Advance in Microbiology 微生物前沿, 2013, 2, 22-27 http://dx.doi.org/10.12677/amb.2013.21005 Published Online March 2013 (http://www.hanspub.org/journal/amb.html) Optimization of Fermentation Conditions for Endophytic Bacteria Strains YBS106* Qinlan Guan1, T i anxi ng Lin1, Mingfu Gong#1,2 1School of Life Sciences, Leshan Normal Uuniversity, Leshan 2Key Laboratory of Special Biological Resources in Mountain Emei, Leshan Email: 1508666836@qq.com, 182476903@qq.com, #gongmingfu98@163.com Received: Feb. 20th, 2013; revised: Mar. 12th, 2013; accepted: Mar. 19th, 2013 Abstract: To optimize the culture medium and the fermentation conditions, experiment was performed to the fermenta- tion conditions of endophytic bacterium YBS106 isolated from Arisaema erubescens in Emei Mount. The antifungal activity of YBS106 fermenting borth was determined against Fusarium oxysporum with Cylinder plate method, and studied on the activity of metabolic products of strains under different culture medium and growth condition. Results showed that the optimal medium compositions were (g/1000mL): glucose 60 g, ammonium sulfate 2.5 g, bran 25 g, Trisodium citrate 2.0 g, K2HPO4·3H2O 0.2 g, FeSO4·7H2O 0.05 g, MgSO4·7H2O 1.0 g. The optimal growth conditions were: pH 6.0, 28˚C, 4% inoculation, fermentation time for 72 h with 200 r/min rotating speed. The inhibitory ratio of YBS106 fermenting solution against Fusa rium oxysporu m could reach to 56% under optimum fermenting solution and culture conditions. Keywords: Endophytic Bacteria; Fusarium oxysporum; Fermentation Condition; Bacteriostasis 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化* 管芩澜 1,林天兴 1,龚明福 1,2# 1乐山师范学院生命科学学院,乐山 2峨眉山特色生物资源重点实验室,乐山 Email: 1508666836@qq.com, 182476903@qq.com, #gongmingfu98@163.com 收稿日期:2013 年2月20 日;修回日期:2013 年3月12 日;录用日期:2013 年3月19 日 摘 要:对一把伞南星内生细菌 YBS106发酵条件进行研究,确定其最佳发酵液培养基配方和最佳发酵条件。 通过杯碟法测定 YBS106 发酵液对棉花枯萎病原菌的抑菌作用,研究了该菌株在不同培养基,不同生长条件下 的代谢产物活性。菌株 YBS106的最佳培养基为:葡萄糖 60 g/L,硫酸铵 2.5 g/L,麸皮 25 g/L,柠檬酸三钠2.0 g/L,K2HPO4·3H2O 0.2 g/L,FeSO4·7H2O 0.05 g/L,MgSO 4·7H2O 1.0 g/L。最佳生长条件为:pH7.0,28℃,发酵 72 h,接种量 4%,揺床转速为 200 r/min。在最佳培养条件下,该菌株对棉花枯萎病菌的抑菌率可达 56%。 关键词:内生细菌;棉花枯萎病;发酵条件;抑菌 1. 引言 棉花枯萎病(Fusarium oxysporum)是一种由棉花 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum)引 起的、具有毁灭性的土传棉花病害,在外界环境条件 有利于枯萎病发生的情况下可引起棉花大幅度减产 [1]。通过生物防治方法减少或抑制土壤中病菌接种体 数量或致病活性,在小麦全蚀病等土传病害防治中已 有成功报道[2]。