周文波 1，张 新1，陈翠娜 1，代其林 1，王 劲2# 1西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 2中国农业科学院生物技术研究所，北京 Email: weiweizhibei@1 63 .com, #wjdsz@vip.sina.com 收稿日期：2013 年1月2日；修回日期：2013 年1月10 日；录用日期：2013 年1月16 日 摘 要：DR1372 基因是在耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)基因组中克隆得到的一个基因， 其蛋白序列存在一个 WHy 功能域，此功能域可能参与油菜的抗旱过程。本研究首先构建植物 DR1372- pBI121 表达载体，然后利用农杆菌介导法将目的基因 DR1372 成功转入甘蓝型油菜中，并对影响油菜 再生频率以及遗传转化效率的几个因素进行了探讨，初步建立了油菜转 DR1372 基因遗传转化体系， 为DR1372 基因的功能研究奠定了基础。 关键词：DR1372；油菜；农杆菌介导；遗传转化 1. 引言 医学界的关注[1]。Battista 等推测，在耐辐射球菌中的 抗逆性研究将用于引导较高生物体的抗逆性研究[2]。 DR1372 基因就是在耐辐射奇球菌基因组中克隆得到 的一个基因，对 DR1372 蛋白序列进行分析，其内部 存在一个 WHy 功能域非特异性结合位点。Francesca 等人研究证实，WHy 功能域与脱水素具有同源性，是 参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域 耐辐射奇球菌因其对电离辐射、干燥、紫外线及 一些 DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物 *基金项目：转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-091B)， 国家自然科学基金(30871555) ，教育部新世纪优秀人才支持计划 (NCET-08-0940)，四川省教育厅(09ZA034)和西南科技大学博士研 究基金(11zx7104)，农业部公益性行业科研专项(201103007)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 40  农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜 [3]。脱水素是一类亲水性蛋白质，它们在胚胎发生后 期阶段产生，对低温、外源 ABA、干旱、盐渍以及脱 水胁迫反应迅速，进而在植株中积累[4,5]。这些间接证 据表明，DR1372 基因可能会参与植物的抗旱性应答 。 本实验室把 DR1372 基因转入大肠杆菌后，经初 步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节 细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫 应答有关的基因。本研究首先构建植物 DR1372- pBI121 表达载体，利用农杆菌介导法将 DR1372 基因 转入油菜中，并对影响油菜再生频率以及遗传转化效 率的几个因素进行了探讨，初步建立了转 DR1372 基 因油菜遗传转化体系，为该基因耐盐抗旱研究提供了 植物材料，也为DR1372 包括 WHy功能域的功能研 究奠定了基础。 2. 实验材料 2.1. 菌株 含有携带基因DR1372 的穿梭质粒(DR1372 + Z3) 的大肠杆菌 DH5α由中国农业科学院生物技术研究所 提供。 根癌农杆菌 EHA105以及大肠杆菌 JM109由本实 验室保存。 2.2. 植物材料 供试的甘蓝型油菜 84100-18(玻里马细胞质雄性 不育恢复系)，由四川大学遗传学实验室提供。 2.3. 培养基 3. 实验方法 3.1. 构建DR1372-pBI121 植物表达载体 3.1.1. PCR扩增目的基因 DR1372 根据 DR1372 基因序列，利用生物软件Primer5 设计出该基因的上、下游引物(分别命名为 DR1372-F， DR1372-R)；根据 pBI121 质粒图谱，分别引入 XbaI， SacI 限制性酶切位点，并设计引物如下(加粗标记示酶 切位点)： DR1372-F: 5’---GCTCTAGA ATGAAGAAGAT GGCTTTTGCG----3’ DR1372-R: 5’--- CGAGCTC TCAAAACACCGA TAAAGGCGC----3’ 用试剂盒(TIANGEN)提取 DR1372 + Z3质粒，以 此作为模板，在最优扩增体系下进行 DR1372 基因 PCR 扩增。