植物组织培养技术是一门实用性非常强的现代生物技术。自根幼态无性系是橡胶树新一代种植材料,与传统芽接苗相比具有高产速生的特点,其推广应用正是建立在规模化组培繁殖体系上的。然而,组培生产过程中杂菌污染是造成生产成本高的主要原因之一。本研究通过分子鉴定的方法确认橡胶树组织培养中最主要的污染源是黑曲霉、杂色曲霉等。我们发现苯甲酸钠和山梨酸钾以及益生菌哈茨木霉菌株13-3-2可以用于降低污染率。添加3%的苯甲酸钠或山梨酸钾的培养基可有效防止细菌及部分真菌(包括黑曲霉)污染;在后期驯化练苗过程中,接种的哈茨木霉菌13-3-2可有效杀死多种污染真菌,使污染苗的成活率提高43%以上。该研究结果将用于降低生产橡胶树组培苗的生产成本,加快橡胶树优良品种或材料在橡胶树生产中的应用。 Tissue culture is a practical technique of modern biotechnology. Self-rooting juvenile clones of rubber tree is a new type material for field planting, which has characters of higher yielding and faster growth, compared with previous budded rubber trees, and its quicker propagations are based on tissue culture. However, contamination during tissue culture progress has been one key reason for higher cost. In this study, the main causal agents were identified by molecular method to be Aspergillus niger and Aspergillus versicolor. Chemicals such as potassium sorbate or sodium benzoate and biological agents as Trichoderma harzianum strain 13-3-2 were suggested to reduce the rate of contamination. 3% sodium benzoate or potassium sorbate were found effective in killing or inhibiting contaminated bacteria and some of the contaminated fungi, including the pre- dominant A. niger. During the later periods when seedlings acclimated, Tri. harzianum 13-3-2 was found so useful of killing miscellaneous agents that the live rate of contaminated seedlings could be enhanced by 43%. These results will be used for reducing cost in mass tissue culture production and fastening the propagation or utilization of elite rubber tree clones or materials.
秦云霞1,周慧珍2,成镜1,阳江华1,胡彦师1,唐朝荣1*
1中国热带农业科学院橡胶研究所,农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室,海南 儋州
2海南大学热带农林学院,海南 儋州
收稿日期:2017年5月6日;录用日期:2017年5月24日;发布日期:2017年5月27日
植物组织培养技术是一门实用性非常强的现代生物技术。自根幼态无性系是橡胶树新一代种植材料,与传统芽接苗相比具有高产速生的特点,其推广应用正是建立在规模化组培繁殖体系上的。然而,组培生产过程中杂菌污染是造成生产成本高的主要原因之一。本研究通过分子鉴定的方法确认橡胶树组织培养中最主要的污染源是黑曲霉、杂色曲霉等。我们发现苯甲酸钠和山梨酸钾以及益生菌哈茨木霉菌株13-3-2可以用于降低污染率。添加3%的苯甲酸钠或山梨酸钾的培养基可有效防止细菌及部分真菌(包括黑曲霉)污染;在后期驯化练苗过程中,接种的哈茨木霉菌13-3-2可有效杀死多种污染真菌,使污染苗的成活率提高43%以上。该研究结果将用于降低生产橡胶树组培苗的生产成本,加快橡胶树优良品种或材料在橡胶树生产中的应用。
