 Advance in Microbiology 微生物前沿, 2013, 2, 16-21 http://dx.doi.org/10.12677/amb.2013.21004 Published Online March 2013 (http://www.hanspub.org/journal/amb.html) Disease-Resistance Induction in Cotton by Inoculation with Endophytic Bacteria Strains YBS106* Qinlan Guan1, T i anxi ng Lin1, Mingfu Gong#1,2 1School of Life Sciences, Leshan Normal University, Leshan 2 Key Laboratory of Special Biological Resources in Mountain Emei, Leshan Email: 1508666836@qq.com, 182476903@qq.com, #gongmingfu98@163.com Received: Feb. 16th, 2013; revised: Mar. 9th, 2013; accepted: Mar. 16th, 2013 Abstract: The induced resistance of Serratia marcescens strain YBS106 isolated from Arisaema erubescens (Wall.) Schott tissue to cotton Fusarium and Verticillium wilt was studied by measuring the change of the activities of defense enzymes (POD, PPO) and the contents of pathogenesis-related biochemicals (MDA, Vc) in cotton leaf inoculation with YBS106, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae and the control effects of strain YBS106 against to F. oxysporum and V. dahliae in pot tests. The results indicated that YBS106 effectively increased POD and PPO activities, also promoted concentration of MDA and Vc. When the F. oxysporum or V. dahliae used with YBS106, respectively, the induced activities of POD, PPO and concentration of Vc were higher than that of only used F. oxysporum or V. dahliae, but concentration of MDA were lower. The concentration of MDA and Vc peaked 5 days after the treatment while the activities of POD and PPO reached their maximum 10 days after the treatment. The relative anti-bacterial effects of strain YBS106 against to F. oxysporum and V. dahliae in pot tests when 100 day inoculated pathogen were 64.24% and 71.37%, which is related to changes consistent trend of the defense enzymes activity and related substances (MDA and Vc) content. Systemic resistance in cotton against to Fusarium ox yspor um and Verticillium dahliae could be induced by the antagonistic bacteria Serratia marcescens strain YBS106. Keywords: Endophytic Bacteria; Cotton; Fusarium oxysporum; Ve rticillium dahliae; Induced Resistanc 内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究* 管芩澜 1，林天兴 1，龚明福#1,2 1乐山师范学院生命科学学院，乐山 2峨眉山特色生物资源重点实验室，乐山 Email: 1508666836@qq.com, 182476903@qq.com, #gongmingfu98@163.com 收稿日期：2013 年2月16 日；修回日期：2013 年3月9日；录用日期：2013 年3月16 日 摘 要：本实验以从一把伞南星(Arisaema erubescens (Wall.) Schott)组织分离到的内生细菌YBS106 对三叶一心 棉苗进行灌根诱导，同时挑战接种棉花枯萎病菌或棉花黄萎病菌，测定YBS106 诱导对棉叶中抗性相关酶POD 和PPO 活性及与抗性相关的 MDA 和VC含量的影响，同时测定 YBS106 对棉花枯、黄萎病的相对防效。结果 表明，YBS106 诱导对 POD 和PPO 活性及MDA 和Vc 含量均有显著影响。YBS106能有效诱棉叶中 POD 和PPO 等防御酶活及Vc含量增加和 MDA 含量的减少，MDA 和Vc 含量在诱导后第 5天达到最高，POD 和PPO 活性 在诱导后第 10 天达到最高。