电泳验证。 3.1.2. pBI121 质粒的提取 用试剂盒(TIANGEN)提取 pBI121 质粒。电泳验 证。 3.1.3. PCR产物 DR1372 与质粒 pBI121 胶回收 PCR 产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(TIANGEN)回收扩增的目的片段DR1372 和与质粒 pBI121。电泳验证。 3.1.4. DR1372 基因和pBI121 的酶切，连接，筛选及 鉴定 目的片段DR1372 和pBI121 质粒用 XbaI，SacI(购 自Takara 公司)进行双酶切，37℃酶切过夜，回收目 的片段。将胶回收的目的基因片段和 pBI121 质粒大 骨架片段，16℃连接过夜，重组质粒转化 JM109感受 态细胞。然后进行菌落 PCR 初步鉴定，将 PCR 检测 出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序。最后挑 取测序成功的 JM109单菌落，继代培养，保菌。将保 存菌种摇菌提取质粒，得到DR1372-pBI121 植物表达 载体。最后，将 DR1372-pBI121 植物表达载体导入农 杆菌 EHA105 浸染备用，具体参照余云舟等方法[6]。 LB 液体培养基：用胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，溶于 ddH2O中，定容至 1 L，pH 7.0， 高压灭菌； 农杆菌摇菌培养基：LB + Rif 40 mg/L + Str 20 mg/L + 卡那霉素 50 mg/L； 预培养基：MS + 6-BA 2.0 mg/L + AgNO3 2.5 mg/L + 2，4-D 1.0 mg/ L + AS 100 um ol / L ； 筛选培养基：MS + 6-BA 2.0 mg/L + 卡那霉素 10 mg/L + AgNO3 2.5 mg/L + Cab 500 mg/L； 3.2. 转DR1372 基因油菜遗传转化体系的建立 生根培养基：1/2 MS + Cef 250 mg/L + NAA 0.15 mg/L 。 3.2.1. 油菜无菌苗的培养 将甘蓝型油菜种子用无菌水清洗两次，浸泡 10 Copyright © 2013 Hanspub 41  农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜 min，用 75%乙醇消毒 2 min后，灭菌水清洗两遍， 然后用浓度为 0.1%的升汞溶液消毒15 min，最后用灭 菌水洗 5遍。把消毒的油菜种子均匀地摆放在无植物 激素的 MS 固体培养基上。在 25℃室温下进行光照培 养，生长 5~6 d。 3.2.2. 外植体的预培养 用剪刀剪取油菜无菌苗紧邻生长点以下约0.5 cm 长的下胚轴，置于预培养基上，光照预培养 1~4 d。 3.2.3. 根癌农杆菌浸染浓度以及侵染时间的确定 在50 mL农杆菌摇菌培养基中加入 0.5 ml载有 DR1372~pBI121 植物表达载体的 EHA105 菌液，在 28℃下200 rpm振荡培养过夜至对数生长期，OD600 约为 1.0 左右。取上述菌液于 4℃下5000 rmp离心15 min 后，弃上清，收集菌体，用 MS 液体培养基重悬， 将OD600 值为 1.0 的菌液稀释为 OD600 = 0.1、0.3、 0.4 和0.5。用上述不同浓度的菌液侵染已知数量的预 培养下胚轴，侵染时间分别为 50 s、90 s、130 s、170 s。侵染期间使外植体充分与菌液接触，然后取出浸染 后的外植体，在灭菌滤纸上吸干多余菌液，重新转入 预培养基中暗培养 2 d后观察培养情况。 3.2.4. 转基因抗性植株的获得 把暗培养 2 d后的下胚轴转入到卡那霉素筛选培 养基上进行筛选培养，每两周继代，直至再生出幼芽。 当幼芽长到 1~2 cm高时，去掉愈伤组织，并将幼芽 转移到生根培养基中。待其生长到 5~6 cm高，根长 5~6 cm以及根的数量为 10条以上时，半敞开培养瓶 盖子进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，移栽到室 内灭菌的盆土中(腐殖土:蛭石 = 2:1)，并用 1/2 MS培 养液浇灌，移栽出一周内给小苗外罩烧杯保湿，最终 得到具有卡那霉素抗性的油菜。 3.2.5. 