磷-31核磁共振(31P-NMR)技术因可以增强研究者对环境中磷素组分信息的认识而广受关注。本文综述了该技术在环境磷素形态表征方面的研究成果,对31P-NMR技术的原理、样品制备方法及分析流程进行了系统阐述。环境样品的制备过程(包括样品前处理方法、提取时间、提取剂比例、样品浓缩方法等)对检测结果的精密度和准确度具有显著影响。论文同时综述了该技术在土壤、湖泊、海洋及湿地磷循环等研究领域的研究成果,并对该技术未来的研究及应用重点进行了展望,旨在为环境磷形态分析中的核磁共振技术的发展应用以及标准化研究提供借鉴。 Due to its advantages in improving our knowledge about the P fractions in environmental samples, the 31-P nuclear magnetic resonance (31P-NMR) technology has received extensive attention. This paper summarized the current studies on the characterization of P fractions in sediments by using this technology, and described the technical principles, sample preparation method and analytical procedures of this technol- ogy. The preparation procedures of environmental samples have a significant influence on the accuracy and precision of testing results, including determination of sample pretreatment, extraction time, sample to ex- traction ratio and concentration method. The specific application fields of this technology were also summa- rized in this paper. 31P-NMR technology has been applied in the field of Soil, Lake, Ocean, Wetland, and has made a number of achievements. Some future research focuses were expected in this paper in order to pro- vide theoretic support for the development and application as well as standardization of 31P-NMR technology in the future.
磷(P)是构成许多生物大分子的关键元素,在能量贮存、迁移和转化过程中起关键性的作用[
环境样品中P化合物研究的传统方法或过于繁琐,或不甚精确,尤其是对于有机磷化合物的研究,基本是根据总磷与无机磷的差值获得,或被处理为连续提取程序中可以统一被最强提取剂分离的含磷组分[
本文将通过总结国内外学者近30年来的研究报道,对样品制备这一影响该技术精密度和准确度的关键环节进行全面阐述,总结该技术在土壤、湖泊、海洋及湿地磷循环等研究领域的研究成果,旨在为环境磷形态分析中的核磁共振技术的发展应用以及标准化研究提供借鉴。
31P是P元素唯一的天然稳定同位素,自然丰度为100%,31P-NMR(Nuclear Magnetic Resonance),是研究处于强磁场中的31P原子核对射频辐射的吸收,进而解决含P化合物分子结构信息的分析方法,可通过图谱上不同的位移值判断各种含磷化合物[
31P-NMR技术在环境磷形态分析中的应用常常受环境样品制备方法的制约。31P-NMR的样品制备可概括为样品的前处理(干燥、研磨),提取条件(提取剂的选择、提取时间及温度、提取剂的比例)、提取液的处理三个部分,这几个部分都将对结果产生影响。
样品的前处理包括样品的干燥、研磨。一般来说样品的干燥方式包括烘干、自然风干、冷冻风干,或直接使用未经风干的新鲜样品。2005年Barbara J. Cade-Menun等人[
图1. 磷的环境标准样品液相31P-NMR图谱(NaOH-EDTA提取)[
海洋沉积物的31P-NMR检测发现,自然风干会高估样品中的磷,正磷酸盐和磷酸单酯都会增加,磷酸二酯则会降低,而冷冻储存的样品则更接近原样品中的磷组分含量。2011年白秀玲等人也通过对我国43个湖泊的表层沉积物的研究证明[
自1980年该技术得到应用开始,早期研究者们最常使用的主提取剂为NaOH,但往往会选择一些其它的试剂作为联用试剂[15-20],如EDTA、CDB、NaF、稀酸、阳离子交换树脂等。这是因为环境土壤或沉积物中往往含有较多的Ca、Fe、Al、Mn金属矿物质等,与含磷化合物形成金属结合态磷,使得磷难以被释放,因此单独使用NaOH提取(一些生物样品除外[
