 Medical Diagnosis 医学诊断, 2013, 3, 15-20 http://dx.doi.org/10.12677/md.2013.31004 Published Online March 2013 (http://www.hanspub.org/journal/md.html) Progress of Ultrasound Contrast Agent Containing Liquid Perfluorocarbons* Zhong Cao#, Chunyang Zhang, Wenjian Zhu, Hao Li Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou Email: #cz.83@163.com Received: Jan. 14th, 2013; revised: Feb. 8th, 2013; accepted: Feb. 20th, 2013 Abstract: With the advancement of nanotechnology and ultrasound molecule imaging, a novel contrast agent has be- come a new research approach. Liquid perfluorocarbons coated with different materials as ultrasound contrast agents exhibit different characteristics. This article reviews the background, application and prospect of perfluorocarbon nanoparticle. Keywords: Liquid Perfluorocarbons; Ultrasound Contrast Agent; Lipid; Polymer; Silica 包裹液态氟碳超声造影剂的研究进展* 曹 众#，张春阳，朱文健，李 皓 中山大学工学院生物医学工程，广州 Email: #cz.83@163.com 收稿日期：2013 年1月14 日；修回日期：2013年2月8日；录用日期：2013 年2月20 日 摘 要：随着纳米技术和超声分子成像技术的迅速发展，一种新型造影剂——液态氟碳超声造影剂应运而生。不 同包膜材料的液态氟碳超声造影剂分别表现出不同的性质。本文就氟碳类超声造影剂的背景、材料、应用现状 及展望等方面做一综述。 关键词：液态氟碳；超声造影剂；磷脂；高分子材料；二氧化硅 1. 引言 超声造影剂(Ultrasound contrast agent)简称 UCA， 是一类能够显著增强超声背向散射强度的诊断试剂， 在医学影像诊断方面具有良好的应用前景。近年来一 种新型超声造影剂——液态氟碳纳米超声造影剂，受 到了众多科研工作者的关注。 2. 液态氟碳类显影剂发展和优点 1977 年Liuand[1]首次发现液态氟碳可同时作为超 声造影剂和核磁共振(MR)对比剂，此后液态氟碳化合 物成为研究热点。随着超声造影剂的不断发展，近年 来以氟碳类超声造影剂为介导的影像诊断和治疗技 术进展迅速。 氟碳化合物是氟化的脂肪族类复合物，短氟碳链 化合物以气体形式存在，如全氟丙烷；长氟碳链化合 物则以密度高于水的液体形式存在。可用于制备超声 造影剂的氟碳液体主要有全氟丁烷(DFB)、全氟戊烷 (PFP)、全氟 己 烷 (PFH)、全氟辛溴(PFOB)、全氟萘烷 (PFD)等。不同液态氟碳化合物的声学特性不同，如 PFP、PFH 沸点很低，进入体内后会有液气相的转变， 最终形成大的微泡来加强显影效果，而PFOB 和PFD *资助信息：本研究受到国家自然科学基金(No. 81101142)，广东省 自然科学基金(S2011040005922)和中山大学高校基本科研业务费 (12lgpy06)的资助。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 15  包裹液态氟碳超声造影剂的研究进展 沸点较高，在体内主要通过聚集的方式实现超声显影 效果的增强。 