转基因抗性植株的 PCR 检测 4. 结果 4.1. DR1372-pBI121质粒植物表达载体的构建 4.1.1. DR1372 基因的扩增 提取 DR1372 + Z3质粒，电泳结果如图 1(A)所示， 目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于 PCR 扩增。 利用 DR1372-F 和DR1372-R 引物对DR1372 基因进行 PCR 扩增，其电泳结果如图 1(B)。DR1372 基因分子 大小为 495 bp，条带位置正确，并为单一条带。最后 对PCR 产物进行胶回收。 4.1.2. pBI121 质粒的提取 提取 pBI121 质粒后进行电泳，其电泳结果如图 1(C)所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象， 可以进行酶切。 4.1.3. DR1372 与pBI12 的双酶切 对DR1372 胶回收产物进双酶切，经电泳胶回收 后如图 1(D)所示。同时对 pBI121 质粒进行双酶切， 其电泳图和胶回收情况见图1(E)和图 1(F)。 4.1.4. DR1372-pBI121 质粒转化大肠杆菌 JM109 DR1372-pBI121 质粒转化到JM109 后，经培养后 挑取抗卡拉霉素单菌落直接进行PCR 扩增，其扩增的 部分结果如图1(I)，结果表明：有多个菌落显示为阳 性，阳性克隆送去测序，测序反馈结果经基因软件分 析， 目的序列与 DR1372 序列完全一致，说明 DR1372 外源基因成功导入到了大肠杆菌JM109中。 4.1.5. DR1372-pBI121 质粒转化大肠杆菌 EHA105 将测序正确的 JM109 单菌落扩大培养后提取质 粒并转化 EHA105 感受态，得到的单菌落进行菌落 PCR 验证，结果如图 2。由图2可知，可以选择 1~2、 4~6 号保菌做浸染外植体用，阳性率为 66.67%。 4.2 油菜转 DR1372 基因遗传转化体系的建立 取甘蓝型油菜(非转基因型)和转基因再生的卡那 霉素抗性植株叶片，用 CTAB法提植物总 DNA，具 体方法参照文献《植物基因工程原理与技术》[7]。取 以上制备的总 DNA为模板，在 25微升反应体系中， 按标准反应程序对 DR1372 基因进行 PCR 扩增。具体 反应条件为：94℃，5 min；94℃，1 min；58℃，30 s； 72℃，30 s；30 cycles；72℃，10 min。 4.2.1. 预培养时间对遗传转化的影响 我们的实验结果表明，对不经过预培养或预培养 1 d的外植体进行农杆菌浸染，下胚轴分化不明显， 感染后出现较严重的褐化和死亡现象，出芽率较低。 当预培养时间为 2 d左右时，对外植体进行侵染，出 芽率达到最高的 7.86%，与Charest[8]等人的研究一致。 若预培养时间超过 4 d，外植体切面创伤逐渐愈合致 Copyright © 2013 Hanspub 42  农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜 A：DR1372 + Z3质粒电泳条带 A: Agarose gel electrophor e sis of DR1372；B：DR1372 扩增条带 B: Agarose gel electrophor esis of DR1372 PCR product；C：pBI121 质粒提取验证 C: Agarose gel electrophoresis of pBI121；D：DR1372双酶切后胶回收 D: Agarose gel electrophoresis of DR1372 digested by XbaI and SacI；E：pBI121 双酶切电泳图 E: Agarose gel electrophoresis of pBI121 di gested by XbaI and SacI；F：pBI121双酶切胶回收验证 F: Agarose gel electrophoresis of pBI121backbone； I：JM109 菌落 PCR 验证I: 1: Positive control; 2: Negative control; 3-10: PCR products of JM109 with pBI121-DR1372 clone。 Figure 1. PCR products of JM109 with pBI121-DR1372 clone 图1. JM109菌落PCR 验证 M：DL2000 Maker；9：阳性对照；10：阴性对照；1~8：单克隆菌落 PCR。 