 Asian Case Reports in Genetics亚洲遗传病病例研究, 2013, 1, 1-5 http://dx.doi.org/10.12677/acrg.2013.11001 Published Online February 2013 (http://www.hanspub.org/journal/acrg.html) The Regulation of Pu-erh Tea on Blood Lipids in apoE-Gene Knocked Mice* Xinfeng Jiang1, Wanfang Shao2#, Caixia Liu1, Chunhua Cheng3, Jihong Yang3 1Jiangxi Sericulture and Tea Research Institute, Nanchang 2College of Longrun Pu-erh Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 3Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Email: jiangxinyue003@163.com, #shaowf38@vip.sina.com Received: Jan. 4th, 2013; revised: Jan. 7th, 2013; accepted: Jan. 30th, 2013 Abstract: This study aimed to investigate the effects of Pu-erh tea on blood lipids in apoE-knockout mice. So we se- lected 4-week-old male apoE-gene knocked mice, and they were randomly divided into four groups: atherosclerosis group, fermenting Pu-erh Tea group, fermented Pu-erh Tea group and drug group. The all mice were used as the control. All mice were fed with normal chow diet. After 90 days, Vessels blood was collected for serum lipid, using automatic biochemical analyzed measuring serum the total clesterol (TC), triglycerides (TG), low-density lipoprotein (LDL-C), high-density lipoprotein (HDL-C), and other hyperlipidemia indicators. The result is that Pu-erh Health (cooked) tea cansignificantly increase control of body weight (P < 0.05); reduce the high fat mice serum TG, LDL-C content, in- creased HDL-C in (P < 0.05); And cooked Pu-erh tea can significantly reduce the high fat rat serum TC, TG, LDL-C in (P < 0.05). These results suggested that Pu-erh tea may play a role in anti-atherosclerosis in apoE-knockout mice. Keywords: Pu-erh Tea; Atherosclerosis; The Mice of apoE-Gene Knocked 普洱茶调节 apoE 基因敲除小鼠血脂水平的研究* 江新凤 1，邵宛芳 2#，刘彩霞 1，程春华 3，杨继红 3 1江西省蚕桑茶叶研究所，南昌 2云南农业大学龙润普洱茶学院，昆明 3云南省天然药物药理重点实验室，昆明 Email: jiangxinyue003@163.com, #shaowf38@vip.sina.com 收稿日期：2013 年1月4日；修回日期：2013年1月7日；录用日期：2013 年1月30 日 摘 要：为了验证普洱茶对 apoE 基因敲除小鼠动脉粥样硬化的作用；本研究选取了40 只4周龄雄性 apoE 基因 敲除小鼠，按照体重随机分成降脂药组、模型组、生茶组、熟茶组 4组外加10 只正常对照组。用普洱茶汤进行 干预性试验90 天后，空腹 12 小时，摘眼球采血，采用全自动生化仪测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、 低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL -C) 等血脂指标；试验结果显示：普洱茶(生、熟)均可显著控制小鼠 体重增长(P < 0.05)；普洱生茶可显著降低小鼠血清中TG、LDL-C 的含量，升高 HDL-C 的含量(P < 0.05)，可显 著降低 AI系数；因此可判定，普洱茶对 apoE 基因敲除小鼠的抗动脉粥样硬化有一定的调节作用。 