利用生防措施来控制棉花枯萎病为广 大科研工作者所期望,但目前为止尚缺乏高效稳定的 *基金项目:乐山师范学院科研项目(编号:Z1160 和Z1223),四川 省教育厅项目(编号:12ZA240)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 22 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化 生防菌株。内生细菌是一类生长在植物组织细胞间隙 的微生物,其中部分内生菌能够产生与宿主相关的活 性成分,是生防微生物的重要来源。 本课题组从一把伞南星(Arisaema erubescens (Wall.) Schott)组织中分离到一株对耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)和F. oxysporium具有高拮抗活性的内生细菌 YBS106, 同时也能诱导棉花产生系统抗性。 对微生物发酵工艺的优化主要包括初始条件的 选择,培养基的组成配比及培养条件的优化几个方面 [3]。本研究旨在对棉花枯萎病菌有拮抗作用的内生细 菌YBS106 的发酵工艺条件进行优化,以期为棉花枯 萎病的防治提供新的方法和途径。 2. 材料与方法 2.1. 试验材料 S. marcescens YBS106 由本课题组从 A. erubescen 中分离获得, 棉花枯萎病致病菌(F. oxysporum)从感病 棉花植株中分离获得。 2.2. 培养基 实验中用到的培养基及配方见表 1。 Table 1. The medium used in the experiment (Reference in Research Methods in Plant Pathology [4]) 表1. 实验中用到的培养基(参考《植病研究法》[4]) 培养基 NA NB GAS PDA 牛肉膏(g) 3 3 蛋白胨(g) 10 10 NaCl(g) 5 5 琼脂(g) 20 20 水(L) 1 1 1 1 pH 7.0~7.2 7.0~7.2 7.0~7.2 马铃薯(g) 200 葡萄糖(g) 2 20 硫酸铵(g) 1 K2HPO4·3H2O (g) 7 KH2PO4·H2O (g) 3 MgSO4·7H2O (g) 0.1 柠檬酸三钠(g) 0.5 注:NA 为牛肉膏蛋白胨培养基,NB 为牛肉膏蛋白胨培养液,GAS为葡萄 糖铵盐培养基,PDA 为马铃薯培养基。 2.3. 菌种培养方法及拮抗活性测定 拮抗细菌的发酵培养:先将保存在斜面上的菌种 接入 NA 培养基平板表面进行活化,然后将其接入到 装有 100 mL作为种子培养基的 500 mL 三角瓶中,在 30℃、转速为 180 r/min 条件下培养72 h,再将然后将 种子液按 1%的接种量转接到 10个装有 100 mLNB培 养基的 500 mL 三角瓶中,以 200 r/min 的转速振荡培 养72 h。 病原菌平板的制备:用打孔器从培养5 d的棉花 枯萎病菌平板上打成直径 0.8 mm的菌饼,接到 PDA 培 养的平板上,28℃恒温箱培养48 h。 抑菌活性的测定:采用标准杯碟法[4]测定拮抗菌 的抑菌率。将培养 48 h的长有棉花枯萎病菌的PDA 平板上放置牛津杯,向其中加入 200 μL细菌发酵液, 静置 30 min 后,置于 24℃恒温箱培养,2 d 后观察抑 菌结果。用直尺测量棉花枯萎病原菌直径,以自然生 长的枯萎病原菌为对照,按照两者比例的大小来比较 抑菌活性的大小:内生细菌对棉花枯萎病菌的相对抑 菌率计算如下: 100% 相对抑菌率 对照组病原真菌直径 试验组病原真菌直径 对照组病原真菌直径 方法参照龚明福[5]的方法进行。 2.4. 生长曲线的测定及接种量、最佳发酵时间的 优化 生长曲线的测定:用比浊法[6]测出最佳检测波长, 结果显示在 540 nm有最大吸收。准确吸取培养 24 h 的YBS106 培养液 5 mL,注入到含有 100 mL 种子培 养基的 500 mL 三角瓶中,振荡并充分摇匀,每隔 2 h 取少许发酵液,并用无菌水稀释 10 倍,用分光光度 计测量其光密度值 OD540,方法参照周德庆[7]的方法 进行。以培养时间为横坐标,OD540 值为纵坐标,绘 制生长曲线。 最佳接种量的选择:将接种量(体积分数)分别调 节为 1%、2%、4%、5%、6%、8%,分别接入到液体 葡萄糖铵盐培养基中进行培养 1 d,再用杯碟法测定 发酵液抑菌率。 最佳发酵时间的优化:将YBS106 菌悬液以 2% 接种量接种到液体葡萄糖铵盐培养基中,在 pH 为7.0, Copyright © 2013 Hanspub 23 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化 28℃,条件下培养,每隔 12 h取样再用杯碟法测定发 酵液抑菌率[8]。 2.5. 发酵培养基的优化 碳源和氮源的筛选:参照葡萄糖铵盐培养基,分别 采用不同的碳源(包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉) 和氮源(包括硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、尿素),固定 其他成分,在30℃和 180 r/min条件下进行摇瓶培养 72 h,然后接入到装有牛津杯的长有棉花枯萎病菌的 平板中,24 h 后测定抑菌率,每次处理设 3个平行。 