植物细胞融合已成为植物改良中的重要技术工具。这项技术使得研究者能部分地或全部地结合不同栽培型、不同种、甚至不同属的植物细胞,培养出新型的遗传组合体,包括对称的四倍体体细胞杂合体、非对称的体细胞杂合体或体细胞胞质杂合体。通过克服传统杂交育种中性的不亲合性、多倍性以及雄性不育或雌性不育等难题,植物细胞融合能大大促进植物基因转移和育种的速度。本文简短地总结了植物细胞融合技术及其应用。<br/>Plant cell fusion has become an important tool in plant improvement. Plant cell fusion allows researchers to combine somatic cells (partial or whole) from different cultivars, species or genera to generate novel genetic combinations including symmetric allotetraploid somatic hybrids, asymmetric somatic hybrids or somatic cybrids. Through bypassing problems sometimes associated with conventional sexual crossing, including sexual incompatibility, polyembryony and male or female sterility, the plant cell fusion can greatly facilitate the process of gene transfer or breeding. This short review summarizes the plant cell fusion and its application.
细胞融合(cell fusion),亦称体细胞杂交(somatic hybridization)、原生质体融合(protoplast fusion)、超性杂交(parasexual hybridization)或超性融合(parasexual fusion),是指不同种类的原生质体不经过有性阶段,在一定条件下融合创造杂种的过程[
植物体细胞杂交技术虽然有其随机性的缺陷,但由于可转移细胞核中的染色体组、染色体片段,或者细胞质中的叶绿体DNA和线粒体DNA,因而使可利用的基因资源十分广泛。体细胞杂交在转移抗逆性状,进行作物改良,实现远缘重组,创造新型物种,以及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子–体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重要的应用前景。
植物原生质体培养的成功是体细胞杂交发展的先决条件,纵观体细胞杂交的发展过程不难看出,其研究重点随着原生质体培养的发展一次次地发生了转移[
植物体细胞杂交最初是从能通过有性杂交得到杂种植株的粉蓝烟草+郎氏烟草的原生质体融合获得突破的。于是,科学家们开始展开了丰富的设想。如Melchers等(1978)将有性杂交不亲和的番茄和马铃薯进行体细胞杂交,期望得到地上结番茄,地下长土豆的杂种,但结果并非如预期的那样,仅获得了外形偏向番茄,花、叶、果实具杂种特点的植株。与此同期或随后的实验中也有一些类似的组合,甚至更远缘的科间杂交。这些组合中得到的融合物大都不能分裂生长或仅开始分裂几次后便不再增殖,有些得到了连续增殖的细胞系,但却没有进一步分化[
原生质体的融合方式常见的有两种:对称融合(图1)和非对称融合(图2)。通过这两种融合方式可产生3种类型的杂种:对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。另外还有一类杂种叫异质杂种。同时,还有配子–体细胞融合和亚原生质体–原生质体融合[
原生质体的融合方法也经历了一个逐步改进和完善的过程。早期原生质体融合的方法有NaNO3法、高pH-Ca2+法、PEG(聚乙二醇)法,后来逐渐发展为PEG与高pH-Ca2+、高pH相结合,20世纪80年代初又开始探索使用电融合法,并发展出一些其他方法[
PEG法的融合频率可达10%~15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体间的融合。近年来一些研究建议在PEG溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜等),可有效提高原生质体的融合频率[
1979年Senda建立的电融合法发展迅速,是目前最流行的融合方法[
图1. 原生质体对称融合图解。父本1的胚珠诱导成胚胎发生的愈伤组织培养液。胚胎发生的原生质体经由酶解和原生质体分离得到。父本2的叶肉细胞原生质体经由叶片酶解和原生质体分离得到。两个父本的原生质体通过PEG或电融合得到含有两个父本细胞质和细胞核的异核体。小苗可通过细胞克隆、愈伤组织、体细胞胚的发生得到
图2. 供体–受体途径的原生质体非对称融合图解
父本1和父本2的胚珠分别诱导成胚胎发生的愈伤组织培养液。胚胎发生的原生质体经由酶解和原生质体分离得到。父本1的胚胎发生原生质体用伽马射线照射破坏细胞核,作为细胞质供体。父本2的胚胎发生原生质体用碘乙酸(IOA)处理抑制细胞器基因组。两个经过处理的父本原生质体通过PEG或电融合得到含有供体父本(父本1)的原生质体和受体父本(父本2)的细胞核的异核体。小苗可通过细胞克隆、愈伤组织、体细胞胚的发生得到显微镜下观察融合全过程[
Li等[
植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低[
20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系,据此原理发展了该技术。离子束的可操纵性高,可用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的[