病原菌挑战接种 100 天时，YBS106 对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为 64.24%和71.37%,这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质(MDA 和Vc)含量的变化趋势吻合。该结果表明 YBS106 诱导棉花产生了对棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌的系统抗性。 关键词：内生细菌；棉花；棉花枯萎病菌；棉花黄萎病菌；诱导抗性 *基金项目：乐山师范学院科研项目(编号：Z1160 和Z1223)，四川省教育厅项目(编号：12ZA240)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 16  内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究 Copyright © 2013 Hanspub 17 1. 引言 与抗病性相关的植物防御酶(如多酚氧化酶PPO、 过氧化物酶 POD 等)的变化或诱导产生是植物遭到病 原生物及逆境因子作用后维护其正常生长发育最重 要的一种生理生化防御机制[1-5]。PPO 通过催化木质素 及醌类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病 菌的侵害[4]；POD在木质素生物合成的最后一步反应 过程中催化 H2O2分解而发挥作用[5]。丙二醛(MDA) 是膜脂过氧化分解的终产物之一，植物组织中 MDA 的含量可以反映植物遭受病原生物及逆境因子伤害 的程度[6]。抗坏血酸(Vc)是植物体内的一种抗氧化剂， 可直接清除 O2−和HO，并通过抗坏血酸氧化酶使 H2O2 转化为水，当植物遭受病原生物及逆境因子伤害时， 可降低活性氧物质对植物的毒害，使植物细胞保持正 常生理功能[7]。 本课题组从一把伞南星(Arisaema erubescens (Wall.) Schott)组织中分离到一株对耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)具有高拮抗活性的内生细菌 YBS106，经鉴定 为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，该菌可以产生 活性产物抑制 MRSA 的生长。本试验通过测定 YBS106 对棉花苗体内过氧化物酶 POD、多酚氧化酶 PPO 活性及 MDA、Vc 含量的变化情况，研究其对棉 花系统抗性的诱导作用，为生防菌的开发与应用提供 理论基础。 2. 材料与方法 2.1. 试验材料 棉花新陆早 35 号和军海一号从市场购买，其中新 陆早 35 号用于枯萎病实验，军海一号用于黄萎病实 验。S. marcescens YBS106由本课题组从 A. erubescen 中分离获得，棉花枯萎病致病菌(Fus ari u m oxys por u m) 和棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Klebahn)从感病棉花植株中分离获得。 2.2. 培养基 实验中用到的培养基及配方见表 1。 2.3. 接种前的准备 挑取一环在 NA 平板上生长良好的 YBS106 接种 Table 1. The medium used in the experiment 表1. 实验中用到的培养基 培养基 NA NB PDA 牛肉膏(g) 3 3 蛋白胨(g) 10 10 NaCl(g) 5 5 琼脂(g) 20 20 水(L) 1 1 1 pH 7.0~7.2 7.0~7.2 马铃薯(g) 200 葡萄糖(g) 20 注：NA 为牛肉膏蛋白胨培养基，NB 为牛肉膏蛋白胨培养液，PDA 为马铃 薯培养基。 于NB 培养液中，30℃、200 r/min 培养 48 h，加入无 菌水稀释成浓度为 108 CFU/mL的拮抗细菌发酵液。 棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌接于PD 培养液中，25 ℃、200 r/min 培养 72 h，稀释制成106 CFU/mL 浓度 的孢子悬浮液。 2.4. 接种处理 待棉苗长至三叶一心时用 108 CFU/mL的拮抗细 菌发酵液灌根接种，2 d 后用 106 CFU/mL 浓度的病原 真菌孢子悬浮液灌根进行挑战接种，分别于挑战接种 病原真菌后第 0、5、10、15、20 天取样测定棉叶中 的过氧化物酶 POD 和多酚氧化酶PPO 的活性，同时 测定棉叶中丙二醛 MDA 和抗坏血酸(Vc)的含量。以 无菌 NB 培养液灌根为对照，每处理重复三次，每重 复100 株。各处理分别为：只接种无菌NB 培养液 (CK)、只接种(YBS106)、只接种棉花枯萎病菌(MK)、 只接种棉花黄萎病菌(MH)、接种YBS106 后挑战接种 棉花枯萎病菌(YBS106-MK)、接种YBS106 后挑战接 种棉花黄萎病菌(YBS106-MH)。 2.5. 测定指标 POD 和PPO 酶活的测定：称取棉花叶片0.1 g， 加20 mmol·L−1 KH2PO45 mL，于研钵中研磨成匀浆， 以10,000 r·min−1离心 10 min，收集上清液保存在冷 处，所得残渣再用 20 mmol·L−1 KH2PO4 5 mL提取一 次，合并两次上清液。取比色皿两只，于一只中加入 反应混合液 3 mL、KH2PO 4 5 mL 作为校零对照，另一 只中加入反应混合液 3 mL、上述酶液 1 mL(如酶活性  内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究 过高可适当稀释)，立即启动秒表，于分光光度计470 nm (PPO酶活性测定在 420 nm)波长下测量 OD 值， 每隔 30 s 读数一次，以每分钟表示酶活性大小，即以 每克鲜叶重每分钟OD470 增加 0.01 为一个 POD 酶活 性单位，以每克鲜叶重每分钟 OD420 增加 0.01 为一个 PPO 酶活性单位。 