关键词：普洱茶；动脉粥样硬化；apoE 基因敲除小鼠 1. 引言 载脂蛋白 E(apolipoprotein E, apoE)是血浆中重要 的载脂蛋白之一。apoE 主要在肝脏合成、分泌和代谢， 参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血 小板聚集、免疫调节等作用[1]。载脂蛋白(apolipoprotein E, apoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的 *基金项目：国家现代农业(茶叶)产业技术体系建设专项(CARS-23)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 1  普洱茶调节 apoE基因敲除小鼠血脂水平的研究 配体，因此，缺乏 apoE 则会导致血液循环中富含胆 同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(AS) 病灶形成。apoE 基因敲除小鼠亦称 apoE 基因缺陷小 鼠，由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北 卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因 敲除(gene knockout)技术于1992 年培育成功；这种小 鼠无论正常或高脂血症及AS 的发病机理和治疗措施 等方面做了很多卓有成效的研究[2]。 本研究将以不同加工工艺的普洱茶为原料，选取 apoE 基因敲除小鼠作为试验对象，在造模的同时，受 试物经口灌胃 90 天后，测定其血脂指标，从而验证 普洱茶是否具有抗动脉粥样硬化的作用，为普洱茶的 保健功效提供科学理论依据，为消费者健康饮用普洱 茶提供参考，从而促进普洱茶产业的健康发展。 2. 试验材料 2.1. 试验动物 SPF级C57B/6J8 周龄雄性小鼠 10 只，购入时体 重20 ± 2 g，生产许可证号：SCXK(渝)2007-0008。来 源于第三军医大学大坪医院。 SPF级apoE(-/-)小鼠 4周龄雄性40 只，购入时体 重20 ± 2 g，生产许可证号 SCXK(京)2006-000 8。来 源于北京大学实验动物中心。 2.2. 试验材料 1) 茶叶原料：普洱茶(生茶)、普洱茶(熟茶)：由 云县天龙生态茶叶有限责任公司生产；生产日期： 2007 年6月；卫生许可证号：[2006]第530922-000132； 2) 市售对照品：某市售调节血脂中药(XZK)，购 于药店； 3) 饲料：鼠用全价颗粒饲料，高压灭菌，常温贮 存。饲料生产许可证SCXK(滇)2005-2009。 2.3. 实验试剂 总胆固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)购于北京中生生 物工程技术公司；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高 密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，购于温州东区生物工程 公司。 2.4. 主要仪器 RE-52AA 旋转蒸发仪 ，上海亚荣生 化仪器厂； TMS-1024 全自动生化分析仪，日本京都；Leica RM- 2145 石蜡包埋切片机，德国制造；Leica EG1160 包埋 机：德国制造；Leica APS200组织脱水机；德国制造。 2.5. 茶汤及药的制备 2.5.1. 茶汤制备方法[3] 普洱茶 100 g沸水浸提三次(各次茶水比为 1:20；1:20；1:10；浸提时间分别为20 min、20 min、 10 min)脱脂棉过滤合并三次浸提茶汤滤液减 压浓缩至 100 mL(浓缩温度 60℃)装瓶灭菌备用。(其 茶汤浓度为 1克茶/毫升茶汤的提取液)。茶汤一周浓 缩一次，浓缩后的茶汤低温冷藏(4℃)，灌胃前充分摇 匀，现配现用。 2.5.2. 药的制备 准确称取 2 g市售降脂药研钵内研细，放入烧杯 中，加入蒸馏水搅拌溶解后移入50 mL容量瓶中定容 至刻度，即为4%市售对照药溶液，现配现用。 2.6. 动物分组及试验方法 2.6.1. 动物分组 40 只雄性 apoE(-/-)小鼠随机分为 apoE(-/-)对照组 (10 只)，apoE(-/-)普洱生茶组(10 只)，apoE(-/-)普洱熟 茶组(10 只)，apoE(-/- )市售品组(10 只)。10 只C57BL/6J 小鼠为 apoE(+/+)对照组。见表 1。 2.6.2. 试验方法 1) 动物检疫 适应性饲养7天后，未发现异常体征和体重偏大 或偏小的动物。所有动物外观发育正常，无畸形，无 外伤，皮肤无污染物。头部端正，眼部无分泌物，鼻 Table 1. Grouping and dosage design of experimental mice 表1. 动物分组及剂量设计 组别 受试物 剂量 apoE(+/+)对照组 蒸馏水 - apoE(-/-)对照组 蒸馏水 - apoE(-/-)普洱生茶组 普洱茶生茶 30 mg/kg·bw apoE(-/-)普洱熟茶组 普洱茶熟茶 30 mg/kg·bw apoE(-/-)降脂药组 降脂药 10 mg/kg·bw Copyright © 2013 Hanspub 2  普洱茶调节 apoE基因敲除小鼠血脂水平的研究 Copyright © 2013 Hanspub 3 验周期为3个月每周测体重一次，根据体重变化调整 动物干预容量。 