Figure 2. Analysis of colony PCR products 2. EHA105PCR 图的菌落 验证 Copyright © 2013 Hanspub 43  农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜 使农杆菌很难侵染，玻璃化率以及白化率急 从而使出芽率降低。结果表明，对下胚轴进行 2 d的 预培养可得到最高 7.86%的出芽率(表1)。 4.2.2. 农杆菌菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响 适宜的农杆菌感染浓度和感染时间是遗传转化 成功与否的重要因素[9]。我们的试验表明，如果菌液 浓度过大或偏低，感染时间过长或不足，会导致外植 体被侵染过度致死或未被感染。当农杆菌浓度达到0.5 以上时，外植体褐化严重，且农杆菌大量生长，无法 抑制，外植体在共培养和筛选试验中会慢慢死亡，导 致转化率极低；但是当农杆菌浓小于 0.2 时，经过筛 选几乎得不到绿芽。农杆菌菌液浓度在 0.3~0.5 之间 处理外植体 90 s，得到了较多的抗性芽。由表 2可以 看出，以 OD600 = 0.4的菌液处理外植体90 s，转化 到8.93%。 4.2.3. 转DR1372 油菜抗性植株的获得 转DR1372 抗性植株获得的过程如图 3所示，共 获得卡那霉素抗性植株 169 株，对其进行 PCR 检测如 图4所示，有 123 株显示出阳性，阳性率为 72.8%。 Table 1. Effect of pre-incubation time on budding rate of rape callus 表1. 预培养时间对抗性芽率的影响 预培养时间(d) 愈伤率(%) 玻璃化率(%) 白化率(%) 出芽率(%) 剧增高， 效率最高，达 0 0 0 0 0 1 40.7 0 0 4.12 2 63.9 3.4 2.2 7.86 3 94.6 18.6 13.2 6.45 4 99.3 12.3 17.9 3.37 Table 2. Effect of concentration of bacterium fluid and infection time on budding rate of rapeseed hypocotyls 表2. 农杆菌菌液浓度和侵染时间对抗性芽率的影响 感染时间(s) 菌液浓度(OD600) 侵染下胚轴数 再生绿芽下胚轴数 出芽率(%) 0.4 120 3 2.50 50 1.0 138 2 1.45 0.1 145 0 0 0.3 134 9 6.72 0.4 168 15 8.93 0.5 167 12 7.19 90 1.0 182 3 1.65 0.1 137 0 0 130 0.4 99 2 2.02 0.1 116 0 0 170 0.5 124 0 0 A：下胚轴；B：抗性芽；C：生根培养；D：移栽成活苗。 Figure 3. Regenerated seedlings on screenin g medium with kanamycin 图3. 油菜在卡拉酶素筛选培养基上再生的抗性苗 Copyright © 2013 Hanspub 44  农杆菌介导 DR1372 基因转化甘蓝型油菜 M：DL2000 Maker；1：阳性对照； Figure 4. PCR test of DR 图4. 转DR1372 5. 讨论 14：阴性对 ；2~13：抗性植株。 1372 gene in nsgenic p 基因油菜 PCR 检测 本研究首先构建 DR1372-pBI121 载体，载体上带 有一个 GUS 终止子。将植物表达载体DR1372-pBI121 载体导入农 杆菌 EHA105 利用农杆菌介导法 油菜下胚轴， 得到卡那素抗性植株 169 株 取抗性植株基因组 DNA，经PCR 检测，有 123 示为阳性，造成假 阳性的原因可能是卡那霉素的筛选压强度不足导致。 在油菜下胚轴浸染农杆菌 ，预培养时间的长 短对细胞正常分化有很大影响 培养时间过长，下 胚轴切段形成松散型的愈伤组 这类愈伤组织转到 分化培养 大多变褐死亡[10] 培养能够促进细胞 分裂，处于分裂状态的细胞更容易与外源 DNA整合， 而提高转化率。同时，在预培养基中加入适量浓度 6-BA、2，4-D、AgNO3以及 AS，也会对转化率产 生影响[11]。王 艳[12]等的研究也表明，添加一定浓度的 乙酰丁香酮也能够提高油菜的再生频率及转化率。本 研究中，随着预培养时间的延长，转化效先是升高然 后降低。