玉米赤霉烯酮是镰刀霉毒素的代表,广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷物及其制品中。玉米赤霉烯酮污染食品和饲料后,将会带来严重的食品安全问题,威胁人类健康。近年来发展了很多分析检测玉米赤霉烯酮的方法,主要有薄层色谱法、(超)高效液相色谱法、高效液相色谱–质谱联用法、气相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法和时间分辨荧光免疫分析法。本文概述了这些检测方法的特点及应用,并分析了现有检测方法存在的问题和挑战。 Zearalenone is the representative of fusarium, which widely presents in moldy corn, sorghum, wheat, oats, barley and their products. The food and feed contaminated by zearalenone will lead to serious food security issues and threat to human health. In recent years, several determination methods of zearalenone have been developed, mainly including thin layer chromatography, (ultra) high performance liquid chromatography, high performance liquid chromatography—coupled with mass spectrometry, gas chromatography, capillary electrophoresis, enzymatic linked immu-nosorbent assay, colloidal gold immune chromatography and time-resolved fluorescence immu-noassay. This article outlines the features and applications of these determination methods, and analyzes the problems and challenges of the existing determination methods of zearalenone.
包懿1*,李智瑾2
1吉林省食品检验所,吉林 长春
2赤峰出入境检验检疫局,内蒙古 赤峰
收稿日期:2016年1月16日;录用日期:2016年2月1日;发布日期:2016年2月5日
玉米赤霉烯酮是镰刀霉毒素的代表,广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷物及其制品中。玉米赤霉烯酮污染食品和饲料后,将会带来严重的食品安全问题,威胁人类健康。近年来发展了很多分析检测玉米赤霉烯酮的方法,主要有薄层色谱法、(超)高效液相色谱法、高效液相色谱–质谱联用法、气相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法和时间分辨荧光免疫分析法。本文概述了这些检测方法的特点及应用,并分析了现有检测方法存在的问题和挑战。
关键词 :玉米赤霉烯酮,谷物,检测方法,研究进展
玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是污染粮食最广泛的真菌毒素之一,在谷物及其制品中都可检测到ZEN的存在 [
文献报道的检测方法主要有理化法和免疫法,包括薄层色谱法[
玉米赤霉烯酮,又称F-2毒素,白色晶体,是1962年由Stob等首次从霉变的玉米中分离得到的,1966年Urry首次阐明其结构,为一种酚的二羟基苯甲酸的内酯结构,化学名称为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯,英文名称为Zearalenone或[S-(E)]-3,4,5,6,9,10-Hexahydro-14,16-dihydroxy-3- methyl-1H-2-benzoxacyclotetradecin-1,7(8H)-dione,分子式为C18H22O5,结构式如图1所示,其耐热性较强,110℃下处理1小时以上才能被完全破坏。由于玉米赤霉烯酮是一种内酯的结构,因此在碱性环境的条件下可以将酯键打开,当碱的浓度下降时酯键可恢复。其熔点为 164℃~165℃,闪点6℃,不溶于水、二硫化碳和四氧化碳,溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和酸类,微溶于石油醚,在紫外光照射下其甲醇溶液呈现明亮的蓝绿色荧光。
玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌和其他镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素,广泛存在于玉米、小麦、高粱等谷物及其制品中,具有很强的生殖发育毒性和致畸作用,导致家禽和牲畜的生长缓慢和免疫抑制等,并能够通过食物链进入人体,产生血液和免疫毒性,并且其具有致癌活性可导致肿瘤,对人类健康带来巨大危害[
图1. 玉米赤霉烯酮的化学结构式
序号 | 样品前处理 | 检测方法 | 检测参数及特点 | 文献 |
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1 | 样品用乙酸乙酯等提取,振荡2小时,然后用氢氧化钠液–液萃取净化,三氯甲烷–甲醇或甲苯–乙酸乙酯–甲酸为展开剂 | 薄层色谱法 | 检出限为~50 ng/g,该方法的特点是简便、成本低、对检测人员和仪器设备要求低,但是其灵敏度也较低,适合定性或半定量检测。 | [ |
2 | 样品采用甲醇–水提取,C18小柱净化,反相高效液相色谱法测定 | (超)高效液相色谱法 | 高效液相色谱法检出限为0.5 µg/kg (超高效液相色谱法的检出限可低至5 pg),线性范围5.0 µg/L~146 g/L,加标回收率在80.0%~110.0%范围内。该方法特点是灵敏度高、定量准确、结果稳定,但是所需仪器设备昂贵,不适合大批样品的筛选。 | [ |
3 | 样品经乙腈–水提取,多功能净化柱净化,以甲醇–乙酸铵水溶液为流动相梯度洗脱,用色谱柱分离,以电喷雾负离子模式进行质谱测定 | 高效液相色谱–质谱联用法 | 检出限为0.08 µg/kg,加标平均回收率为85.4%~93.7%,定量限为0.2 µg/kg。该方法特点是灵敏度高、重现性好、准确可靠、定性定量兼顾和多组分同时检测等优点。 | [ |
4 | 样品经甲醇–氯化钠水溶液提取,减压浓缩,提取液经弗罗里硅土层析柱净化,洗脱液浓缩蒸干,TBT衍化,用气相色谱仪、毛细管柱、氢火焰检测器分析 | 气相色谱法 | 检出限为50 ng,平均回收率大于80%。该方法特点是灵敏、高选择性、准确性和精确性,但标准曲线线性关系不佳、样品进样的滞留、记忆效应以及基质干扰等。 | [ |
5 | 样品经甲醇–氯化钠水溶液提取,C18小柱净化后,甲醇洗脱,利用胶束电动毛细管电泳进行测定 | 毛细管电泳法 | 检出限为8.4 mg/mL,加标回收率为77.9%~103.1%。该方法快速、灵敏、需样量少,但稳定性和重现性不佳。 | [ |
6 | 样品经粉碎、提取、振荡、离心,取上清液并稀释 | 酶联免疫吸附测定法 | 检测限为41 µg/kg,加标回收率为80%~100%。该方法前处理简单、检测速度快结果准确性较高和特异性好,适合大批量样品的快速检测,无需昂贵的大型仪器设备。 | [ |
7 | 样品经粉碎、振荡提取、离心、取上清液、加入缓冲液混匀 | 胶体金免疫层析法 | 检出限为60 µg/kg,该方法操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、分析结果易于判定,适用于样品的现场快速检测。 | [ |
8 | 以玉米赤霉烯酮人工抗原包被96孔板为固相抗原,与样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN单抗,用稀土Eu3+离子标记羊抗鼠抗体进行失踪 | 时间分辨荧光免疫分析法 | 可测范围可以达到0.01~100 μg/L,灵敏度为0.01 μg/L。该方法简便、快速、经济,可进行大批量样品筛查,可测范围和稳定性均好于现有的酶联免疫吸附测定法。 | [ |
表1. 谷物中玉米赤霉烯酮的检测方法
薄层色谱法是最早建立的一种检测方法,特点是简便、成本低、对检测人员和仪器设备要求低,但是其灵敏度也较低,适合定性或半定量检测ZEN。原理是选择适合的提取溶剂对玉米赤霉烯酮等霉菌毒素进行提取,经过柱层析净化,在薄层板上层析展开、分离,利用霉菌毒素的荧光特性,根据荧光强弱与标准对比测定其含量。罗雪云等建立薄层色谱法于2005年被选作国标检测方法[
高效液相色谱法是国际上检测ZEN最常用的定量检测方法,原理是在合适的流动相条件下,采用固相萃取柱将霉菌毒素进行分离检测后,再通过测量色谱峰的面积计算含量。该方法的特点是灵敏度高、定量准确、结果稳定,但是所需仪器设备昂贵,不适合大批样品的筛选,为降低检出限和减少感染,通常需结合免疫亲和柱。免疫亲和柱–高效液相色谱法的检出限低,但是成本大大增加。免疫亲和柱净化原理是基于毒素与特异性抗体之间的相互作用,对ZEN具有高度专一的吸附特性。曾红燕等采用甲醇–水提取,C18小柱净化,反相高效液相色谱法测定了玉米、面粉、小麦样品中的玉米赤霉烯酮及其代谢物,该方法灵敏准确、稳定性好,对玉米赤霉烯酮的检出限为0.5 µg/kg [
超高效液相色谱法具有超高分离度、超快速度、超高灵敏度的特点,适用于微量快速分析。谢刚等人报道的利用超高效液相色谱法快速检测粮食中的玉米赤霉烯酮含量,其检出限为5 pg,从样品的前处理到分析整个过程小于45分钟,简便快速、灵敏度高、重现性好、溶剂用量少,适用于粮食中微量玉米赤霉烯酮的快速测定[