无豁液流出，口腔无出血，耳无外伤。营养良好，饮 食和粪便正常，行动迅速，反应灵敏。 经处理 3个月后，所有动物禁食不禁水过夜，次 日牺牲动物，收集全血 2~3 mL。将收集的血样置于 5 mL 离心管中，以3000 rpm/min 离心 15 min，制备血 清，−20℃冻存待用。 2) 动物识别方法 用饱和苦味酸被毛染色，挂笼卡标识，注明课题 编号、课题负责人、笼号、动物号、试验起止时间。 3) 动物饲养和管理 测定小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酷(TG)、高 密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇 (LD-C)。 环境条件：SPF 级动物实验室，温度：20℃~25 ℃(日温差 ≤ 3℃)；湿度：40%~70%；换气次数：10~11 次/h；气流速度：0.1~0.2 m/s；压强梯度：20 Pa；空 气洁净度：10000 级；落下菌数(静态)：直径 9 cm培 养皿开放置30 min，置 37℃温箱培养48 h，≤3个/皿； 照明：12 h：12 h 明暗交替，照度：150~300 lx；噪音： ≤60 dB。实验动物使用许可证：SYXK(滇)2005- 0003。 根据 Plum 等发表的方法[5]，用公式 AI = (TC- HDL-C)/HDL-C计算动脉硬化指数。 2.7. 统计学处理 计量资料试验数据以 SEx表示，用 SPSS17.0 动物管理：C57BL/6J 小鼠和apoE基因敲除小鼠 在SPF 级动物房中饲养，自由饮食饮水。每周更换垫 料1次，笼具 1次。笼具除去污物，用清水洗净晾干， 用0.1%优氯净消毒。每天实验操作结束后及时除去笼 架和实验场地的污物，用0.1%优氯净擦试不锈钢架， 工作车、拖地。记录动物饲养室温度和湿度。配好的 药物和其他试验用具经传递窗紫外线照射 15 min进 入洁净区。 统计软件包对数据进行统计分析，多组均数比较用单 因素方差分析，两组均数比较用q检验。以 P < 0.05 作为差异显著性标准。 3. 结果与分析 3.1. 普洱茶对 apoE基因敲除小鼠血清指标 的影响 4) 干预方法及处理 从表2可以看出，普洱生茶组和模型组及降脂药 组的 TC 含量均较正常对照组含量大幅上升，差异呈 现极显著水平，而熟茶组与apoE(-/-)对照组相比，下 降达到极显著水平，与降脂药组相比，下降达到显著 采用经口灌胃，每天早上(9:00~11:00)干预一次， 连续给予3个月。受试物干预容量均为0.2 mL/10 g， 干预剂量参考孙敬修编著的试验动物方法学[4]。本试 Table 2. Effect of Pu-erh tea on blood lipid level of apoE-knockout mice: ±SEx 表2. 普洱茶对 apoE基因敲除小鼠血清血脂水平的影响： ±SEx 组别 TC (mmoL/L) TG (mmoL/L) apoE(+/+)对照组 2.60 ± 0.39▲▲ 0.76 ± 0.35▲▲ apoE(-/-)对照组 46.75 ± 6.52** 2.50 ± 0.71** 降脂药组 14.76 ± 7.12**/▲▲ 1.08 ± 0.43▲▲ 普洱熟茶组 23.44 ± 4.97**/▲▲ 0.84 ± 0.53▲▲ 普洱生茶组 21.25 ± 6.99**/▲▲ 1.23 ± 0.72▲▲ 组别 HDL (mmoL/L) LDL (mmoL/L) apoE(+/+)对照组 1.93 ± 0.17▲▲ 0.67 ± 0.32▲▲ apoE(-/-)对照组 7.61 ± 0.82** 39.07 ± 5.78** 降脂药组 4.21 ± 1.27**/▲▲ 10.55 ± 5.91** 普洱熟茶组 5.25 ± 0.38**/▲▲ 17.18 ± 3.83**/▲▲ 普洱生茶组 5.39 ± 1.39**/▲▲ 15.84 ± 5.76**/▲▲  普洱茶调节 apoE基因敲除小鼠血脂水平的研究 水平(P < 0.05)；普洱生(熟)茶各组较apoE(-/-)对照组 及降脂药组均可使 TG 含量明显下降，差异达极显著 水平。普洱茶可明显抑制血清中TG含量，并使其达 到正常水平，但对 TC 的抑制效果则不明显；普洱熟 茶则对 TG 的抑制作用较明显，均可使试验小鼠血清 中的 TG含量达到正常水平；而且，普洱茶对TG 的 抑制效果均明显优于降脂药物。 普洱生茶可明显升高HDL-C 含量，差异均较 apoE(+/+)对照组、apoE(-/-)对照组呈现极显著水平， 与apoE(-/-)对照组达到显著水平，熟茶有所上升，但 差异不明显。而普洱熟茶各组可明显降低 LDL-C含 量，差异较apoE(-/-)对照组及 apoE(+/+)对照组呈现极 显著水平，而与降脂药组相比，差异显著(P < 0.05)， 生茶较 apoE(-/-)对照组及降脂药组，有所下降差异呈 现显著水平(P < 0.05)。 普洱生(熟)茶均可使试验小鼠血液中的 LDL-C 含 量下降，HDL-C 含量上升，普洱生茶对升高 HDL-C 的含量，作用明显，而普洱熟茶对降低 LDL-C 的含 量，作用明显，且普洱茶对降低小鼠血液中 LDL-C 含量及升高HDL-C 含量的作用，明显优于降脂药物。 