 Botanical Research 植物学研究, 2013, 2, 62-66 http://dx.doi.org/10.12677/br.2013.22011 Published Online April 2013 (http://www.hanspub.org/journal/br.html) Establishment and Optimization of SRAP-PCR and Preliminarily Analysis of Genomes in Carthamus tinctorius L.* Lei Jiang1, Yanjin Li, Benwen Liu1, T ingting Tang1, Hong Liu1, Xingchu Yan2, Rui Qin1, Gang Li1# 1Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China, South-Central University for Nationalities, Wuhan 2Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan Email: whitejoker@vip.qq.com, #lg863@yahoo.com.cn Received: Jan. 25th, 2013; revised: Feb. 10th, 2013; accepted: Feb. 20th, 2013 Copyright © 2013 Lei Jiang et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Safflower is a traditional medicinal plant, and also a new kind of oil economic crops. In this paper, the SRAP technology was used to analysis 11 safflower varieties. A SRAP-DNA PCR amplification system was established and optimized. The reaction mixture system was decreased from 25 μL to 10 μL, which con- tained: Taq DNA polymerase 0.04 u/μL, dNTP 0.20 mM, primers 0.3 mM, MgCl2 2.0 mM, genomic DNA template 20 ng. In order to test the stability of SRAP-PCR system, the PCR amplification and polyacrylamide gel electrophoresis were used to analyse 11 safflower varieties with 35 primer pairs. 25 pairs of primers com- bination with polymorphism bands and 308 clear bands were obtained, 35 percent (109/308) bands were po- lymorphic. Therefore, the SRAP molecular marker system for safflower variety assessment was reliable. This research had put the foundation for genetic diversity research and molecular marker-assisted breeding of saf- flower. Keywords: Safflower; SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism); Genome 红花(Carthamus tinctorius L.)SRAP反应体系建立与优化 及对 11 个红花品种基因组的初步分析* 江 磊1，李彦锦 1，刘本文 1，唐婷婷 1，刘 虹1，严兴初2，覃 瑞1，李 刚1# 1中南民族大学南方少数民族地区生物资源保护与综合利用工程中心，武汉 2中国农业科学学院油料作物研究所，武汉 Email: whitejoker@vip.qq.com, #lg863@yahoo.com.cn 收稿日期：2013 年1月25 日；修回日期：2013 年2月10 日；录用日期：2013 年2月20 日 摘 要：红花既是传统药用植物，也是一种新型油料经济作物。本研究利用 SRAP 技术对来源于不同 地区的 11 个红花品种进行了条带分析。建立了红花种内SRAP-DNA 的PCR 扩增体系并进行了优化， 进一步将最佳反应体系由 25 μL减至 10 μL，体系包括：Taq 酶浓度0.04 u/μL，dNTP浓度为0.2 mM， 正反引物浓度为0.3 mM，Mg2+浓度为 2.0 mM，DNA 模板为 20 ng。