测出抑菌率,筛选出合适的碳源和氮源。 碳源和氮源的优化:筛选出最佳碳、氮源后,参 照葡萄糖铵盐培养基,固定其他成分,用最佳碳、氮 源代替相应碳、氮源,然后用正交设计试验[9],采用 L9(34)正交表,选用 3因素 3水平,进行摇瓶培养, 通过比较抑菌率来确定筛选出 的碳源 (A) 、氮源(B)和 补充氮源–麸皮(C)的用量(表2),每次处理设 3个重复 样。麸皮的用法是加入适量水煮沸 1 h 后过滤取浸汁。 无机盐成分的优化:在优化好碳源和氮源的基础 上,参照葡萄糖铵盐培养基,固定其他成分,用无机 盐C6H5Na3O7·2H2O(a),K2HPO4·3H2O(b),FeSO4·7H2O (c),MgSO4·7H2O(d)代替相应无机盐,然后用正交设 计试验[9],采用 L9(34)正交表,进行摇瓶培养,每次 处理设 3个重复样(表3)。 2.6. 最佳培养条件筛选 用正交试验优化好的培养基配方培养YBS106, 再分别进行温度、培养基初始 pH 、和摇床转速单 因 素试验[10]。采用标准杯碟法测定拮抗菌的抑菌活性, 在培养 48 h的长有棉花枯萎病菌的PDA 平板上放置 牛津杯,向其中加入 200 μL细菌发酵液,静置 30 min 后,置于24℃恒温箱培养,2 d后观察抑菌结果。 初始 Ph[11]:将菌液注入到接有棉花枯萎病原菌的 Table 2. Orthogonal test factor levels for optimizing carbon and nitrogen sources in culture media 表2. 培养基碳源和氮源优化的正交试验因素水平 Level A(葡萄糖) /g·L−1 B(硫酸铵) /g·L−1 C(麸皮) /g·L−1 1 5 2.5 5 2 10 5 10 3 20 10 20 Table 3. Orthogonal test factor levels for optimizing inorganic salt commponent s in culture media 表3. 培养基无机盐成分优化的正交试验因素水平 Level A′(C6H5Na3O · 7 2H2O)/g·L−1 B′(K2HPO · 4 3H2O)/g·L−1 C′(FeSO4· 7H2O)/g·L−1 D′(MgSO4· 7H2O)/g·L−1 1 0.5 0.1 0.05 0.25 2 1.0 0.2 0.1 0.5 3 1.5 0.3 0.2 1.0 PDA 培养基牛津杯中,于 pH 为5.0、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、9.0 下培养 48 h,每个梯度设三个重复,观 察菌株生长情况,测出抑菌率。 温度[11]:将菌液注入到接有棉花枯萎病原菌的 PDA 培养基牛津杯中,在最适 pH 下分别置于 20℃、 25℃、28℃、32℃、37℃、42℃下恒温培养72 h,每 个温度设三个重复,观察菌株的生长情况,并测定发 酵液抑菌率。 摇床转速[11]:将菌液注入到接有棉花枯萎病原菌 的PDA 培养基牛津杯中,在最适 pH、最适温度下分 别置于摇床转速分别为120、150、180 、210、240 r·min−1,进行培养,观察菌株的生长情况,并测定发 酵液抑菌率,每个梯度设三个重复,观察菌株生长情 况,测出抑菌率。 待测出菌株生长最适摇床转速范围后,再在此范 围内测出最佳转速,每个转速设三个重复,观察菌株 的生长情况,并测定发酵液抑菌率。 3. 结果与分析 3.1. 初始条件的选择 拮抗细菌 YBS106 菌株的生长曲线较明显地分为 以下四个阶段:调整期、对数生长期、稳定期、衰亡 期。3~15 h 的种子培养液正处于对数生长期,这时菌 体生长速率最快,最适于作为种子液,其中最适宜作 为接种用种子液为 12~15 h的发酵液。 接种量:不同接种量(体积分数)的发酵液抑菌活 性结果如图 1所示。YBS106 发酵液接种量对抑菌活 性有一定影响,随着接种量的增加,抑菌活性先提高, 接种量达到 4%以后逐渐趋于平稳,因此生产上接种 量为 4%是最为经济有效的。 培养时间:YBS106 菌株在发酵培养基中培养时 间对发酵液的抑菌活性有影响,随着培养时间的延 长,发酵液的抑菌活性增强,发酵72 h 后抑菌活性趋 Copyright © 2013 Hanspub 24 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化 0 5 10 15 20 25 30 35 4 0 1% 2% 4%5% 6% 8% 接种量 抑菌率(%) Figure 1. Effect of inoculation rate on antibacterial activity of strain YBS106 fermentation broth 图1. 接种量对 YBS106 菌株发酵液抑菌活性的影响 于平稳(如图 2所示),因此从经济的角度考虑,生产 上的发酵时间应为 72 h。 3.2. 发酵培养基的优化 培养基碳源和氮源单因子的筛选:从表 4看出, 在这 4种碳源中,该菌最易利用葡萄糖,蔗糖其次, 而对麦芽糖和淀粉的利用效果较差。从表 5看出,硫 酸铵作为氮源利用效果最好,其次是硝酸铵,硝酸钠 效果次之,尿素作为氮源的利用效果较差。因此,适 宜选择葡萄糖、硫酸铵作为该菌培养基的碳氮源。 