3.2. ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化指数影响 apoE(+/+)对照组与apoE(-/- )对照组、降脂药组、 普洱熟茶组、普洱生茶组均有极显著性差异，可见抗 动脉粥样硬化建模成功；apoE(-/-)对照组与普洱茶组 (生、熟)差异呈极显著水平，普洱茶组 AI值显著降低， 可见普洱茶有明显的抗动脉粥样硬化效果；普洱生茶 组与熟茶组之间差异无显著性差异(见表 3)。 4. 讨论 普洱生茶和普洱熟茶有降低高脂血症的作用。其 降血脂的作用可能与普洱茶中所含茶多酚及握堆过 程中产生的他汀类物质有关。普洱生茶和普洱熟茶可 降低动脉粥样硬化指数，提示二者有抗动脉粥样硬化 的作用，其具体作用机制还不甚清楚，除与抗脂质过 氧化外，可能还与抗炎症有关。 云南普洱茶必须以云南大叶种为原料，才能加工 出真正意义上的普洱茶。由于云南大叶种有不同与中 小叶的品质特点，尤其在生化成分方面如茶多酚、儿 茶素、咖啡碱等方面都高于中小叶种。使得云南大叶 种成为驰名中外的优良茶树品种，加上特殊的加工工 艺使茶叶中对人体有益的茶多酚、咖啡碱等物质充分 氧化，形成了普洱茶优异的品质基础，才能使它的保 健功效得以充分的体现。其次，握堆是普洱茶形成的 关键环节。普洱茶握堆的实质是以晒青毛茶的内含成 分为基质，在微生物分泌的胞外酶的酶促作用、微生 物呼吸代谢产生的热量和茶叶水分的湿热协同下，发 生的茶多酚氧化、缩合、蛋白质和氨基酸的分解、降 解，碳水化合物的分解以及各产物之间的湿热、缩合 等一系列反应，从而形成普洱茶特有的品质。 脂质代谢紊乱是 AS 主要危险因素之一。郑青山 等人利用鹤鹑高血脂模型测定了茶多酚的降血脂作 用结果显示：茶多酚具有较强的降低血清TC、TG 和 LDL-C 水平的作用，TC/HDL-C 比值变化小，对 HDL- C水平影响不大。沈新南等还对茶多酚降血脂抗血栓 作用进行了研究发现茶多酚能有效地降低高脂血症 大鼠血清中 TC和TG 的含量，其在降低血清TC 时， 还能提高 HDL-C 的含量[6]本试验利用apoE 基因敲除 小鼠高脂血症模型测定普洱茶的降血脂作用，结果显 示：与 apoE(-/-)对照组相比，普洱生茶和普洱熟茶组 TC、TG和LDL-C 的水平均明显降低，差异有统计学 意义(P < 0.05)。提示普洱茶有降低血脂中 TC、TG和 LDL-C 的作用；与降脂药组相比，普洱生茶与熟茶降 低甘油三醋的能力与降脂药作用相当。但生茶与熟茶 在降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇上，作用要弱 于降脂药(P < 0.05)。生茶与熟茶在降低总胆固醇和低 密度脂蛋白胆固醇方面作用相当 (P > 0.05)。 根据推测，普洱茶中含量丰富的他汀类物质很可能 来源于普洱茶后发酵过程中产生的优势菌群。普洱茶 由生茶发酵为熟茶的过程中，主要优势菌群为：黑曲 Table 3. Effect of Pu-erh tea on AI of apoE-knockout mice: ±SEx 表3. 普洱茶对 apoE基因敲除小鼠 AI系数的影响： ±SEx 组别 apoE(+/+)对照组 apoE(-/-)对照组 降脂药组 普洱熟茶组 普洱生茶组 AI 0.35 ± 0.16▲▲ 5.14 ± 0.50** 2.2 ± 1.00** 3.43 ± 0.65**/▲▲ 2.84 ± 0.85**/▲▲ Copyright © 2013 Hanspub 4  普洱茶调节 apoE基因敲除小鼠血脂水平的研究 霉、青霉属、根霉属、灰绿曲霉、酵母属等。这些菌 在适 的湿度、温质等特定以 erences) [1] 张新波, 王绿娅, 陈保生. 载脂蛋白 AI 的抗动脉粥样硬化功 志, 2007, 15(3): 233-236. [2] 彭旷. 载脂蛋白Ｅ及基因敲除小鼠的研究进展[J]. 心血管病 学进展, 2006, 27: 74-78. , 陈文 茶急性 究 in EC cells. CELL, 属 当度和气候土 环境下可 产生他汀类物质。这就为普洱茶的降脂功效找到了确 切有力的证据。 参考文献 (Ref 能研究的进展[J]. 中国动脉粥样杂 品, 白文祥. 普洱[3] 刘勤晋 毒性安全性评价研 报告[J]. 茶叶科学, 2003, 23(2): 141-145. [4] 孙敬修. 实验动物方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2001. A. S. Plum, Jonathan D. S[5] mith, Tony Hayek, et al. Severe hy- Pereholesterolemia and atheroslerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination 1992, 71(10): 343-353. [6] L. Park, K. G. Raman, K. J. Lee, et al. Suppression of acceler- ated diabetic atherosclerosis by the soluble receptor for advanced glycation endproducts. Nature Medicine, 1998, 4(9): 1025-1031. Copyright © 2013 Hanspub 5 |