关键词 :橡胶树组织培养,污染,杂色曲霉,黑曲霉,苯甲酸钠,山梨酸钾,哈茨木霉
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植物组织培养技术是一门实用性非常强的现代生物技术,被广泛地应用于各个领域,在科研与生产上都具有广泛的应用价值 [
苯甲酸钠和山梨酸钾具有低廉的价格和广谱的抑菌效果而成为食品、药品、化妆品的首选防腐剂 [
木霉菌(Trichoderma spp.)是一类重要的多功能益生真菌 [
苯甲酸钠和山梨酸钾(国药集团化学试剂有限公司),化学纯。黑曲霉是我们从污染的平板上分离并进行形态和测序鉴定。哈茨木霉13-3-2 (保藏号为CGMCC No. 13163)和哈茨木霉5P-3 (保藏号为CGMCC No. 13164),本实验室鉴定并保藏于中国菌种保藏中心。污染平板及污染的热研7-33-97自根无性系的组培试管苗来自于中国热带农业科学院试验场九队,国家天然橡胶种植圃内组培苗大量生产工作室。
用孟加拉红培养基分离培养各个污染菌。用CTAB方法提取污染真菌的基因组DNA。用通用引物ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增污染真菌的18S rDNA-ITS序列,PCR反应体系是25 µL:Taq酶0.20 µL、10 xbuffer 2.5 µL、dNTP 0.2 µL、10 µL的primer各0.3 µL,ddH2O 21.5 µL,DNA模板25 ng。扩增片段克隆后送由上海生物技术有限公司进行测序。
取经28˚C培养4天的黑曲霉,加5 ml无菌水洗下霉菌孢子,依次10倍稀释为10−3, 使孢子数约为103个/ml。
在配置1/2 PDA + 5 g酵母粉固体培养基时,分别加入苯甲酸钠或山梨酸钾,使其质量浓度分别为(3%、2%、1.0%、0.5%和0),高压蒸汽灭菌(121˚C,20分钟)备用。
分别精确称取苯甲酸钠和山梨酸钾各2.5 g混合即复合配伍为1:1,称取苯甲酸钠2.0 g、山梨酸钾3.0 g混合,即复合配伍为2:3;称取苯甲酸钠3.0 g、山梨酸钾2.0 g混合,即复合配伍为3:2。将3种配比的混合物加入培养基中,制备质量浓度为3.0、2.0、1.0、0.5、0 g/L的培养基用于分析它们对黑曲霉、炭疽菌等的抑制或杀菌效果。
苯甲酸钠和山梨酸钾对真菌抑菌效果的评价方法有两种:一是测量真菌菌丝生长速度受抑制率来判断;一是取0.1 ml稀释好的浓度为103个/ml分生孢子稀释液加入抑菌培养基平皿中,涂板,于28˚C培养,第2~3天观察和统计孢子萌发生长情况。
哈茨木霉13-3-2在1/2玉米粉(CMA, corn meal agar) + PDA培养基上生长7天,将分生孢子用灭菌ddH2O洗下来,并用PDB + 1/2MS无机盐溶液稀释为浓度107个/ml备用。
为了考察哈茨木霉13-3-2是否能够挽救被污染的橡胶组培苗,分别于2016年12月和2017年2月接种两次。我们选用生长势相对一致的被污染的热研7-33-97橡胶组培苗600株进行了接种试验。处理组每一个试管内接种哈茨木霉13-3-2分生孢子数量为107个/ml的营养液1 ml (用PDB + 1/2MS无机盐溶液配制),对照组的每一个试管内加入等量不添加哈茨木霉13-3-2分生孢子的PDB + 1/2MS无机盐溶液。
根据污染源出现的频率和污染源在培养基上的表型,挑取了6个进行分离接种,命名为R1-R6,又根据它们在孟加拉红培养基上的表型合并为四个,分别为R1,R3,R5和R6。它们的ITS扩增片段大小约分别为590 bp、607 bp、624 bp和644 bp,利用NCBI blast序列比较,发现它们与同源基因的rDNA-ITS区序列相似性为98%~100%。下载同源基因的fasta序列,利用软件ClustaX (1.81版本)进行序列比对分析,采用Neighbor-Joining方法进行聚类分析,进行1000次bootstrap统计学检验(图1),得到结果。R5与KY354579.1 Aspergillus niger黑曲霉归为一类,R3与KX961206.1 Penicillium青霉菌归为一类;R6与KT336515聚一起,属于哈茨木霉菌;R1与FJ878627.1、KJ082097.1、KJ527011.1聚为一组,属于Aspergillus versicolor杂色曲霉(又名采色曲霉和变色曲霉)。