MDA 含量的测定：称取剪碎的棉花叶片1 g，加 入2 mL 10% TCA 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8 mL TCA 进一步研磨，匀浆在 4000 r·min−1离心 10 min， 上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2 mL (对照 加2 mL 蒸馏水)，加入2 mL 0.6% TBA 溶液，混匀物于 沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液 测定 532、600 和450 nm 波长下的吸光值。按公式 MDA 的浓度(umol·L−1) = 6.45(OD532 − OD600) − 0.56OD450，可 直接求得样品提取液中 MDA 的浓度，根据植物组织 的重量计算测定样品中 MDA 的含量：MDA 含量 (umol·g−1) = MDA浓度(umol·L−1) × 提取液体积(mL)/ 植物组织鲜重(g)。 Vc 含量的测定：绘制Vc 含量的校准曲线。称取 洁净棉叶100 g，加入 100 mL 浸提剂，放入组织捣碎 机中捣成匀浆。称取 10 g 浆状样品，用浸提剂将样品 移入 100 mL容量瓷中稀释至刻度，摇匀，澄清。样 液测定：移取0.5 mL 提取液，置于 10 mL 比色管中， 用2%偏磷酸稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比， 在波长 243 nm 处用1 cm石英皿测定其吸光度。待测 研处理样液测定：分别吸取0.5 mL 澄清透明提取液， 加入 6滴0.5 mol·L−1氢氧化钠溶液，置于10 mL 比色 管中混匀，在室温放置40 min 后，加入 2%偏磷酸稀 释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长 243 nm 处测定吸光度。由待测样品与待测碱处理样品的吸光 值之差查校准曲线，即可计算出样品中 Vc 的含量。 出现病株后，观察记录发病株数，植株可见明显 枯萎或黄萎症状，即记为发病株，共观察至接种病原 菌100 d。 病情严重度分级如下： 0级 = 无症状，植株健康； 1级 = 1~2片子叶局部发病； 2级 = 子叶及一片真叶局部发病; 3级 = 二片真叶发病或脱落仅剩心叶； 4级 = 植株生长点或全株枯死。 发病率、病情指数及防效计算公式如下： 发病率(%) = 病株数/调查总株数 × 100%， 病情指数 = (每个病级的植株数 × 级别数) × 100/总植株数 × 最高级别数， 相对防效(%) = (对照病情指数−处理病情指数) × 100/对照病情指数。 3. 结果与分析 3.1. YBS106诱导下棉叶中POD 活性 YBS106 诱导对棉叶中 POD活性的影响见图 1。 从图 1可知，在第 0天各处理POD 活性非常接近， 第10 天前逐渐增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理 其POD 活性均比对照要高，增幅快。只接种拮抗菌 的处理第 10天以后 POD 活性逐渐下降，第 15天以 后和对照处于相同水平。挑战接种了病原菌的 4个处 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 0510 15 20 Time(d） POD Act ivity 0.01△OD/(g.min) CK KDNB6 MK KDNB6-MK MH KDNB6-MH Figure 1. Activity of POD in cotton leaves induced by antagonistic bacteria YBS106 图1. YBS 106诱导下棉叶中 POD 活性 Copyright © 2013 Hanspub 18  内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究 理其 POD活性在第 10 天达到最高，随后下降，其中 接种了拮抗菌的2个处理比只接病原菌的 2个处理 POD 活性升高和下降的速度都要快。 3.2. YBS106诱导下棉叶中PPO 活性 YBS106 诱导对棉叶中PPO 活性的影响见图 2。 从图 2可知，在第 0天各处理 PPO活性非常接近，第 五天普遍增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理其 PPO 活性均比对照要高。只接种拮抗菌的处理第 5天以后 PPO 活性逐渐下降，第 10 天以后趋于平稳，略高于 对照。挑战接种了病原菌的 4个处理其 PPO 活性在第 10 天达到最高，随后下降，其中接种了拮抗菌的 2个 处理比只接病原菌的 2个处理 PPO 活性升高和下降的 速度都要快。 3.3. YBS106诱导下棉叶中MDA 含量 YBS106 诱导对棉叶中 MDA含量的影响见图 3。 从图 3可知，在第 0天各处理 MDA 含量近乎相同， 第五天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其 MDA 含量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其 MDA 含量波动范围不大。只挑战接种了病原菌的 2 个处理第 10 天前MDA 含量逐渐增加，10 天以后逐 渐下降，15天以后趋于平稳。接种了拮抗菌并挑战接 种病原菌的 2个处理第 5天MDA 含量达到最高，随 后逐渐下降，20 天以后其 MDA 含量降至对照水平。 3.4. YBS106诱导下棉叶中Vc 含量 YBS106 诱导对棉叶中 Vc 含量的影响见图4。从 图4可知，在第 0天各处理 Vc含量近乎相同，第五 天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其 Vc 含 量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其 Vc 含量比 较稳定，变化不大。挑战接种了病原菌的 4个处理第 5天前Vc 含量逐渐增加，然后逐渐下降，其中接种了 拮抗菌并挑战接种病原菌的2个处理 Vc 含量的上升 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0510 15 20 Time(d) PPO Act ivity 0.01 △ OD/ (g.m in) CK KDNB6 MK KDNB6-MK MH KDNB6-MH Figure 2. Activity of PPO in cotton leaves induced by antagonistic bacteria YBS106 图2. YBS106诱导下棉叶中 PPO 活性 Figure 3. Concentration of MDA in cotton leaves induced by antagonistic bacteria YBS106. 