非对称细胞融合技术,即利用某种外界因素(如γ射线)辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核,并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G,处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体,选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这2个原生质体品系的细胞,实现所需胞质和细胞核基因的优化组合(图2)。实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线X射线照射为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性[
植物微原生质体融合技术可在较少的融合杂种中获得具有目标性状的融合杂种,从而大大提高育种效率。植物微原生质体融合技术对非对称原生质体融合进行了改进,它是经微核来转移染色体,避免染色体操作所带来的染色体损伤,杂种遗传稳定。而且,它是在细胞水平上进行一条或几条染色体的转移,在一定程度上可克服杂交不亲合或杂交不孕等造成的生殖隔离。在作物种质创新和育种中有一定的潜在应用价值[
这些方法各有特点,但目前广泛使用的是PEG法和电融合法[
现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行,如将磁、超声、机械等和激光、电相结合,同时添加化学剂以便进一步提高融合率,细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单,便于量化研究,同时融合率又能得到不断提高的方向发展[
在原生质体融合后的群体中,有融合体、未融合体、多元融合体和嵌合体,杂种细胞的筛选就是从中区分出预期的融合重组类型。没有杂种选择技术常不能获得有效的体细胞杂种,而缺乏有效的具普遍意义的选择系统,正是一直制约体细胞杂交发展的瓶颈之一[
杂种选择技术通常以遗传标记、细胞对营养反应差异以及生化特性表现差异为基础建立。多数方法建立在双亲细胞互补的原则上,包括遗传互补、营养缺陷互补、白化突变体间互补以及生长激素的自主互补等。然而这些方法的局限性在于突变体不易获得,而且有些突变体不易再生。也有人采用机械分离杂种细胞的方法,早年利用显微镜操作分离,挑出融合杂种细胞,近年发展到利用流式细胞计来分离杂种细胞,尽管这种技术效率高,但是由于仪器价格昂贵,用的人还很少[
近年来,兴起的不对称融合也是一种筛选杂种细胞的方法。不对称融合指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及胞质物质重组,产生不对称杂种[
获得再生植株后,必须进一步证实杂种的真实性并了解它与亲本的联系与区别。除了传统的形态学、细胞学及生化方法得到了继续发展外,近年来基因组DNA的RAPD和AELP分析以及细胞器DNA的Southern杂交分析广泛应用于对称或不对称杂种细胞鉴定[
植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段,同时也正朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞质基因导人另一个体细胞的方向发展,有可能形成新的核质杂种。如果获得了有用性状的细胞系,在还不能形成植株时,就可以通过快速大量繁殖细胞加以利用[
Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[
病虫害和不良环境条件是农林业生产的大敌,大量施用农药带来日益严重的环境污染。培育和推广应用高抗逆性的优良品种,是实现农林业高产优质高效节能生产、保护环境的必由之路[
利用体细胞杂交已在许多有性杂交不亲合的种间、属间、甚至科间产生了可育的体细胞杂种。大量的研究结果表明,异源原生质体融合,不仅能在近缘种间,也可以在远缘种间产生体细胞杂种。供受体融合技术的建立和发展,更加扩大了远缘种间遗传重组的亲缘范围,增加了遗传变异的幅度[
目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[
杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。核基因控制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到[
体细胞杂交消除回交转育CMS性状时出现的异常现象,可通过改变杂种的生理特性来实现。Kirti[
植物细胞融合技术正日趋完善,无论在实践上还是在理论上,它都具有独到的用途和诱人的前景。通过体细胞融合产生新的有价值的农作物品种已有良好的开端。可以充分肯定,该项技术不仅可以打破种间杂交障碍,还可以扩大物种杂交范围,提高物种变异频率,缩短育种周期,拓宽育种领域,提高育种水平[
有性杂交不亲和的种间可以通过原生质体融合得到体细胞杂种植株,亲缘关系较近的亲本间可以得到可育的后代。通过栽培品种和野生近缘种间的体细胞杂交可以有效地将野生种的优良性状转至栽培品种以扩大栽培品种的基因库。它们可以用作育种资源,甚至直接应用,因而这样的体细胞杂交可以作为某些作物重要的育种途径[
但是我们必须清醒地认识到,体细胞杂交中仍存在一些函待解决的难题:1) 原生质体再生困难直接阻碍了体细胞杂交在作物育种上的应用;2) 体细胞杂种或胞质杂种本身染色体数目不定,染色体结构发生变异,及异常的减数分裂等都会造成培养过程中表现不稳定[
为打破杂交不亲和性,结合非对称融合与适宜的选择法,将支配近缘野生种和远缘种核的有用抗病性基因导入栽培种;花药培养所获得的有用性状的单倍体和二倍体的单倍体植物与同种或异种的单倍体及二倍体植物对称融合,重建核基因,尽早培育出实用的二、三、四倍体杂种;以期获得胞质杂种的CMS、抗病性、除草剂耐性、光合机能等有关的细胞质基因在短期内导入的优良系统。而且,在胞质杂种形成过程中以期mtDNA重组和胞质细胞器重建,使细胞质的遗传组成多样化;利用远缘间的融合易获得雄性不育植物,在至今未得到CMS的作物中,获得其新的CMS基因;以有性生殖困难、不能杂交育种的作物和营养繁殖性作物作为育种的突破口,使远缘杂交育种的研究有一新进展[
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