KY354579.1 Aspergillusniger黑曲霉;KX961206.1 Penicillium青霉菌;FJ878627.1 Aspergillus versicolor采色曲霉,杂色曲霉,变色曲霉;KT336515 Trichoderma harzianum isolate
其中黑曲霉R5污染所占比例在50%以上是本研究的重点对象。
图1. 污染真菌ITS序列的进化分析
利用PDA固体培养基,用稀盐酸或氢氧化钾调节培养基的pH分别为3、5、7、9、11和12,接种黑曲霉菌块(菌块带有分生孢子),第三天观察观察黑曲霉的生长情况。结果表明在pH = 7~9的培养基上,黑曲霉生长最好,在pH < 5的培养基上,黑曲霉孢子的萌发率低于50%,在pH = 11~12培养基上,黑曲霉孢子也能生长(图2),可见黑曲霉对pH的适应性广,适应能力强。黑曲霉分生孢子大小在放大1000倍下,(Leica DMLB,油镜下拍摄)平均长度为在1~1.35微米。
培养基中添加不同含量的苯甲酸钠和山梨酸钾的试验结果表明1.0%的苯甲酸钠可以完全抑制黑曲霉菌丝的生长(图3(B));1.0%的苯甲酸钠可明显抑制黑曲霉分生孢子的萌发,2.0%~3.0%可以完全抑制其萌发(图3(C),表1)。同样质量浓度,且配比为1:1的苯甲酸钠和山梨酸钾对黑曲霉生长的抑制效果不如单一的苯甲酸钠(图3(D),其它配比2:3,3:2的效果更差,略)。3.0%苯甲酸钠才能完全抑制青霉的菌丝生长和孢子的生长(图3(E))。哈茨木霉5P-3和13-3-2可以显著抑制黑曲霉的快速生长(图3(F)),在对峙生长中,黑曲霉及其分生孢子的生长被明显抑制,哈茨木霉5P-3的抑制率达75.0%,哈茨木霉13-3-2的抑制率为85.7% (图3(F))。
图2. 黑曲霉的分生孢子及其在不同pH培养基上生长情况
苯甲酸钠浓度g/L | 0 (CK) | 0.5% | 1% | 2% | 3% |
---|---|---|---|---|---|
黑曲霉孢子萌发率% | 100 | 70 ± 5 | 40 ± 2 | 0 | 0 |
青霉孢子萌发率% | 100 | 60 ± 3 | 30 ± 2 | 5 ± 2 | 0 |
黑曲霉菌丝生长抑制率% | 2.9 ± 0.3 cm | 0.75 ± 0.10 cm | 0 | 0 | 0 |
杂色曲霉菌丝生长抑制率% | 1.70 ± 0.10 cm | 0.95 ± 0.10 cm | 0 | 0 | 0 |
表1. 苯甲酸钠和山梨酸钾对黑曲霉、杂色曲霉和青霉生长的影响
注:表中数据为3次独立试验,数值结果为培养3天的平均值
图3. 苯甲酸钠、山梨酸钾、哈茨木霉等对黑曲霉生长的影响
品种 | 污染株数/株 | 处理时间/d | 练苗成活株数/株 | 死亡率/% | 成活率/% |
---|---|---|---|---|---|
热研7-33-97 | 300 | 10 | 288 ± 5 | 4.1 | 95.9 |
对照 | 300 | 10 | 142 ± 8 | 47 | 53 |
表2. 污染的热研7-33-97组培苗用哈茨木霉13-3-2处理后成活率显著提高
注:表中数据为2次独立试验结果
选用污染的热研7-33-97组培试管苗于同一时间按照方法2.2.7所述,接种营养液或哈茨木霉菌孢子液,10天后移栽温室沙床,移栽10天后统计结果如表2所示。没有处理的污染苗死亡率达到47.0%,而处理后的达到95.9%,污染苗的成活率提高约43.0% (表2)。
通过单菌分离及分子鉴定结果表明:黑曲霉和杂色曲霉是热带地区橡胶树组织培养过程中最常见和最主要的污染源,青霉和哈茨木霉次之(图1)。研究发现黑曲霉最适温度是33˚C~37˚C (在45˚C下处理6小时的培养基上还能生长),最低相对湿度为88%,适应在高温、高湿环境下生长,而且生成黑曲霉的分生孢子小1.0~1.35 μm (图2),易扩散,生命力强,这些特性可能是该菌成为橡胶树组培中最主要的污染源的原因。由于降低成本和简化操作是植物组织培养科研工作者和大量商业繁育苗木时所追求的共同目标 [
该研究得到海南省自然科学基金项目(20153213)的支持,国家橡胶树种质资源圃提供材料。
秦云霞,周慧珍,成镜,阳江华,胡彦师,唐朝荣. 橡胶树组培苗常见污染源的鉴定及防除方法Predominant Contamination Agents in Rubber Tree Tissue Culture and Its Elimination[J]. 植物学研究, 2017, 06(03): 167-174. http://dx.doi.org/10.12677/BR.2017.63022