图3. YBS 106诱导下棉叶中 MDA 含量 Copyright © 2013 Hanspub 19  内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究 120 170 220 270 320 0510 1520 Time(d) Concentration of Vc (µmol/g) CK KDNB6 MK KDNB6-MK MH KDNB6 -MH Figure 4. Concentration of Vc in cotton leaves induced by antagonistic bacteria YBS106 图4. YBS 106诱导下棉叶中 Vc 含量 Table 2. The control effects of strain YBS106 against to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae in pot tests (100 d) 表2. YBS 106接种盆栽防治棉花枯黄萎病的效果(100 天) 病情指数 Desease indix 相对防效 Relative control effect (%) 平均防效 Mean control effect (%) 处理 Test 1 2 3 1 2 3 YBS106-MK 21.24 31.35 19.56 61.41 56.24 75.06 64.24 MK 82.65 87.59 94.62 YBS106-MH 14.75 41.52 15.72 78.54 52.69 82.89 71.37 MH 93.29 94.21 98.61 YBS106 0 0 0 CK 0 0 0 - - - - 和下降速度均比只接种病原菌的 2个处理要快。 3.5. YBS106接种对棉花枯黄萎病防治效果的 影响 从盆栽实验结果来看(表2)，YBS106 接种对棉花 枯黄萎病均有较好的防治效果，至接种棉花枯黄萎病 菌100 d时对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分 别为 64.24%和71.37%，但对不同病菌的防治效果存 在差异。 4. 结论与讨论 YBS106 是本课题组从一把伞南星中分离到的一 株对 MRSA具有高拮抗活性的内生细菌，经鉴定为粘 质沙雷氏菌(S. marcescens)，该菌主要通过产生活性产 物抑制 MRSA的生长。本研究结果表明，YBS106 除 了对病原性细菌有抑制作用外，还能诱导棉花产生系 统抗性，其抗菌活性范围较广。利用内生细菌的诱导 抗性，有望成为棉花枯、黄萎病生物防治的重要措施。 YBS106 虽然是从一把伞南星组织中分离获得 的，但与棉花也能形成较和谐的关系，只接种拮抗菌 对棉花各项指标影响不是很大，应该是这种和谐关系 的体现，但 YBS106 是否是通过定殖到棉花组织中起 作用，还需要通过实验加以证实。 同时接种拮抗菌 YBS106 和病原菌的处理的棉叶 中POD 和PPO 等防御酶活及Vc 含量增加和减少的 速度比只接种病原菌的要快，在最高点时均高于只接 种病原菌的处理棉叶，而MDA 含量趋势刚好相反， 这一结果与刘永锋等[2]用YD4-6 和NV11-4 菌株诱导 水稻防御性相关酶活性变化趋势一致。该结果表明 YBS106 诱导后POD 、PPO 等防御酶及 Vc 等物质对 Copyright © 2013 Hanspub 20  内生细菌 YBS106 对棉花的诱导抗性研究 诱导抗性起重要作用，大大提高了棉花对病原菌的抗 性，这种抗性的提高能够通过MDA 含量的变化反应 出来。YBS106 接种对棉花枯萎病菌和黄萎病菌均有 较好的防治效果，这与棉花系统抗性相关的防御酶活 及相关物质(MDA 和Vc)含量的变化趋势吻合，这也 说明 YBS106 接种诱导棉花产生了系统抗性。 参考文献 (References) [1] A. L. John. Plant immuneisation; From myth to SAR. Pesticide Science,1999, 55: 193-196. [2] 刘永锋, 李美荣, 陈志谊, 于俊杰, 刘邮洲, 聂亚锋, 罗楚 平. YD4-6 和NV11-4 菌株抑菌活性及诱导水稻防御性相关酶活 性变化[J]. 微生物学通报, 2010, 37(12): 1753-1759. [3] L. Sticher, B. Mauchmani and J. P. Betraux. Systemic acquired resistance. Annual Review of Phytopathology, 1997, 35: 235- 270. [4] S. Schneider, W. UIMch. Differential induction of resistance and enhanced enzyme activities in cucumber an d tobacco caused by treatment with various abiotic and biotic inducers. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1994, 45: 291- 304. [5] F. B. Abeles, C. L. Biles. Characterization of peroxidases in lignifying peach fruit endocarp. Plant Physiology, 1991, 95(1): 269-273. [6] 肖永森, 王正直, 郭百川. 百叶枯病菌对杂交稻幼苗叶片中 活性氧清除剂的影响[J]. 作物学报, 1998, 24(1): 118-122. [7] 来玉宾. 茶树内生细菌 TL2 分离鉴定及抗病机理的研究[D]. 福建农林大学硕士学位论文, 2006. Copyright © 2013 Hanspub 21 |