碳氮源优化的正交试验结果统计培养基碳氮源 优化的结果见表 6,从表 6可以看出,葡萄糖、硫酸 铵和麸皮的用量对菌株 YBS106的生长均产生一定的 影响,从极差的大小来看,以上三因子作用的顺序为 葡萄糖,麸皮,硫酸铵。以菌株 YBS106 对棉花枯萎 病抑菌率作为评价指标,最终以 A2B2C3 为最佳配比, 即葡萄糖10 g/L,硫酸铵 5 g/L,麸皮 20 g/L。 无机盐成分的优化:培养基中各种无机盐成分优化的 正交试验结果见表 7。培养基中无机盐的用量对菌株 YBS106 的生长均产生一定影响,从极差R'来看,无 机盐作用的主次顺序都是 A' > B' > C' > D',即 C6H5Na3O7·2H2O对该菌增殖的影响最为显著,其次 是K2HPO4·3H2O,而FeSO4·7H2O和MgSO4·7H2O的影 响相对较小。以菌株 YBS106 对棉花枯萎病抑菌率作 为评价指标,最终选取第 6号因素水平 A'3B'2C'1D'3, 即C6H5Na3O7·2H2O 2.0 g/L,K2HPO4·3H2O 0.2 g/L, FeSO4·7H2O 0.05 g/L,Mg SO4·7 H2O 1.0 g/L,为培养 基中无机盐成分的最佳组合。 3.3. 最佳培养条件的优化 0 5 10 15 20 25 30 35 4 0 12 2436 4860 72 8496108 时间(h) 抑菌率(%) Figure 2. Effect of fermentation time on antibacterial activ of Tablvity Carbon source ity strain YBS106 fermentation broth 图2. 发酵时间对 YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 e 4. Effect of different carton sources on antibacterial acti of strain YBS106 entation broth 表4. 不同碳源对 YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 ferm Gloose Mae Corn starchltose Sucros Bacteriostatic effect 0.38 ± aA 0.01 0.35 ± bB 0.02 24.50 ± aA 0.02 20.33 ± bB 0.01 注: 后不同平上有 同大 示 在0.1 水平上有差异。 different nitces on antibacterial 4NO3 NaNO3 CO(NH2)2 同列数字小写字母表示在0.5水差异;不 写字母表 Table 5. Effect of rogen sour activity of strain YBS106 fermentation broth 表5. 不同氮源对 YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 NH Bacterstatic 0.30 ± aA 0. io effect 0.01 0.24 ± 0. abAB 04 0.17 ± bcAB 01 0.12 ± cB 0.02 istcal Tarthogonal te statand evaluation resultr Factor level ble 6. Ostis fo optimizing carbon and nit rogen sources in culture media 表6. 培养基碳源和氮源优化的正交试验评价结果 Number A B ercentage of inhibition C P zone 1 1 1 1 18.70% 2 1 2 2 20.70% 3 1 3 3 29.80% 4 2 1 2 24.27% 5 2 2 3 34.30% 6 2 3 1 26.80% 7 3 1 3 27.80% 8 3 2 1 24.27% 9 3 3 2 30.80% K1 0.6920 0.0.7707 6977 K2 0.8537 0.7927 0.7577 K3 0.8287 0.8740 0.9190 R 0.1617 0.1033 0.1613 培养基初始 pH:pH是影响菌株 YBS106 生长的 Copyright © 2013 Hanspub 25 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化 T 7. Oal letimizing inoganic salt omt s imedia able rthogon ctest factor mponen vels for op n culture r 表7. 培养基无机盐成分优化的正交试验因素水平 Factor level Number A' B' Percentage of inhibition zone C' D' 1 1 1 1 1 0.095 2 1 2 2 2 0.119 3 1 3 3 3 0.184 4 2 1 2 3 0.217 5 2 2 3 1 0.307 6 2 3 1 2 0.336 7 3 1 3 2 0.286 8 3 2 1 3 0.224 9 3 3 2 1 0.3153 K1' 0.0. 