为检测该优化体系的稳定性，选 用了 35 对引物组合对 11 个分布于我国不同区域的红花品种进行PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛 选出 25 对具有多态性条带的引物组合，获得了 308条清晰的条带，其中 109 条具有多态性，比率为 35%，说明用 SRAP分子标记对于红花种内不同品种资源系统评估是完全可行的。红花 SRAP 反应体 *基金项目：武陵山区原生态农副产品研发技术服务项目(HZY11043)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 62  红花(Carthamus tinctorius L.)SRAP 反应体系建立与优化及对 11 个红花品种基因组的初步分析 Copyright © 2013 Hanspub 63 系的建立为深入评价红花的遗传多样性、分子辅助育种等研究奠定了基础。 关键词：红花；SRAP(序列扩增多态性)；基因组 1. 引言 红花(Carthamus tinctorius L.)为菊科红花属 1~2 年生植物，又名红蓝花、草红花、杜红花、刺红花等， 具食用、药用、染料和饲料等广泛用途，喜温暖干燥 气候，有较强的抗旱、抗寒、耐盐能力，不耐涝。原 产埃及，现多栽培于中亚、西南亚及地中海地区。我 国红花栽培历史悠久，早在汉代就有关于红花栽培和 药用的记载[1]。红花是具有巨大开发潜力的经济作物， 红花籽油是高端食用油，号称“亚油酸之王”，长期 服用有明显的降血压、降血脂等功效。目前我国红花 种植主要集中在新疆、云南，河南、安徽等省份[2]。 近年来，由于红花的各种功效不断被发掘，红花的种 植面积也不断扩大，影响红花品质的主要因素集中在 花和籽的产量、红花籽的含油率以及无刺和抗倒伏等 方面。 SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism) 是Li 等(2001)[3]在芸薹作物中建立并开发的一种新型 分子标记技术。该技术利用正反引物检测开放阅读框 (ORFs)区域，正向引物长为 17 bp，5’端开始前10 bp 是一段填充序列，无任何特异性组成，接着是特异性 序列 CCGG，随后的 3个碱基为选择性碱基，正向引 物对外显子区域进行扩增，反向引物的组成与正向引 物类似，区别在于反向引物长 18 bp，填充序列长为 11 bp，接着是特异序列AATT，3’端为 3个bp 的选择 性碱基，反向引物对内含子区域和启动子区域进行扩 增，在未知基因组序列的情况下对基因组进行 PCR 扩增。该标记相比 RAPD、AFLP、SSR等常规分子标 记而言，克服了成本高、技术繁杂以及 RAPD 的重复 性差、SSR 引物设计需要预先知道序列信息的缺点， 具有简便、中产率、高共显性、易于分离条带及测序、 在基因组中分布均匀的优点[4]。目前已经在棉花[5,6]、 马铃薯[7]、辣 椒 [8]、黄 瓜 [9]、油 菜[10]、烟 草 [11]、小 麦 [12]、 水稻[13]等植物研究中得到越来越多的应用，并广泛应 用于图谱构建、基因定位、遗传多样性以及比较基因 组学等方面的研究。目前，国内对红花的研究主要集 中于红花品种资源搜集以及某些品种的选育工作 [14-17]，也有部分利用分子标记对红花进行初步分析的 研究[18,19]，关于红花的系统研究报道非常有限。鉴于 此，本文拟建立并优化SRAP 红花分析反应体系，对 11 个红花品种进行扩增，将产物进行聚丙烯酰胺凝胶 检测，测试扩增产物多态性与稳定性。 2. 材料与方法 2.1. 材料 本研究采用的红花材料种植于中南民族大学温 室，红花材料产地见表 1。苗期采取嫩叶，洗净并用 吸水纸吸干，直接用于DNA 提取或−80℃冰箱保存。 Taq 酶与 buffer 均购自 Fermentas公司，dNTP 购自罗氏公司，引物为北京六合华大基因武汉分公 司合成。 2.2. DNA的提取 采用 CTAB 微量法提取红花全基因组 DNA。具 体步骤如下：取红花嫩叶 1.0 g，液氮研磨成粉末转入 1.5 mL离心管中；加入 12%CTAB，65℃水浴 1 h；加 入等体积氯仿/异戊醇(24/1)，振荡混匀 20 min；在室 温下用 8000 rpm 的速度离心 20 min，取上清；再次加 入等体积氯仿/异戊醇(24/1)抽提，振荡 20 min，室温 下8000 rpm 离心 20 min，取上清液；加入 2/3 体积异 丙醇，混匀，室温下 8000 rpm 离心 10 min，去上清； 用500 μL 75%乙醇冲洗沉淀，8000 rpm 室温 10 min， 去上清，充分干燥；加入 200 μL TE溶解，−20℃保存 Table 1. The varities and original field of safflower 表1. 红花种名与产地 编号 红花种名 产地 编号 种名 产地 1 库车无刺 新疆 2 西昌红花 四川 3 南涧红花 云南 4 芮城红花 山西 5 西安红花 陕西 6 巨野无刺 山东 7 南溪红花 四川 8 巨野红花 山东 9 启东红花 江苏 10 鄢陵红花 河南 11 云红三号 云南  红花(Carthamus tinctorius L.)SRAP 反应体系建立与优化及对 11 个红花品种基因组的初步分析 备用。 2.3. 红花 DNA-SRAP PCR扩增体系设计 2.3.1. 