氯化消毒是我国普遍采用的城市污水消毒措施,然而,氯化消毒的同时,氯与水中的有机物发生反应生成一系列的卤代烃类化合物,即氯化消毒副产物。经研究证实大部分氯化消毒副产物具有致癌、致突变、生殖毒性效应。为研究消毒废水中一些副产物的毒性,本研究采用消毒废水中的有害副产物三氯甲烷(CHCl3)和三溴甲烷(CHBr3)为毒物材料,以草履虫为受试生物,对其种群进行单一急性毒性和联合毒性实验,探究CHCl3和CHBr3对草履虫的急性毒性和联合毒性。实验结果表明,两种毒物单独作用时,随着浓度增大,毒性作用也增大,CHCl3的1 h半致死浓度(LC50)为1585.27 μg/L,CHBr3的1 h半致死浓度(LC50)为656.37 μg/L,两种毒物共同作用时表现为协同作用。由于草履虫对两种毒物毒性较为敏感,其可作为CHCl3和CHBr3的毒性评价生物。 Chlorination is widely applied to disinfect drinking water in China. However, a series of chlori-nated disinfection by-products (CDBPs) are formed when chlorine reacts with organic matters in water health. Many CDBPs can cause health hazards for human, for example, cancers and mutagenic and reproductive toxicity. For the study of disinfection by-products in some wastewater toxicity, this study used the harmful by-products, chloroform (CHCl3) and methyl bromide (CHBr3) in disinfection wastewater, as poison materials. In single acute toxicity test and joint toxicity test, the acute toxicity and joint toxicity of CHCl3 and CHBr3 to paramecium were studied. The results show that, when the two toxicants work separately, toxic effects increase along with the increasing concentration. The median lethal concentration (LC50) of CHCl3 in 1 h was 1585.27 μg/L and that of CHBr3 was 656.37 μg/L, and it showed a synergistic effect when combining two poisons. Since paramecium is sensitive to the toxicity of the two poisons, it can be used to evaluate the toxicity of CHCl3 and CHBr3.
李晓珊,陈菲菲,王彦超,王能红,唐天乐*
海南医学院热带医学与检验医学院环境科学专业,海南 海口
Email: *ttl-0114@163.com
收稿日期:2015年6月30日;录用日期:2015年7月10日;发布日期:2015年7月15日
氯化消毒是我国普遍采用的城市污水消毒措施,然而,氯化消毒的同时,氯与水中的有机物发生反应生成一系列的卤代烃类化合物,即氯化消毒副产物。经研究证实大部分氯化消毒副产物具有致癌、致突变、生殖毒性效应。为研究消毒废水中一些副产物的毒性,本研究采用消毒废水中的有害副产物三氯甲烷(CHCl3)和三溴甲烷(CHBr3)为毒物材料,以草履虫为受试生物,对其种群进行单一急性毒性和联合毒性实验,探究CHCl3和CHBr3对草履虫的急性毒性和联合毒性。实验结果表明,两种毒物单独作用时,随着浓度增大,毒性作用也增大,CHCl3的1 h半致死浓度(LC50)为1585.27 μg/L,CHBr3的1 h半致死浓度(LC50)为656.37 μg/L,两种毒物共同作用时表现为协同作用。由于草履虫对两种毒物毒性较为敏感,其可作为CHCl3和CHBr3的毒性评价生物。
