目的:建立高效液相色谱法(HPLC)测定复方扶正柔肝颗粒中柯里拉京和丹酚酸B含量的方法。方法:色谱柱:InertsiL® ODS-SP (5 μm, 4.6 × 250 mm);流动相:乙腈-0.2%磷酸(梯度洗脱);检测波长为210 nm;流速为1.0 mL/min;柱温35℃;进样量5 μL。结果:柯里拉京在0.061~0.510 μg的范围内线性关系良好(r = 0.9997),平均加样回收率为101.41% (RSD = 1.68%, n = 6);丹酚酸B在0.504~4.203 μg的范围内(r = 0.9999)线性关系良好,平均加样回收率为103.30% (RSD = 1.11%, n = 6)。结论:本法灵敏、快速、准确,可用于复方扶正柔肝颗粒的质量控制。<br/>Objective: To establish a high liquid chromatography method of determinating Corilagin and Sal-vianolic acid B in Fu Zheng Rou Gan. Method: Chromatographic column: InertsiL® ODS-SP (5 microns, 4.6 × 250 mm). The mobile phaseis is acetonitrile-0.2% phosphoric acid (gradient elution) with detection wavelength 210 nm; the flow rate is 1.0 mL/min; the column temperature is 35˚C and the inject volume is 5 μL. Result: In the range of 0.061 - 0.510 μg, the linear relationship of Corilagin is good (r = 0.9997), and the average sample recovery rate is 101.41% (RSD = 1.68%, n = 6). In the range of 0.504 - 4.203μg, the linear relationship of Salvianolic acid B is also good (r = 0.9999), and the average sample recovery rate is 103.30% (RSD = 1.11%, n = 6). Conclusion: The method is sensitive, rapid and accurate and can be used for quality control of this granule.
宋力飞1,刘常青1*,李曼莎1,阳建军2,李常青2
1广州泽力医药科技有限公司,广东 广州
2广州中泽生物技术有限公司,广东 广州
收稿日期:2015年11月2日;录用日期:2015年11月23日;发布日期:2015年11月27日
目的:建立高效液相色谱法(HPLC)测定复方扶正柔肝颗粒中柯里拉京和丹酚酸B含量的方法。方法:色谱柱:InertsiL® ODS-SP (5 μm, 4.6 × 250 mm);流动相:乙腈-0.2%磷酸(梯度洗脱);检测波长为210 nm;流速为1.0 mL/min;柱温35℃;进样量5 μL。结果:柯里拉京在0.061~0.510 μg的范围内线性关系良好(r = 0.9997),平均加样回收率为101.41% (RSD = 1.68%, n = 6);丹酚酸B在0.504~4.203 μg的范围内(r = 0.9999)线性关系良好,平均加样回收率为103.30% (RSD = 1.11%, n = 6)。结论:本法灵敏、快速、准确,可用于复方扶正柔肝颗粒的质量控制。
关键词 :扶正柔肝颗粒,含量测定,柯里拉京,丹酚酸B,HPLC
在我国,肝癌发病人数每年超过30万,其中80%以上的肝癌是在慢性肝炎、肝硬化基础上发生,而乙型肝炎病毒持续感染是导致慢性肝炎、肝纤维化和肝硬化发生的第一大原因,与肝癌发生的相关率高达80% [
扶正柔肝颗粒由叶下珠、丹参、柴胡、甘草、苦参、人参等中药配伍而成,具有清热解毒、疏肝解郁、活血化瘀及补气健脾功效,主要应用于肝纤维化、肝硬化和慢性肝炎治疗。扶正柔肝颗粒作为一种具有抗肝癌和抗肝纤维化双重作用的中药制剂,可以针对病因——抑制乙肝病毒复制,并通过抗肝纤维化作用抑制癌前病变——肝硬化的形成,从而阻断肝癌的发生;该复方可抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞凋亡,发挥直接抗癌作用,是预防和治疗肝癌的有效中药制剂。为有效控制本品的内在质量,特对其中的特征性成分柯里拉京和丹酚酸B进行含量测定。本试验以柯里拉京和丹酚酸B为检测指标,建立了复方扶正柔肝颗粒HPLC含量测定方法。
岛津LC-10AT vp PLus型高效液相色谱仪(自动进样,SPD-20A检测器)。
柯里拉京对照品(中国药品生物制品检定所,批号111623-200301;供含量测定用);丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所,批号111562-200605;供含量测定用)。乙腈为色谱纯(DIKMARURE),水为怡宝纯化水,其余化学试剂均为分析纯。复方扶正柔肝颗粒由广州泽力医药科技有限公司生产(批次:T20140101, T20140501, T20140801)。
色谱柱为InertsiL® ODS-SP (5 μm, 4.6 mm × 250 mm);流动相:乙腈-0.2%磷酸(梯度洗脱,洗脱梯度如表1所示),检测波长为210 nm,流速为1 mL/min,柱温35℃,进样量5 μL。HPLC色谱图如图1所示。
