本研究采用甘油、果糖、柠檬黄作为光透明剂。下图1显示了它们的化学结构。

Figure1. Chemical structures of glycerol (a), fructose (b), and tartrazine (c)

图1. 甘油(a)、果糖(b)和柠檬黄(c)的化学结构

柠檬黄是偶氮类含有磺酸基团和氮氮双键的小分子染料，实验中其透明效果最好。柠檬黄的光透明效果并非直接吸收散射光，而是通过自身光学特性，借助洛伦兹振子模型描述的响应规律，结合克拉默斯–克朗尼格关系的因果关联，提升水溶液折射率以匹配组织高折射率成分，最终降低光散射。柠檬黄在可见光范围内吸收系数极低，吸收系数小于0.1 cm⁻¹，不会因光吸收导致透过光衰减；同时其化学性质稳定，不会被组织内的酶分解，也不会与促渗剂发生反应，适合在体实验。

洛伦兹振子模型将柠檬黄分子视为“受迫振动的电偶极子”，其核心是描述分子对光的响应，即折射率的实部 n ′ 和虚部 n ″ 的变化。基于洛伦兹振子模型和克莱默–克朗尼格关系，强吸收分子溶解于水后，可改变水相介质的折射率，使其与脂质等组织成分的折射率匹配，从而减少光散射[12]。

其中，P.V.为柯西主值，λ为成像波长， λ ′ 为积分波长。柠檬黄在短波长的强吸收 n ″ 峰值，通过积分计算会显著提升长波长的 n ′ 。该方程表明，染料的光谱位置、光谱宽度以及吸收强度，均是调控 n ′ ( λ ) 可实现变化量的关键参数。

柠檬黄的尖锐吸收峰位于428 nm [13]，接近成像用红光波段，根据K-K关系，短波长的强吸收会显著提升长波长的水相折射率。柠檬黄的共振频率低，且吸收峰窄，半高宽为94 nm，根据洛伦兹模型，这类分子作为“强振子”，能更高效地通过电子跃迁调节介质的介电常数。

有研究表明，对于具有多个吸收峰的分子，多振子洛伦兹模型可简化为单振子模型。洛伦兹振子模型将分子视为“受迫振动的带电粒子系统”，可定量描述分子对光的吸收和色散特性，为筛选高效透明剂提供关键指标。

借助该模型，可将光学透明剂的相对介电常数 ε r 与其等离子体频率 ω p 和阻尼常数γ直接关联，对应着吸收峰半高宽。其中ω = 2πc/λ (c为光速)， ε ∞ 是高平介电常数， ω 0 是分子共振频率。

2.2.1. 鸡胸肉离体实验

主要选择果糖(天津市科密欧化学试剂有限公司，AR分析纯化学实验室用药品D-果糖，≥99.5%)、甘油(江西泰馨康实业有限公司，纯甘油99.7%)、柠檬黄(山东科源生化有限公司，>95%，HPLC)。

无骨去皮生鸡胸肉购自当地供应商，于−10℃条件下冷冻保存。实验开始前，将冷冻的生鸡胸肉置于室温下解冻10分钟。随后，沿与胶原纤维平行的方向将鸡胸肉切成2 mm厚度，以确保每块肉的肌纤维走向一致。预实验中，分别评估了甘油、果糖及柠檬黄溶液在不同浓度下的光透明效果，并最终确定其各自的最佳浓度为：6 mol/L、4 mol/L和0.6 mol/L。在同一温度下，将鸡胸肉浸泡在这三种溶液中，分别观察鸡胸肉初始时和浸泡5 min、10 min、15 min、20 min的光透明情况。

2.2.2. 激光㪚斑衬比成像技术

为评估体内皮肤光学透明的效果，此次实验采用LSCI对皮肤血流进行成像。散斑是由受照表面不同部位反射或散射的光线形成的随机干涉图样。当散射粒子发生移动时，散斑图样会变得模糊[14]。通过在模糊图像上滑动若干个(N × N)通常(N = 5)的方形窗口进行计算，或是对一系列时间帧中的单个像素展开分析，即可得到血流灌注图。这两种方法分别被称为激光散斑空间对比分析法和激光散斑时间对比分析法。

LSCI系统的原理图如下图2所示。实验采用He-Ne激光器(波长为632.8 nm，功率3毫瓦)，经Thorlabs公司GBE15-A的15X消色差伽利略扩束器(拥有400 nm~650 nm的增透范围)对目标区域进行照射。随后，1200万像素的海康工业相机(曝光时间为5毫秒)获取被照射区域的影像并传输至搭载GeForce RTX 3090显卡的计算机进行计算成像。由于激光散斑时间对比度分析法可抑制静态散射的影响，因此研究采用该方法从原始散斑图像中获取血流分布图。

Figure2. Schematic diagram of the LSCI experimental system

图2. LSCI实验系统示意图

2.2.3. 小鼠在体实验

此论文的动物饲养及实验操作均符合《中华人民共和国湖北省实验动物管理条例》。所有小鼠均饲养在无特定病原体级别的环境中，实验所用的雄性C57BL/6小鼠(3~4周龄)购自三峡大学实验动物中心。