关键词 :三氯甲烷,三溴甲烷,草履虫,急性毒性
氯化消毒一直是国内外城市给水处理中广泛采用的消毒手段,目的在于消灭水中微生物,防止介水传染性疾病的传播。氯化消毒具有灭藻、除臭、除味和去色的功能,杀菌效果好、除菌及虫卵彻底、高效持续、价格低廉、使用方便等优点,迅速被世界各国广泛应用。但是,消毒剂可与天然水体中腐殖质有机物发生反应,生成以卤代有机物为代表的消毒副产物(chlorination disinfection by products,CDBPs)。长期饮用含此类副产物的水可能会对人体有害 [
草履虫(Paramecium caudatum)是原生动物门纤毛纲的代表动物,分布广泛,其具有结构典型、易培养、繁殖快、观察方便等特点。环境的微小变化可导致其形态、行为、结构等改变,故其可作为环境指示生物之一。草履虫运动迅速,能与周围介质充分接触,对毒物更为敏感,与纯化学手段相比,更能形象的反应环境污染物的毒理效应。近年草履虫常作为受试生物进行急性毒性实验,研究重金属、农药等污染问题,反应污染物毒性,为合理使用农药、治理环境污染等提供科学依据 [
草履虫、稻草
三氯甲烷、三溴甲烷、均为分析纯试剂
SMARTe-320一体化数码显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司),SMZ-DM320数码体视显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司),RS-60S超声波细胞粉碎机(宁波荣顺科技仪器厂),YP1201N电子天平(上海精密科学仪器有限公司),BSG-400光照培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
烧杯、锥形瓶、长颈漏斗、凹玻片、盖玻片、载玻片、移液枪、毛细玻璃管、玻璃棒、剪刀、纱布、滤纸、EP管、万用电炉、解剖针。
本实验草履虫取自海南医学院人工湖,通过培养、纯化,以CHCl3、CHBr3为毒物,通过设计浓度梯度毒性实验,记录草履虫的死亡情况,绘制半致死浓度曲线,利用GraphPad Prism 5.0和SPSS 17.0统计分析。
1) 稻草培养液的制备:取20 g被剪短为2~3 cm的稻草,置于1000 mL水中,加热煮沸15 min,pH为7左右,蒙上双层纱布,在室温下放置24 h备用 [
2) 草履虫的培养:取海南医学院人工湖枯枝落叶较多处的湖水,经纱布过滤,浓缩,置于锥形瓶中,加稻草培养液,于光照培养箱(25℃,60%光照)中培养3~6 d,即有大量草履虫出现。
3) 草履虫纯化:取含有草履虫的上层培养液加入新鲜培养液继续培养5 d,如此反复更换培养液4~5次后,即可得到纯的草履虫。
在正式实验之前,分别用CHCl3和CHBr3对草履虫进行1 h单一毒性预实验,得出用CHCl3对草履虫暴露1 h的绝对致死剂量为2779.17 μg/L、最小致死剂量为1005.18 μg/L;用CHBr3对草履虫暴露1 h的绝对致死剂量为1559.34 μg/L、最小致死剂量为260.31 μg/L。根据此范围,采用简化寇氏法设计两种毒物的浓度梯度组,并设空白对照,每个浓度梯度三组平行。CHCl3的浓度梯度组为:0、1005.18、1295.27、1667.74、2052.14、2779.17 μg/L;CHBr3的浓度梯度组为:0、260.31、404.37、624.24、967.85、1559.34 μg/L。联合作用采用2 × 2析因设计 [
用相应浓度的毒物将数好的草履虫冲入EP管中,用黑色袋子将其盖住,避光放置一小时后观察。
吸取EP管中溶液于凹玻片上,利用解剖镜观察草履虫存活个体数。再取纯培养液冲洗EP管并吸出观察是否有存活草履虫。
本实验数据表示方法为均数 ± 标准偏差,采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 17.0统计软件对两种毒物的急性毒性实验数据统计分析,根据百分率与概率单位对照表,将死亡率转换成概率单位;概率单位为Y,浓度对数为X。应用SPSS软件对概率单位(Y)与浓度对数(X)进行回归分析,得到回归方程Y = aX + b,计算LC50 [
析因分析中,P < 0.05表示CHCl3 + CHBr3间有交互作用,联合作用呈协同作用或拮抗作用;P ≥ 0.05表示CHCl3 + CHBr3间无交互作用,其联合作用呈相加作用。