与气态氟碳类造影剂相比，液态氟碳类造影剂在 体内显像方面存在更多优势，具有以下优点：1) 由于 内部包裹物为液体，表面张力较小，可以制成更小粒 径的微泡，粒径在几十纳米至几百纳米之间，这样大 小的微粒可穿过血管内皮细胞到达血管外靶标，大大 增强了其穿透力[2]；2) 稳定性更强，在血管内存留时 间长，在体内的循环半衰期可达数小时，延长了诊断 时间[3]；3) 微球内部不含气体，只有大量聚集时才具 有较强的反射和背向散射性能而显影，未聚集时并不 显影，且这种聚集显影不像微泡造影剂那样具有声影 现象与背景噪声，从而可以大大提高分辩准确性，有 利于提高诊断的准确性；4) 有望成为一种多功能造影 剂，有关研究报道了液态氟碳造影剂可用作靶向显影 与治疗以及在 CT、MRI 中的使用情况，因此液态氟 碳纳米粒还具备成为一种理想的多模态、多功能分子 成像造影剂的潜能。 3. 氟碳类超声造影剂的研究进展 3.1. 脂质包被的液态氟碳微球超声造影剂 脂质包被的液态氟碳微球超声造影剂，最早由 Lanza等[4,5]研制，其核心为全氟辛溴(PFOB)，外层单 层膜由卵磷脂(64%)、胆固醇(35%)和biotin-LC-DPPE (1%) 组成，脂质表面的生物素可以连接一些靶向配 体，从而使造影剂具有靶向功能。与传统的超声微泡 造影剂相比，液态氟碳纳米乳剂粒径小，约 100~200 nm，具有更高的体内稳定性及组织穿透力。而且它们 只有聚集时，才产生较强的超声回声信号，可降低背 景噪声，非常有利于超声分子显像。Kaneda 等[6]采用 高压均质法制备脂质包裹的纳米液态氟碳乳剂用作 超声显像，取得了较好的效果。 近年来国内对脂质液态氟碳超声造影剂的研究 也取得了较大进展。王志刚教授课题组[7-9]做了大量的 工作，以磷脂为材料制备了叶酸受体靶向液态氟碳纳 米粒造影剂，还进行了 CT 显像的研究，发现液态氟 碳纳米粒具有持续性增强大鼠肝脾实质及脉管系统 CT 显像的能力[10]。谢明星教授课题组[11]构建的液态 氟碳纳米脂质微粒，通过MCP-1 单克隆抗体及“生 物素–亲和素”桥连系统，能够靶向识别大鼠心肌缺 血–再灌注模型中的存活心肌，并使其特异性显影增 强。 Paul S. Sheeran[12]等人用二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DPPC)等磷脂包覆全氟丁烷(DFB)制备了一种脂质氟 碳相变造影剂(图1)，粒径在 200~300 纳米左右，升 高温度后，该造影剂能增大到 1~5 μm，这样就可以增 强纳米氟碳显影剂的显影效果。但由于 DFB 沸点很 低，常温下相对不稳定，所以整个制备、储存过程要 在温度很低的情况下才能完成，其制备工艺要求较 高，所以具有一定的局限性。 3.2. 高分子聚合物包被的液态氟碳超声造影剂 与传统磷脂超声造影微泡相比，高分子超声造影 微泡显示了非常优越的稳定性，其原因在于高分子外 壳在抵抗超声波的破坏方面比单分子多层磷脂或表 面活性剂更有耐力[13-16]。将高分子的稳定性能与氟碳 类液体相结合，通过常规方法可将高分子微胶囊粒径 控制在纳米至微米范围内。其中聚乳酸–羟基乙酸共 聚物(PLGA)以其本身良好的生物相容性及可降解性 为制备高分子超声造影剂的首选囊材。Pisani[17] 成 Figure 1. Scheme of a new phase-shift agent[12] 图1. 相变造影剂的制备过程[12] Copyright © 2013 Hanspub 16  包裹液态氟碳超声造影剂的研究进展 等以聚乳酸–羟基乙酸共聚物(PLGA)为囊材、以液态 的全氟己烷(PFH)、全氟萘烷(PFD)、全氟辛溴(PFOB) 为内容物通过溶剂蒸发法制备高分子超声造影微胶 囊。该PLGA 微胶囊具有完整球形结构，内部包裹全 氟化碳液体，抽真空后有部分显示空腔结构，如图 2 所示。激光共聚焦显微镜图片显示 PLGA 均匀的包裹 在氟碳液体的外层。 为了延长高分子超声造影微胶囊在人体内循环 的时间，研究工作者主要在两方面进行了研究，一方 面降低高分子微胶囊的粒径，避免其在通过肺毛细血 管滤过作用，与此同时小粒径的高分子超声造影剂具 有血管外显影的潜力，结合肿瘤部位新生血管的EPR 效应[18]可作为肿瘤部位显影剂。虽然纳米级超声造影 剂超声反射信号较弱，但是通过连接具有主动靶向功 能的特异性配体使其在靶向部位聚集[19]，可以显著提 高超声反射信号。