398 0.592 0.655 7173 K2' 0.86 0.65 0.65130.741 K3' 0.82530.8353 0.777 0.625 R' 0.462 0.2433 0.12570.116 要因素,在一定的初始 pH范围内,随着 pH 的上 生长的重 要因 床转速分别调整为 120、150、180、 210、 发酵条件 为: 重 升, 抑菌活性逐渐增强,在 pH 在6.5~7.5 之间生长良 好,当 pH达到 7.0 附近时活性最高,之后随着 pH上 升,活性开始下降(如图3所示)。说明中性培养基条 件有利于YBS106 菌株代谢产物的产生。 养温度:培养温度是影响菌株YBS106 素,随着温度的上升,抑菌活性逐渐提高,到 28 ℃附近时抑菌活性最高,之后随着温度的升高,抑菌 活性逐渐降低(见图 4)。说明 28℃左右最适合抑菌活 性物质产生。 转速:将摇 240 r·min−1,进行培养并测定发酵液抑菌活性, 结果揺床转数为210 r/min 左右时,抑菌活性相对较高 (如图 5所示)。将摇床转速再分别调整为190、200、 210、220、230 r/min,从 图6可知,当摇床转速为 200 r/min 时,抑菌活性较高。这可能是由于液体培养需要 大量氧气来满足抗菌活性物质产生的需要,揺床转速 提高导致溶氧浓度增大,代谢能力提高。 从以上得出的最佳培养基配方和最佳 葡萄糖 60 g/L,硫酸铵 2.5 g/L,麸皮 25 g/L,柠 檬酸三钠2.0 g/L,K2HPO4·3H2O 0.2 g/L,FeSO4·7H2O 0 10 20 30 40 50 56 6.57 7.589 p H 抑菌率(%) Figure 3. Effect of pH in initial culture medium on antibacterial activity of strain YBS106 fermentation broth 图3. pH对YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 0 10 20 30 40 50 20℃25℃28℃32℃37℃42℃ T 抑菌率(%) Figure 4. Effect of culture temperature on antibacterial activity of strain YBS106 fermentation broth 图4. 培养温度对 YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 0 10 20 30 40 50 120 150 180210 240 转速(r/ m) 抑菌率(%) Figure 5. Effect of rotation speed on antibacterial activity of strain YBS106 fermentation broth 图5. 摇床转速对 YBS106菌株发酵液抑菌活性的影响 0 10 20 30 40 50 60 190 200 210220230 转速(r/m) 抑菌率(%) Figure 6. Effect of rotation speed on antibacterial activity of strain YBS106 fermentation broth 图6. 摇床转速对 YBS 菌株发酵液抑菌活性的影响 Copyright © 2013 Hanspub 26 内生细菌 YBS106 菌株发酵条件优化 Copyright © 2013 Hanspub 27 0.05 g/4℃左 4. 结论与讨论 本研究选取抑菌效果较好的YBS106 作为实验菌 株对抗菌 条 下 2 4 4 2 L,MgSO ·7H2O 1.0 g/L,初始 pH 7.0,28 右,发酵72 h,接种量4%,揺床转速为200 r/min。 在此条件下测试对抑菌活性的影响,抑菌率为 56%。 物质产生条件进行了初步摸索。通过对该菌 生长曲线的研究表明,12~15 h的种子培养基正处于 对数生长期,最适于做种子液。并且通过对培养基、 发酵时间及发酵温度几个条件的研究发现,YBS106 在培养基中 28℃摇床恒温培养48 h 后抑菌效果最好。 另外通过对培养基的初始pH进行调节发现,培养基 的初始 pH 也会对抑菌效果产生重要影响。初始 pH 在中性 件 抑菌效果最好,强酸强碱都会导致抑菌 效果的下降。综合研究结果来看,菌株 YBS106 的最 佳培养基为:葡萄糖 60 g/L,硫酸铵 2.5 g/L,麸 皮25 g/L,柠檬酸三钠 2.0 g/L,KHPO·3H2O 0.2 g/L, FeSO·7H O 0.05 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,水 1000 mL。最佳生长条件为:pH 7.0,28℃,发酵 72 h,接 种量 4%,揺床转速为200 r/min。这一结果以期为菌 株YBS106 的开发利用奠定基础。 参考文献 (References) [1] 沈其益. 棉花病害基础研究与防治[M]. 北京: 科学出版社, 1992. [2] 张颖, 王刚, 郭建伟等 . 利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病 的初步研究[J]. 植物病理学报, 2007, 37(1): 105-108. [3] 俞俊棠, 唐孝宣. 生物工艺学(上册)[M]. 上海: 华东化工学 院出版社, 1991: 96-99. 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