用蓝墨水染色在显微镜下观察到的草履虫形态如图1所示。
对CHCl3对草履虫1 h的急性毒性实验结果如表1所示,采用SPSS 17.0统计软件对实验结果进行统
图1. 草履虫形态
组别 | 剂量C (μg/L) | lgC | 死亡个数 | 死亡率 | 概率单位/Y |
---|---|---|---|---|---|
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | / |
2 | 1005.18 | 3.00 | 1.33 ± 0.58 | 11 ± 2.65 | 3.77 |
3 | 1295.27 | 3.12 | 3.33 ± 0.57 | 27.67 ± 3.06 | 3.42 |
4 | 1667.74 | 3.22 | 7.33 ± 1.53 | 59.33 ± 8.08 | 5.23 |
5 | 2052.14 | 3.13 | 10.67 ± 0.58 | 80.33 ± 4.16 | 5.84 |
6 | 2779.16 | 3.44 | 12.00 ± 1.73 | 100 | / |
表1. CHCl3对草履虫急性毒性实验结果(1 h)
计分析,结果显示,回归系数为0.002,相伴概率差异具有统计学意义,说明相关性很强 [
CHCl3对草履虫死亡率的影响如图2所示,CHCl3浓度与死亡率成梯度增长,在设计的暴露组中,各浓度组与对照比较均具有极显著差异(P < 0.01)。
CHBr3对草履虫1 h急性毒性实验结果表2所示,采用SPSS17.0统计软件对实验结果进行统计分析,结果显示回归系数为0.003,相伴概率差异具有统计学意义,说明相关性很强。得到回归方程y = −1.705 + 0.003x。CHBr3对草履虫的1 h半致死浓度LC50为656.37 μg/L,LC50 (F检验)95%的可信限为403.69~1000.12 μg/L,5%致死浓度为LC5为23.34 μg/L,95%致死浓度LC95为1289.41 μg/L。
CHBr3对草履虫死亡率影响如图3所示CHBr3浓度与死亡率成梯度增长,260.32 μg/L CHBr3浓度暴露组与空白对照组比较无显著性差异(P > 0.05)。说明低浓度CHBr3对草履虫伤害很小,后四组与空白对照组比较有极显著性差异(P < 0.01),说明草履虫对大于404.36 μg/L CHBr3非常敏感。
CHCl3 + CHBr3对草履虫的联合毒性试验结果见表3。通过查找CHCl3急性毒性置信区间可得1389.58 μg/L的死亡率为35%,647.63 μg/L的死亡率为3%。查找CHBr3急性毒性置信区间可得799.67 μg/L的死亡率为66%,202.184 mg/L的死亡率为15%。整理单一毒性和联合毒性实验质量浓度与死亡率之间的关系见表4。
对CHCl3 + CHBr3联合作用对草履虫急性毒性作用的影响如表4所示,202.18 μg/L CHBr3 + 647.63 μg/L CHCl3联合作用于草履虫后,草履虫的死亡率为53%;202.184 μg/L CHBr3 + 1389.58 μg/L CHCl3联合作用于草履虫后,草履虫的死亡率为82%;同样799.67 μg/L CHBr3 + 647.63 μg/L CHCl3、799.67 μg/L CHBr3 + 1389.58 μg/L CHCl3联合作用于草履虫后,草履虫的死亡率为100%。CHCl3 + CHBr3联合染毒对草履虫的致死率明显高于单一剂量组,差异显著(P < 0.05)。析因分析结果表明:CHCl3 + CHBr3联合染毒对草履虫致死率交互作用明显,CHCl3和CHBr3联合作用表现为协同作用(F = 8.345,P = 0.02)。
关于CHCl3、CHBr3毒性作用已有一些报导。沈洛夫 [
本研究显示,CHCl3对草履虫1 h急性毒性作用LC50为1585.27 μg/L,其浓度越高,草履虫死亡率越高;CHBr3对草履虫1 h急性毒性作用LC50为656.37 μg/L,其浓度越高,草履虫死亡率越高。充分证明了草履虫死亡率随二者浓度的升高而增高,呈明显的剂量–反应关系。本实验结果表明CHBr3毒性大于CHCl3,与沈洛夫等人的研究结果一致。
图2. CHCl3浓度与草履虫死亡率柱状图
图3. CHBr3质量浓度与草履虫死亡率柱状图
组别 | 剂量C(μg/L) | lgC | 死亡个数 | 死亡率 | 概率单位/Y |