引物的选择 引物序列合成见表 2。 2.3.2. SR AP扩增程序 根据 Li 和Qμiros[3]的标准 PCR并略做修改：94℃ 预变性 5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃ 延伸 1.5 min，循环 5次；94℃变性1 min，49℃复性 1 min，72℃延伸1.5 min，循环 35 次；72℃延伸 10 min； 4℃保存。 2.3.3. SR AP-PCR扩增体系的设计 扩增反应总体系设计为10 μL，其中设计 Taq 酶 浓度(0.2 u、0.4 u、0.6 u)，dNTP浓度(0.1 mM、0.2 mM、 0.3 mM)，引物浓度(0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM)三因 素三水平共 27次的梯度实验(见表 3)，Mg2+浓度(0.5 mM、0.8 mM、1.1 mM、1.4 mM、1.7 mM、2.0 mM、 2.3 mM、2.6 mM、2.9 mM、3.2 mM)单因素十个水平 的梯度实验。 3. 结果与分析 本研究采用 CTAB 微量法提取红花基因组DNA， Table 2. The sequence of the SRAP primer 表2. SRAP引物序列 上游引物 序列 下游引物 序列 Me1 TGA GTCCAAA CCGG AAA Em1 GACTGCGTACG AA TT AAT Me2 TGA GTCCAAA CCGG AAT Em2 GACTGCGTACG AA TT AAC Me3 TGA GTCCAAA CCGG AAC Em3 GACTGCGTACG AA TT ATG Me4 TGA GTCCAAA CCGG AAG Em4 GACTGCGTACG AA TT ACG Me5 TGA GTCCAAA CCGG ATA Em5 GACTGCGTACG AA TT AGC Em6 GACTGCGTACG AA TT TAG Em7 GACTGCGTACG AA TT TGA Table 3. The reaction concentrations of the Taq DNA polymerase, dNTPs and primers 表3. Taq酶、dNTPs 和引物浓度 编号 Taq酶(u/μL) dNTPs(mM) 引物(mM) 编号 Taq酶(u/μL) dNTPs(mM) 引物(mM) 1 0.02 0.1 0.3 15 0.04 0.2 0.4 2 0.02 0.1 0.35 16 0.04 0.3 0.3 3 0.02 0.1 0.4 17 0.04 0.3 0.35 4 0.02 0.2 0.3 18 0.04 0.3 0.4 5 0.02 0.2 0.35 19 0.06 0.1 0.3 6 0.02 0.2 0.4 20 0.06 0.1 0.35 7 0.02 0.3 0.3 21 0.06 0.1 0.4 8 0.02 0.3 0.35 22 0.06 0.2 0.3 9 0.02 0.3 0.4 23 0.06 0.2 0.35 10 0.04 0.1 0.3 24 0.06 0.2 0.4 11 0.04 0.1 0.35 25 0.06 0.3 0.3 12 0.04 0.1 0.4 26 0.06 0.3 0.35 13 0.04 0.2 0.3 27 0.06 0.3 0.4 14 0.04 0.2 0.35 Copyright © 2013 Hanspub 64  红花(Carthamus tinctorius L.)SRAP 反应体系建立与优化及对 11 个红花品种基因组的初步分析 提取的产物足以满足 SRAP 反应的要求。参考已报道 文献[20]，在实验中反应体系中加入模板DNA 20 ng。 根据表 3进行Taq 酶、dNTPs、引物三因素浓度 反应，扩增产物经琼脂糖检测。据图 1结果表明，Taq 酶浓度对扩增产物清晰度影响较大，当Taq 酶浓度为 0.02 u/μL时扩增产物条带较弱。引物浓度在0.3~0.4 mM 范围内，并未产生引物二聚体，浓度大小对产物 条带影响不大。dNTPs作为合成产物的原料需要足量 来满足扩增反应的要求，因此取 dNTPs 浓度为 0.2 mM。 因此根据产物稳定性及经济性原则，选择图 1第 13 号泳道，确定Taq 酶浓度为：0.04 u/μL，dNTP浓 度为：0.2 mM，引物浓度为：0.3 mM。 本研究对Mg2+浓度进行了十个水平的梯度实验， 并将扩增产物进行琼脂糖凝胶检测。从图 2中可以看 出当 Mg2+浓度在 0.5 mM时条带微弱，而在浓度 > 2.6 mM 时条带会减弱。在1.5 mM~2.6 mM 的范围内，扩 增无明显差异，因此将Mg2+浓度取 2.0 mM。 利用优化后的体系，对 11个红花品种进行SRAP M为maker：DL2000，从上至下分别为 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 Figure 1. The reaction concentrations of the Taq DNA polymerase, dNTPs, and primers 图1. Taq酶、dNTP、引物三因素浓度对反应的影响 1~10 分别代表 Mg2+浓度为 0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0、2.3、 2.6、2.9、3.2 (mM)，M为maker ：DL2000，从上至下分别为 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。 