另一方面在高分子表面修饰具亲水 性基团聚乙二醇(PEG)，使微胶囊表面带有亲水性壳 层，便于高分子微胶囊逃离单核巨嗜细胞的吞噬，从 而延长高分子微胶囊体内循环的时间。Nicolas Tsapis [20,21]等通过乳液–蒸发法制备了粒径集中在 170 nm 左 右的 PLGA 包裹 PFOB 的纳米球，如图3所示。 体外、体内超声成像实验结果显示表面修饰了 DSPE-PEG后，超声造影剂在鼠肿瘤部位具有更明显 的显影效果，从而证明了该种超声造影剂具有一定的 超声成像的功能和在肿瘤组织中积累的效应，说明其 在肿瘤的早期诊断与治疗方面的潜在应用价值。 由于液态氟碳类物质具有高浓度的氟原子可以 作为 MR 的对比剂，与负载液体氟碳类高分子的超声 造影能力相结合，形成具有双模态的显影系统。Pisani [22] 等通过溶剂蒸发法将全氟辛溴(PFOB) 包裹于 PLGA 中，实验证明，这种高分子超声造影剂微胶囊 壳层厚度越薄、微胶囊的可压缩性越好，超声显影效 果增强的效果就越好。超声造影结果显示该高分子超 声造影剂具有良好的肝部血池显影效果的同时，还具 有MR 显影能力。 近来国内对高分子液态氟碳超声造影剂的研究 也取得了较大进展。王志刚教授课题组[23]采用乳化– 蒸发法制备包裹液态氟碳的乳酸–羟基乙酸共聚 (PLGA)微球，成功制备了分别包裹 PFOB和PFH 的 PLGA 微球，微球粒径小，稳定性好。PFH/PLGA 微球 Figure 2. Confocal microscopy image (scale bar = 10 µm) (Left). SEM images of microcapsules (right)[17] 图2. PLGA微胶囊激光共聚焦显微镜图片(标尺为 10 微米)和扫描电子显微镜图片[17] Figure 3. Scheme of surface modification of polymeric nanocapsule[20] 图3. 表面改性的聚合物纳米胶囊制备过程[20] Copyright © 2013 Hanspub 17  包裹液态氟碳超声造影剂的研究进展 在水域中加热到70℃时，光镜及体外超声可见微球随 加热温度升高体积逐渐增大、数量逐渐减少，可发生 液气转变，有望成为一种新型超声造影剂。李皓等[24] 以生物可降解的两亲性嵌段共聚物–聚乙二醇-b-聚 (ε-己内酯)为原料，通过双乳化法制备一种负载全氟己 烷的、可控超声显像的纳米囊颗粒。所得纳米囊的粒 径在 200 nm左右，能穿透肿瘤血管壁到达肿瘤组织 内部并肿瘤细胞所吞噬。在辐照区域内，超声的热效 应会使 组织温度升高，导致造影剂内核全氟己烷(PFH) 的汽化，从而引发纳米囊的膨胀直至显著成像。 3.3. 二氧化硅包裹的液态氟碳超声造影剂 中空微胶囊常以高分子或二氧化硅为材料，通过 渗透膨胀[25]、乳液滴加法、层层自组装及去除模板等 方法制备得到，这种微胶囊无论从硬度、形状结构到 粒径范围，都符合作为超声造影剂的要求。二氧化硅 已经被研究工作者证明是一种具有较好生物相容性 的材料，结合溶胶–凝胶法可作为保护层[26,27]。近年 来，有研究报道通过核壳方法制备二氧化硅中空微胶 囊具有超声敏感的特性。Hall[28]等以粒径均一的聚苯 乙烯为模板，以正硅酸乙酯(TEOS)、三烷氧基硅烷 (OTES)、4-四氢邻苯二甲酰酐基三甲氧基硅烷(TSPA) 为材料，通过静电自组装和 Stöber 法使微球表面形 成硅酸盐壳层，该壳层的厚度可根据正硅酸乙酯溶液 浓度进行调控，最后用四氢呋喃溶解聚苯乙烯微球形 成具有中空结构的二氧化硅微胶囊(图4)。扫描电镜显 示Si-O-Si 的网状结构有效地维持微胶囊的完整球形 结构，间接证明二氧化硅微胶囊具有很好的稳定性， 超声实验证明具有较好的成像效果。 杨仕平[29]等人在带氨基的二氧化硅微胶囊(粒径 约为 1 μm)表面进一步修饰 PEG，溶血实验与细胞实 验表明此种材料具有良好的血液相容性，低的细胞毒 性。超声实验显示其具有良好的超声效果，与临床使 用的商品声诺维在相同超声参数及浓度条件下进行 比较(如图5)，表现出优越的稳定性，超声显影时间明 显增长。 针对二氧化硅微胶囊作为超声造影剂具有突出 稳定性这一特点结合临床需要，施剑林[30]等将负载全 氟己烷的二氧化硅微胶囊(如图6) 作为高强度聚焦超 声的显影材料。由于传统的超声造影剂如脂质超声造 影剂稳定性较差，在高超声能量条件下易破裂，无法 长时间维持显影效果。