---|---|---|---|---|---|
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | / |
2 | 260.31 | 2.42 | 0.67 ± 0.58 | 5.33 ± 4.62 | 3.36 |
3 | 404.36 | 2.61 | 4.00 ± 1 | 30.67 ± 5.51 | 4.50 |
4 | 624.24 | 2.80 | 7.33 ± 1.53 | 61.67 ± 12.58 | 5.28 |
5 | 967.85 | 2.98 | 10.67 ± 0.58 | 82.33 ± 3.06 | 5.92 |
6 | 1559.34 | 3.19 | 12.00 ± 0 | 94.67 ± 4.62 | 6.64 |
表2. CHBr3对草履虫急性毒性实验结果(1 h)
组别 | CHBr3 + CHCl3剂量C/(μg/L) | lgC | 死亡个数 | 死亡率% | 概率单位/Y |
---|---|---|---|---|---|
1 | 799.67 + 1389.58 | 2.89/3.14 | 12.67 ± 0.58 | 100 | / |
2 | 799.67 + 647.63 | 2.89/2.81 | 12.33 ± 1.16 | 100 | / |
3 | 202.18 + 1389.58 | 2.31/3.14 | 9.33 ± 2.89 | 82.00 ± 8.89 | 4.50 |
4 | 202.18 + 647.63 | 2.31/2.81 | 7.33 ± 2.08 | 52.33 ± 15.63 | 5.28 |
表3. CHCl3 + CHBr3联合毒性试验结果(1 h)
CHCl3 (μg/L) | CHBr3 (μg/L) | ||
---|---|---|---|
0 | 202.18 | 799.67 | |
0 | 0 | 15% | 65% |
647.63 | 3% | 53% | 100% |
1389.58 | 35% | 82% | 100% |
析因分析 | F | P | |
CHCl3 | 8.345 | 0.02 | |
CHBr3 | 41.397 | 0.00 | |
CHCl3 + CHBr3 | 8.345 | 0.02 |
表4. CHCl3 + CHBr3单独与联合作用浓度与死亡率试验结果(1 h)
论通过研究CHCl3、CHBr3对草履虫单一急性毒性和联合毒性,得到如下结论:
1) CHCl3对草履虫的急性毒性实验表明,随着CHCl3浓度增高,其对草履虫的毒性增大,且呈现出明显的剂量效应关系。1 h半致死浓度LC50为1585.27 μg/L,95%的置信区间为1473.86~1698.66 μg/L;
2) CHBr3对草履虫的急性毒性实验表明,随着CHBr3浓度增高,其对草履虫的毒性增大,且呈现出明显的剂量效应关系。1 h半致死浓度LC50为656.37 μg/L,95%的置信区间为403.69~1000.12 μg/L;
3) 对草履虫单一急性毒性,CHBr3的毒性大于CHCl3;
4) 联合作用采用2 × 2析因设计,799.67 μg/L CHBr3 + 1389.53 μg/L CHCl3,799.67 μg/LCHBr3 + 647.63 μg/L CHCl3,202.18 μg/L CHBr3 + 1389.58 μg/L CHCl3,202.18 μg/L CHBr3 + 647.63 μg/L CHCl3等不同剂量组合对草履虫急性毒性作用,结果表明,CHCl3和CHBr3对草履虫联合毒性表现为协同作用。
综上所述,草履虫可作为一种敏感指示生物来评估CDBPs的长期危害,为水污染的减排和生境的保护提供了一种新途径。
感谢教育部大学生创新创业训练计划项目201211810059的支持,以及唐天乐老师对课题的指导。
李晓珊,陈菲菲,王彦超,王能红,唐天乐. 两种含氯消毒副产物对草履虫急性毒性效应初探 Initial Study on Acute Toxicity of Two Chlorination Disinfection by-Products (CDBPs) against Paramecium Caudatum[J]. 水污染及处理, 2015, 03(03): 46-53. http://dx.doi.org/10.12677/WPT.2015.33008