分别精密称取柯里拉京对照品5.1 mg和丹酚酸B对照品42.0 mg,置50 mL棕色具塞容量瓶中,加50%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;精密吸取10 mL置50 mL量瓶中,加50%乙醇至刻度,摇匀,即得每1 mL含柯里拉京0.0204 mg,丹酚酸B 0.168 mg的对照品混合溶液。
取柯里拉京和丹酚酸B对照品混合溶液,分别吸取3、5、10、15、20、25μL注入高效液相色谱仪,测定。以柯里拉京和丹酚酸B对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。线性回归方程柯里拉京Y = 2054966X + 17329 (r = 0.9997),如图2所示;丹酚酸B Y = 1988937X + 44923 (r = 0.9999),如图3所示。由测定结果可知,柯里拉京在0.061~0.510 μg范围内,丹酚酸B在0.504~4.203 μg范围内线性关系良好(r柯里拉京 = 0.9997,r丹酚酸B = 0.9999)。
取复方扶正柔肝颗粒0.2 g (精密称定,批号T20140101),置锥形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,密塞,称定重量,超声处理20 min (全溶,呈澄清溶液),冷却至室温,再称定重量,50%乙醇补足重量,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜即得。
保留时间 t/min | 流动相A0.2% 磷酸(%) | 流动相B 乙腈(%) |
---|---|---|
0 | 89 | 11 |
25 | 89 | 11 |
30 | 76 | 24 |
55 | 76 | 24 |
60 | 5 | 95 |
表1. 梯度洗脱程序表
图1. 扶正柔肝颗粒HPLC含量测定色谱图
1) 精密度试验
精密称取扶正柔肝颗粒0.2005 g,置150 mL具塞锥形瓶内,精密移取50%乙醇50 mL,称重,超声20 min,使呈澄清溶液,冷却至室温,补重,0.45 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液,进样10 μL,测定,结果如表2所示。
由实验结果可知,柯里拉京及丹酚酸B的RSD值均在2%以内,说明仪器精密度良好。
2) 重复性试验
平行称取叶下珠复方II号颗粒六份(批号T20140101),每份0.2 g (精密称定),加至150 mL具塞锥形瓶内,精密称定为:a) 0.2005;b) 0.2008;c) 0.2003;d) 0.2007;e) 0.2005;f) 0.2004。精密移取50%乙醇50 mL加入锥形瓶内,称重,超声20 min,使呈澄清溶液,冷却至室温,相应溶剂补足失重,吸取溶液并过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液,六个平行样品分别进样10 μL,测定,结果如表3所示。
由实验结果可知,柯里拉京及丹酚酸B含量的RSD值均在2.5%以内,说明本法重现性良好。
图2. 柯里拉京标准曲线图
图3. 丹酚酸B标准曲线图
柯里拉京 | 丹酚酸B | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
保留时间 | RSD | 峰面积 | 含量/mg∙g−1 | RSD | 保留时间 | RSD | 峰面积 | 含量/mg∙g−1 | RSD | |
精密度-1 | 25.229 | 1.09% | 176,615 | 1.933 | 1.38% | 52.893 | 0.30% | 3,475,096 | 43.008 | 1.01% |
精密度-2 | 24.843 | 174,842 | 1.911 | 52.593 | 3,411,867 | 42.215 | ||||
精密度-3 | 24.779 | 177,427 | 1.943 | 52.594 | 3,502,207 | 43.348 | ||||
精密度-4 | 24.518 | 177,499 | 1.944 | 52.445 | 3,438,748 | 42.552 | ||||
精密度-5 | 24.521 | 176,398 | 1.930 | 52.506 | 3,427,804 | 42.415 | ||||
精密度-6 | 24.619 | 171,757 | 1.874 | 52.521 | 3,476,437 | 43.025 |
表2. 精密度试验结果
柯里拉京 | 丹酚酸B | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
保留时间 | RSD | 峰面积 | 含量/mg∙g−1 | RSD | 保留时间 | RSD | 峰面积 | 含量/mg∙g−1 | RSD | |
重复性-1 | 25.229 | 0.84% | 176,615 | 1.933 | 2.32% | 52.893 | 0.24% | 3,475,096 | 43.008 | 1.42% |
重复性-2 | 24.660 | 175,098 | 1.912 | 52.551 | 3,370,383 | 41.633 | ||||
重复性-3 | 24.725 | 173,695 | 1.899 | 52.576 | 3,445,516 | 42.680 | ||||
重复性-4 | 24.717 | 172,797 | 1.885 | 52.583 | 3,417,555 | 42.245 | ||||