实验前，通过腹部注射浓度为1.25%的三溴乙醇(南京安杰优生物科技有限公司) 0.2 mL对小鼠进行麻醉处理，每次补注首次注射剂量的70%，并将麻醉后的小鼠放置在加热垫上维持体温。随后，用手术剪刀减去小鼠头部的毛，再使用脱毛膏清除残留毛。最后采用胶带剥离法操作2~3次，以去除大鼠皮肤表面的杂质。再剪开小鼠头部的皮肤，对其头部进行激光㪚斑实验。接着将柠檬黄溶液滴到去皮头部上。

鸡胸肉实验如下图3所示，高浓度的甘油和果糖溶液会导致鸡胸肉过度脱水，组织细胞内的水分快速渗出，细胞内溶质因浓度骤升而析出沉淀，使鸡胸肉纤维的状态从疏松均匀的质地变硬并且凹凸不平。这种结构变化破坏了组织内部的折射率均匀性，光线通过时发生多次折射，导致透过鸡胸肉观察到的标定板直线曲折。由柠檬黄溶液浸泡的鸡胸肉的光透明效果最好，并且鸡胸肉没有产生脱水、质地变硬的现象。

为定量评价离体鸡胸肉的光透明效果，分别对甘油、果糖、柠檬黄浸泡20 min后的鸡胸肉白光图中的分辨率做了计算：分辨力的大小分别为22.4 μm、39.3 μm、70.1 μm，光透明效果最好的是柠檬黄，接着是果糖，最后是甘油。

Figure 3. Results of the optical clearing experiment on chicken breast tissue

图3. 鸡胸肉光透明实验结果图

实验结果中拍摄的小鼠头部去皮白光图和散斑图以及感兴趣区域(Region Of Interest, ROI)局部放大图如下图4所示。

Figure4. White-light and temporal-contrast images of the invivo mouse head after scalp removal

图4. 在体小鼠头部去皮的白光图和时间衬比图

3.2.1. 实验前后CNR变化

为定量评价各试剂作用于小鼠皮肤组织后的光透明效果，本文用对比度信噪比(Contrast-to-Noise Ratio, CNR)来评价成像质量的改善[15]，CNR计算公式如下：

其中，μ_vess和μ_back分别表示构成血管和背景的像素的平均强度； σ vess 2 和 σ back 2 分别表示构成血管和背景的像素的强度方差；f_vess和f_back分别表示图像中被归类为血管和背景的像素占总像素数的比例。分子反映血管与背景之间的强度差异，分母则是经图像构成比例加权后的图像总噪声度量。

ROI的CNR曲线如下图5所示，头部去皮组织的对比度噪声比随时间呈显著上升趋势，与成像结果定性观察一致。这一量化结果直接证明了经过柠檬黄溶液光透明处理后，降低了组织散射，提升了血流信号的信噪比，进而增强了血管结构的可视化效果。

Figure5. CNR of the ROI

图5. ROI的CNR

3.2.2. 实验前后血流灌注量变化

在散斑分析中，定义衬比度K来衡量散斑时间积分后的模糊程度[16]：

其中，σ为㪚斑光强的标准差，μ为光强均值。对衬比度值与相对速断关系的研究表明，散斑的衬比度值是曝光时间t的函数：

其中，t为图像采集过程中的曝光时间， τ c 表示相关时间， k 0 为激光的波数，比例系数a取决于成像区域颗粒尺寸的洛伦兹长度和散射特性。相关时间 τ c 与散射颗粒的运动速度v成反比。进一步，激光㪚斑测量血流灌注量可表示为[17]：

Figure6. Blood flow perfusion of the ROI

图6. ROI的血流灌注量

ROI的血流灌注量曲线如上图6所示，初始状态时，组织散射较强，光子穿透深度有限，仅能检测到浅表血管的血流信号，深部血管因散射干扰而信号衰减，导致测得的血流灌注量偏低。随着光透明试剂渗透，组织折射率匹配度提高，散射系数降低，光子可穿透更深层组织，使得原本被掩盖的深部血管血流信号被有效采集，表现为血流灌注量的量化值增加。

血流灌注量的增加与CNR的提升呈现同步趋势，且微血管结构清晰度与血流信号强度正相关，表明灌注量增加是光学成像质量改善的直接结果，而非生理干扰，从而反向验证了光透明试剂仅通过优化光学环境而非改变血流本身提升成像效果。

3.2.3. 蒙特卡洛模拟

本研究观察到小鼠在应用柠檬黄透明剂后，血流灌注量 Q l 呈现显著上升趋势。然而，需深入区分这一增长是源于“深层信号的真实显露”还是“介质改变导致的算法计算偏差”。首先，组织光透明技术的核心机制在于通过折射率匹配降低散射系数μ_s。

蒙特卡洛模拟显示(见图7)，随着μ_s的降低，光子在组织内的平均自由程增大，穿透深度显著提升。这意味着原本受限于高散射而无法检测到的深层微血管动能信号，能够更有效地穿透皮肤层并携带血流动力学信息返回传感器。因此，CNR的提升及灌注量图谱的细节丰富，很大程度上归功于光透明技术打破了静态散斑对比度的掩盖效应，实现了深层血流信息的有效提取。其次，必须警惕介质光学参数改变对LSCI计算公式(公式(5))中比例系数α的影响。由于散斑衬比度K的计算高度依赖于光子在组织内的多重散射统计特性，当组织从强散射介质转变为弱散射介质时，光路分布的变化可能导致即便在血流流速恒定的情况下，计算出的K值也会发生波动，从而引入非生理性的计算偏差。

Figure7. Monte Carlo simulation

图7. 蒙特卡洛模拟