由于高效液相色谱–联用质谱法的检测灵敏度高、重现性好、准确可靠、定性定量兼顾和多组分同时检测等优点,近年来被广泛用于玉米赤霉烯酮等真菌毒素的检测。曾宪远等报道了用高效液相色谱–质谱联用法测定了包括玉米赤霉烯酮在内的五种真菌霉素[
气相色谱法具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点。但也存在如下问题:标准曲线线性关系不佳、样品进样的滞留、记忆效应以及基质干扰的存在。气相色谱法不及液相色谱法快速,检测费昂贵,技术和操作要求也高,所以在霉菌毒素检测方面的应用较少。陈必芳等将样品经甲醇–氯化钠水溶液提取,减压浓缩,提取液经弗罗里硅土层析柱净化和衍生化后,用气相色谱仪进行分析,最低检出限为50 ng [
毛细管电泳是一种新型的液相分离技术,与目前应用的高效液相色谱法相比,毛细管电泳法具有快速、灵敏、需样量少等优点,但由于毛细管的特性限制和检测技术上的难度,其稳定性和重现性有待于进一步提高。文献中关于用毛细管电泳法检测谷物中玉米赤霉烯酮含量的报道比较少。曾红燕等建立了粮食样品中玉米赤霉烯酮及其代谢物的毛细管电泳检测方法,他们将样品经过液–液超声提取,C18小柱净化后,利用胶束电动毛细管电泳进行测定,玉米赤霉烯酮的检出限为8.4 mg/mL [
酶联免疫吸附测定法采用竞争ELISA原理,在酶标板微孔条上预包被二抗,样品中的毒素和该毒素的酶标抗原竞争抗体,同时抗体与二抗结合,经四甲基联苯胺底物显色,样本吸光值与其含有的毒素成负相关,与标准曲线比较再乘以稀释倍数,即得出样品中毒素的含量。酶联免疫吸附测定法具有准确、可靠、快速、灵敏度高和特异性好的特点,适合大批量样品的快速检测,无需昂贵的大型仪器设备。酶联免疫吸附测定试剂盒需在低于4 °C条件下保存,且保存时间通常为几个月,保存不当或超过保存期限将影响试剂盒的稳定性和检测结果。戚红卷等报道了利用酶联免疫吸附测定法检测米面中的真菌毒素(包括ZEN),其最低检测限为41 µg/kg,并且检测速度快,标准曲线线性良好,检测结果准确性高[
胶体金免疫层析法是将免疫胶体金技术与层析技术结合起来建立的一种快速免疫学检测技术,具有操作简便、快速、无需复杂仪器、特异性强、稳定性较好、成本低、分析结果易于判定等特点,适用于大批样品的现场快速检测。玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试纸主要由底板、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫组成。利用膜的毛细效应,将特异性抗原(或抗体)固定于膜上作为检测带,胶体金标记物在玻璃纤维的结合释放垫上,其一端连接膜,一端连接样品垫,当加入样品后,样品通过扩散作用向前移动通过含标记物的玻璃纤维,与胶体金标记物反应,之后继续向前移动至检测线,这样标记物与待测物的反应产物就会被检测线捕获,呈现明显的可观测结果。Anna等报道的利用胶体金层析法在10分钟内有效检测出样品中的玉米赤霉烯酮,检出限为100 µg/kg [
时间分辨荧光免疫分析属于超微量检测领域中一项新兴的检测技术。原理是以荧光强度高且衰变时间长的三价稀土离子为标志物来延缓测量时间,等样品中短寿命的自然荧光衰变后再测稀土离子的荧光,可消除自然荧光的干扰,可测范围可以达到0.01~100 μg/L,既可以满足低浓度的限量要求,也可以满足较宽范围的定量检测要求,是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法。屠蔷等采用时间分辨荧光免疫分析法建立了高灵敏的ZEN间接竞争免疫分析法,以玉米赤霉烯酮人工抗原包被96孔板为固相抗原,与样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN单抗,用稀土Eu3+离子标记羊抗鼠抗体进行失踪,该方法的灵敏度为0.01 μg/L [
综上所述,目前文献报道的谷物中玉米赤霉烯酮的定量分析检测方法各有利弊。常用的高效液相色谱法和高效液相色谱–质谱联用法灵敏度高、结果稳定,但是所需仪器设备昂贵,不适合大批样品的现场快速检测。基于免疫学的测定方法简便快捷、无需大型检测仪器和标准品,通常在数分钟内就能得到检测结果,适用于大批样品的现场快速检测,但灵敏度高和结果稳定性不如高效液相色谱法和高效液相色谱–质谱联用法,存在假阳性的情况,需要进一步的研究来完善此类方法。对于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的检测方法的发展趋势是绿色检测技术,现有的检测技术大多要以霉菌毒素标准品来建立标准曲线,对检测的安全带来了很大隐患,此外检测过程中的提纯和分离需要用到大量的有机溶剂,对环境污染很大。绿色检测技术的标准是高灵敏度、高特异性、绿色、经济和快速便捷。
包 懿,李智瑾. 谷物中玉米赤霉烯酮检测方法的研究进展 Research Progress on the Determination Methods of Zearalenone in Grain[J]. 分析化学进展, 2016, 06(01): 7-13. http://dx.doi.org/10.12677/AAC.2016.61002