重复性-5 | 24.753 | 175,081 | 1.914 | 52.603 | 3,438,134 | 42.545 | ||||
重复性-6 | 24.808 | 166,406 | 1.810 | 52.617 | 3,348,219 | 41.438 |
表3. 重现性试验结果
3) 稳定性试验
取同一批号供试品溶液各5 μL,分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入高效液相色谱仪测定。结果如表4所示。
由测定结果可知,柯里拉京峰面积的RSD为1.95%,丹酚酸B峰面积的RSD为1.37%,表明供试品溶液在24h内稳定。
4) 加样回收率试验
分别精密称取六份已知含量的扶正柔肝颗粒0.1 g (批号T20140101),分置50 mL容量瓶内;精密称定为a) 100.1 mg;b) 100.0 mg;c) 100.1 mg;d) 99.9 mg;e) 100.2 mg;f) 100.1 mg。分别精密移取对照品混合液(浓度:柯里拉京0.019 mg/mL,丹酚酸B 0.403 mg/mL的混合标准溶液)各10 mL加入六个容量瓶中,采用供试品的制备方法同法制备样品,得待测样品溶液。测定结果如表5所示。
由实验结果可知,柯里拉京和丹酚酸B的加样回收实验的回收率均在95%~105%之间,说明样品制备方法是合适的。
分别取三个不同批次的扶正柔肝颗粒,精密称定,按照“2.4”项下供试品溶液的制备,同法制备样品溶液,进样,测定,结果如表6所示。
柯里拉京 | 丹酚酸B | |||
---|---|---|---|---|
峰面积 | RSD | 峰面积 | RSD | |
稳定性-1 | 176,615 | 1.95% | 3,475,096 | 1.37% |
稳定性-2 | 177,427 | 3,502,207 | ||
稳定性-3 | 184,804 | 3,409,820 | ||
稳定性-4 | 177,733 | 3,399,709 | ||
稳定性-5 | 183,617 | 3,379,498 | ||
稳定性-6 | 181,789 | 3,439,900 |
表4. 稳定性试验结果
称样量/ mg | 柯里拉京 | 丹酚酸B | ||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
样品含量/mg | 加标量/mg | 检出量/mg | 回收率 | 均值% | RSD% | 样品含量/mg | 加标量/mg | 检出量/mg | 回收率 | 均值 | RSD% | |
100.1 | 0.1894 | 0.19 | 0.381 | 100.85 | 101.41% | 1.68 | 4.230 | 4.03 | 8.342 | 101.93 | 103.30 | 1.11 |
100.0 | 0.1892 | 0.19 | 0.379 | 99.89 | 4.226 | 4.03 | 8.343 | 102.06 | ||||
100.1 | 0.1894 | 0.19 | 0.386 | 103.49 | 4.230 | 4.03 | 8.401 | 103.33 | ||||
99.9 | 0.1890 | 0.19 | 0.384 | 102.64 | 4.222 | 4.03 | 8.414 | 103.84 | ||||
100.2 | 0.1896 | 0.19 | 0.378 | 99.17 | 4.234 | 4.03 | 8.420 | 103.67 | ||||
100.1 | 0.1894 | 0.19 | 0.384 | 102.43 | 4.230 | 4.03 | 8.470 | 104.96 |
表5. 加样回收率试验结果
批次 | 取样量/g | 柯里拉京含量mg/g | 均值 | 丹酚酸B含量mg/g | 均值 |
---|---|---|---|---|---|
T20140101 | 0.2005 | 1.8956 | 1.8928 (RSD = 0.15%) | 42.2416 | 42.2594 (RSD = 0.04%) |
0.2016 | 1.8930 | 42.2712 | |||
0.2035 | 1.8899 | 42.2655 | |||
T20140501 | 0.2050 | 1.9002 | 1.8956 (RSD = 0.29%) | 42.1388 | 42.2395 (RSD = 0.21%) |
0.2033 | 1.8969 | 42.2895 | |||
0.2012 | 1.8896 | 42.2901 | |||
T20140801 | 0.2040 | 1.9055 | 1.9023 (RSD = 0.24%) | 42.3025 | 42.1662 (RSD = 0.53%) |
0.2011 | 1.8971 | 42.2899 | |||
0.2022 | 1.9043 | 41.9062 |
表6. 三批次扶正柔肝颗粒含量测定结果
在测定指标的选择中,结合复方中各药味的功效主治并参考相关文献[
广东省重大科技专项(2012A080202009);广州市创新基金项目(2013J4400040)。
宋力飞,刘常青,李曼莎,阳建军,李常青. HPLC测定扶正柔肝颗粒柯里拉京和丹酚酸B的含量 Determination of Corilagin and Salvianolic Acid B in Fu Zheng Rou Gan by HPLC[J]. 药物资讯, 2015, 04(04): 43-49. http://dx.doi.org/10.12677/PI.2015.44006