施剑林等将温敏性的全氟己烷 (沸点：56℃)负载于中空结构的二氧化硅微胶囊中， 在高度聚焦超声的条件下局部温度升高使全氟己烷 气化持续从二氧化硅微胶囊中释放出来，产生持续的 影效果的同时增加了局部治疗效果。 显 Figure 4. (a) SEM images for near-monosdisperse negatively charged polystyrene particles; (b) TEM image shows polystyrene-silica core/shell particles revealing thin silica lamination; (c) The etched hollow particles under TEM; (d), (e) SEM and TEM image of OTES-TSPA-TEOS composite hollow particles; (f) SEM (left) and TEM (right) images of composite laminate of TSPA-TEOS particle[28] 图4. (a) 聚苯乙烯的 SEM 图；(b) 修饰硅壳的 TEM 图；(c) 除去 PS 后二氧化硅微胶囊的 TEM 图；(d), (e) OTES-TSPA-TEOS复合微胶 囊SEM 与TEM 图片；(f) TSPA-TEOS复合微胶囊 SEM(左)与TEM 图片(右)[28] Copyright © 2013 Hanspub 18  包裹液态氟碳超声造影剂的研究进展 Figure 5. In vitro ultrasound images of SonoVue and PEG-HSS in physiological saline solution recorded at different imaging times[29] 图5. 声诺维与二氧化硅微胶囊在不同时间条件下的体外超声实验[29] Figure 6. Schematic illustration of the fabrication process of MSNC-PFH[30] 图6. 负载全氟己烷二氧化硅微囊制备的示意图[30] 4. 存在问题与展望 虽然包裹液态氟碳的造影剂在显像与治疗中的 应用广泛，但目前仍存在许多亟待解决的问题：脂类 氟碳超声造影剂也存在一些缺点，如稳定性较差，有 效增强显影时间较短、成本较高等。高分子和二氧化 硅氟碳超声造影剂由于外壳较脂类硬，因此抗压性和 稳定性有显著的提高，显影持续时间较长。但这两种 材料外壳常较硬，需较高的声学输出，才能产生增强 的对比，成像时容易肺出血、毛细血管破裂等，因此 应继续探寻对人体更安全的新型材料。另一方面液态 氟碳类纳米超声造影剂粒径小，穿透能力强，但声学 回声弱，特别是直径 < 400 nm的粒子，所以目前的 造影剂要实现肿瘤细胞的分子成像还存在一定的困 难。因此，制备稳定的纳米级超声造影剂，使其既能 直接穿透血管到达靶组织，又能增强组织超声显影是 学者研究的热点，也是科研工作者努力的方向。液态 氟碳超声造影剂可作为一种真正多模态、多功能的造 影剂，对其深入研究将为分子影像学带来新的进展。 5. 致谢 感谢国家自然科学基金(No. 81101142)，广东省自 然科学基金(S2011040005922) 和中山大学高校基本 科 研业务费(12lgpy06)给予本研究的支持。 参考文献 (References) [1] M. S. Liu, D. M. Long. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology, 1977, 122(1): 71-76. [2] T. Cyrus, P. M. Winter, C S. D. aruthers, et al. Magnetic reso- nance nanoparticles for cardiovascular molecular imaging and therapy. Expert Review of Cardiovascular Therapy, 2005, 3(4): 705-715. [3] R. Diaz-Lopez, N. Tsapis, M. 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