Figure 2. Effect of Mg2+ concentration to the SRAP reaction 图2. Mg2+对SRAP-PCR 反应的影响 反应，扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。图 3结 果显示，优化体系扩增的效果比较理想，谱带清晰， 多态性较好，主带明显。重复试验，进行稳定性检测。 重复性较好，表明该体系适用于红花DNA-SRAP 反 应。运用本体系，选用35 对引物组合进行 PCR扩增 和聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出25 对具有多态性条 带的引物组合，获得了 308 条清晰的条带，其中 109 条具有多态性，比率为35%(结果未列出)。 4. 讨论 在SRAP 反应中想获得稳定、清晰的扩增产物， 则对模板的质量与纯度要求很高。DNA 的提取过程中 要尽量去除蛋白质、RN A、多糖、色素和一些小分子 物质[21]。在 SRAP-PCR 反应体系中，Taq 酶浓度、引 物浓度、dNTP 浓度、Mg2+浓度均对扩增效率均起着 重要的影响，Taq 酶活性高度依赖Mg2+，Mg2+浓度的 过高或过低均会降低Taq 酶活性，从而导致扩增效率 显著降低甚至于没有产物。而dNTPs 则是在复性及延 伸过程中生产DNA 片段的原料，过高的 dNTPs 浓度 会导致错误渗入，过低会导致扩增产率下降。而引物 浓度过低，则会使引物与模板结合率下降，引物浓度 过高则会导致错配和非特异性扩增，并会使引物之间 形成引物二聚体[22]。 本研究先进行Taq 酶、dNTP、引物三个因素浓度 的优化，再对 Mg2+浓度进行确定，最终确定最为优化 的 反应体系为：Taq 酶浓度 0.04 μ/μl，dNTP 浓度 0.2 1~11 为红花品种编号。 Figure 3. PAGE analysis of different Varieties of safflower with the selected reaction system(Primers Me4/Em6) 图3. 利用优化的体系对不同品种红花进行 PAGE 分析(引物 Me4/Em6) Copyright © 2013 Hanspub 65  红花(Carthamus tinctorius L.)SRAP 反应体系建立与优化及对 11 个红花品种基因组的初步分析 mM，引物浓度0.3 mM，Mg2+ 2.0 mM，DNA 模板量 20 ng，体系总体积 10 μl。在本实验中，由图 1可以 看出，Taq 酶浓度对反应影响较高，当酶浓度过低时， 条带较弱。此前也有研究者使用25 μl体系[23]，本研 究中，为了进一步提高SRAP 用于红花品种资源评估 的可行性，我们采用了分布于全国不同区域的11 个 品种作为研究材料，并且采用了更小的反应体系，即 10 μl系统，目的是通过优化反应体系的建立，在筛选 特异性更强的检测引物，同时提高检测灵敏性。根据 图3的PAGE 实验结果来看，优化后的 PCR体系能够 扩增出良好清晰的条带。该引物组合Me4Em6 扩增出 12 条带，清晰条带 8条，具有多态性位点的条带有 4 条。 此前的报道[22]在红花属使用了30 对SRAP 引物 对23 个红花品种和 2个毛红花品种进行了分析，得 到485 条条带，多态性位点 274 个，多态性比率 57%[20]。 本文主要是对红花种内的分布于不同地域的 11 个品 种进行了研究，35 对引物中筛选出来25 对引物具有 多态性条带，得到 308条清晰条带，109 条条带具有 多态性，比率为35%，这说明在红花种内间的差异远 远低于红花和毛红花种间的差异。SRAP 在其他品种 应用时有过 90%的多态性条带比率[24]，本研究中红花 种内多态性比率则为 35%，多态性比率相对较低，这 可能由于红花在中国栽培历史较短，并且共同引种于 中亚地区的原因，所以不同品种红花的亲缘关系很 近，导致变异位点较少，SRAP在不同物种内的多态 性比率差异明显，应该是与与植物基因组进化方式的 多样性有关，研究者应该根据具体实验分析确定其在 种内应用的可行性。本研究中选用的仅仅是 35 对引 物，多态性比率就达到35%，其差异性足够区分不同 品种，说明 SRAP 对红花种内进行资源系统评估是完 全可行的。目前，对国内其他红花不同品种以及更多 SRAP 引物的筛选正在本实验室进行之中，这为对我 国目前众多红花品种间的亲缘关系、遗传背景、资源 评估以及以后的选育工作提供了有利的工具。 参考文献 (References) [1] 王岩军. 红花的组织培养及基因工程研究进展[J]. 新疆农业 科学, 2008, S1: 237-241. 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