相对而言,EDTA作为金属螯合剂不仅适用于更广泛的阳离子(对Ca、Fe、Al、Mn等均可发挥作用),而且对有机磷组分的破坏性更小[
在NMR扫描时发现,无机正磷酸盐往往会占极大比例,这不仅会使得扫描时间大大增加,同时会压缩其它含量较少的有机磷组分的出峰,甚至出现噪音。因此如何去除环境样品中无机磷酸盐从而提高扫描效果是另一个研究重点,一般会选择稀酸进行预处理以达到去除的效果[
提取液中磷的浓度会直接影响到31P-NMR检测的灵敏度。相同情况下,提取剂比例越高,各组分的浓度就越低,被检测出来的可能性也越小;同时浓缩的时间也会越长,以致有机磷水解或与金属离子沉淀的几率越大。但如果提取剂比例过低,首先会影响提取效果,其次无机磷酸盐的比例会相应增加,从而加大扫描难度。因此虽然提取剂比例的变化并不影响提取剂对磷的选择,但选用适当的提取剂比例,对提取效果以及检测灵敏度都非常重要。应根据待测样品的具体情况(主要可依据样品的总磷含量)设置适当的提取剂比例,对于总磷含量较高(如,>1.0 g/kg干)的样品,可选择8:1~20:1或更高的比例[
表1. 不同提取剂比例及NMR扫描结果
在选择好提取剂及比例后,为了尽可能完整地提取出样品中的含磷组分,同时保证某些化合物不致水解,应把握好提取时间,研究表明常温下振荡提取12~ 16 h是合适的[
样品制备完成后,冷冻储存直至分析,但应在两天之内进行核磁共振分析。31P-NMR分析前,取出冷冻浓缩样品,重新溶解,然后在4℃,10,000 r/min下离心10 min,加入适量D2O锁定信号。然后将样品转移至5 mm NMR管中进行31P-NMR检测。
土壤学家比较早地认识到了有机磷的重要性,1980年Newman[
利用31P-NMR技术研究湖沼及海洋沉积物中有机磷的工作相对起步较晚,其分析方法也完全建立在土壤学研究的基础上。但近些年的研究工作表明了31P-NMR技术在湖沼学和海洋学研究工作方面存在的重大意义与前景。研究表明[17,28,35]:控制条件实验发现含氧量、温度、有机质、抑制剂等都会对湖泊沉积物磷组分产生影响,尤其是含氧量。厌氧条件下不仅会促使更多磷的释放,同时在释放的过程中会促使Fe-P系络合物溶解,伴随磷酸盐的释放,部分磷酸盐会导致多聚磷的矿化。自然湖泊沉积物中有机磷成分包括磷酸单酯、磷脂、DNA-P、膦酸脂、有机多聚磷等,但人工景观湖中检测不到膦酸脂和有机多聚磷,且其中生物磷的含量排序为单酯磷 > DNA-P > 焦磷酸盐 > 脂质磷,提示人类活动对水体-沉积物系统磷素的组成具有重要影响,应重新考量景观湖对水体的净化能力;缺氧且含有更多金属离子的海洋中没有检测到湖泊沉积物中出现的焦磷酸盐和多聚磷,提示氧化还原反应及阳离子强度变化是影响焦磷酸盐和多聚磷的关键因子;磷酸二酯在低氧或厌氧区含量更高,且明显高于磷酸单酯,有氧条件下则相反,符合聚磷菌厌氧释磷,好氧聚磷的特征,提示溶解氧对水体-沉积物系统磷素的迁移转化具有较大影响。
尽管湿地中磷持留和磷去除的主要过程都涉及有机态磷的转化,且成熟湿地中50%以上的总磷累积为有机态磷,但目前关于湿地中有机态磷的赋存形态、环境行为等基本问题的认知仍存在很大缺位,严重限制了湿地生态工程的运用和管理。有机磷研究正成为国际环境科学界的热点,随着31P-NMR技术在湿地磷研究中的逐步应用,国内外湿地有机磷研究逐渐起步[
环境中磷化合物的种类包括无机磷酸盐、有机磷酸单酯、磷酸二酯、膦酸盐、有机多聚磷等,不同种类有机磷在环境中的稳定性和循环特征存在明显差异,不同种类有机磷化合物的比值可作为磷来源的多元示踪“生物标志”。随着水体富营养化问题的日益突出,磷在环境中的形态及迁移转化规律成为了研究热点,31P-NMR分析技术因具备传统磷化合物研究方法所不具有的样品前处理相对简单、破坏性小、组分分析完全等优点,不仅可以得到环境磷的具体形态,还可据此分析磷的组成结构及空间分布等信息。该技术的应用极大推动了环境磷特别是有机磷循环研究的发展,尤其是在水体富营养化严重的今天,31P-NMR技术对于湖泊、湿地等系统磷的内循环的研究具有重要的推动作用,对于进一步深化磷在环境中的迁移转化以及动力学研究具有重要的意义,同时,可望为新型生态污水处理系统——湿地系统的设计、运行和管理等的发展与优化提供理论支撑。
1) 样品制备技术是影响该技术在环境磷形态分析及迁移转化规律研究中应用的关键因素。关于31PNMR技术的环境样品制备方法目前尚无统一的标准方法,未来的研究工作可尝试将试验方法及参数标准化,尽可能的改进并完善统一样品制备方法。
2) 不同种类有机磷在环境中的稳定性和循环特征存在明显差异,含氧量、温度、有机质、细菌等因素都会对环境中磷素的组成及迁移转化产生显著影响。因此在方法标准化研究的同时,尝试将31P-NMR技术应用到更多的领域,并结合其它生物物理化学方法等,开展反应动力学等的研究。
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[
[