适宜的农杆菌感染浓度和感染时间是遗传转 化成功与否的重要因素，菌液浓度过高或过低、侵染 时间过长或过短都会直接影响转化率。本研究结果表 明，油菜转 DR1372 基因遗传转化体系的最适宜转化 条件为：甘蓝型油菜苗下胚轴在预培养为 2 d时，达 到最高的出芽率；而菌液浓度OD600 = 0.4时为最佳 的农杆菌菌液浸染浓度，最佳的侵染时间为 90 s。 Francesca D.等人的研究表明， 结构域在植 物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能[3] 将DR1372 基因通过基因工程手段转 提高油菜的抗旱性，以此 油菜抗旱品 种，可以降低干旱对油菜产量的影响。WHy 功能域作 鲜有报道， 水分胁迫应答机制中，是WHy 能域独自是与某些特 协同 发挥响应，这一问题有待进一步探究。 参考文献 (References) [1] A. W. Anderson, C. Nordon, R. F. Cain, Gish and D. Duggan. Studies on a radio-resistant micrococ- Isolation, morphology, cull characteristics, and resistance to gamma radiation. Food Tnology, 1956, 10: 575-578. [2] E. Cominelli, T. D. Calvi, et al. Over expression of the arabidopsis AMYB 41 gene alters cell expans ion and leaf sur- face permeabilityhe Plant Journal, 2008, 53(1): 53 -64. [3] F. D. Ciccarelli,main miates the re- sponse to desiccation in plants and bacteria. Discovery Note, 2005, 21(8): 1304-1307. [4] J. Ingram, D. Bartels. The molecular basis of dehydration toler- ance in plants. A nnua l Re vi ew of Pl ant P hy si ol ogy and Plant Mole - cular Biology, 1996, 47: 377-403. [5] 刘广宇, 魏令波等. 植物脱水素研究进展[J]. 生物工程进展, 2001, 21(2): 35-38. [6] 余云舟, 杜娟. 重组质粒导入根瘤农杆菌冻融法的研究[J]. 2003, 25(3): 257-259 . [7] 王关林, 方宏筠. 植物基因工程原理与技术(第一版)[M]. 北 京: 科学出版社, 1998: 600-601. [8] P. J. Charest, L. A. Holbrook, J. Gabard, et al. Agrobacterium mediated transformation of thin cell layer explants from Bra- ssica napus L. Theoretical and Applied Genetics, 1988, 75(3): 438-445. [9] 黄琼华, 杨光伟. 农杆菌介导法将FPF1 基因导入油菜的研究 初报[J]. 西南农业大学学报, 2002, 24(2): 124-127. [10] 蓝海燕, 王长海等. 农杆菌介导法将 β-1,3-葡聚糖酶基因导 入油菜的研究初报[J]. 中国油料作物学报, 2000, 22(1): 6-10. [11] 石淑稳, 周永明等 蓝型油菜遗传转化体系的研究[J]. 华 17(3): 205-210. 导NHX 基因转化甘蓝型油菜的研 : 278-282. 照 tralants 基因，以及CaMV35S 强启动子和 NOS 为一种干旱响应蛋白，在国内外的研究中 中， 转化 霉 。提 株显 以后 。预 织， 基上 。预 为基础通过培育 而且在植物体内的抗 功 发挥了作用还定的序列 H.. Parr cus. I. tura ech Sala, . T P. Bork. The WHy doed 从 的 WHy 中农业大学学报, 1998, . 甘 ，[12] 王艳, 曾幼玲等. 农杆菌介 究[J]. 作物学报, 2006, 32(2) 入油菜中可能会 Copyright © 2013 Hanspub 45 |