目的:研究超声辅助提取竹茹总黄酮的最佳工艺条件。方法:在单因素试验基础上,选取乙醇浓度、料液比、超声功率及超声时间为影响因素,采用中心组合实验设计,以竹茹总黄酮提取率为响应值进行响应面分析。结果最佳工艺条件为:乙醇浓度67%、料液比1:25、超声功率330 W、超声时间26 min,竹茹总黄酮得率为3.557%。结论:该工艺提取率高、操作简便,可为竹茹总黄酮的提取提供参考。 Objective: To optimize of ultrasonic-assisted extraction technology of total flavonoids from Bambusae caulis in taenias based on response surface methodology. Method: On the basis of single-factor experiment, four parameters including ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic power and ultrasonic time were selected as influencing factors and the optimum conditions for total flavonoids extract were obtained through Box-Behnken center united experiment designed by response surface methodology. Results: The optimum conditions were as follows; the ethanol concentration was 67%; the solid-liquid ratio was 1:25; the ultrasonic power was 330 W and the ultrasonic time was 26 min. Under the conditions, the extraction rate of total flavonoids could be reached to 3.557%. Conclusion: This method is simple, rapid and reliable which could provide reference for the producing of total flavonoids from Bambusae caulis in taenias.
管红梅,吴冲,姜登钊*
九江学院药学与生命科学学院,江西 九江
收稿日期:2017年6月12日;录用日期:2017年6月26日;发布日期:2017年7月4日
目的:研究超声辅助提取竹茹总黄酮的最佳工艺条件。方法:在单因素试验基础上,选取乙醇浓度、料液比、超声功率及超声时间为影响因素,采用中心组合实验设计,以竹茹总黄酮提取率为响应值进行响应面分析。结果最佳工艺条件为:乙醇浓度67%、料液比1:25、超声功率330 W、超声时间26 min,竹茹总黄酮得率为3.557%。结论:该工艺提取率高、操作简便,可为竹茹总黄酮的提取提供参考。
关键词 :竹茹,总黄酮,超声辅助,响应面法
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http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
竹茹(Bambusae caulis in taenias)为禾本科植物青秆竹Bambusatuldoides Munro、大头典竹Sinoca- lamusbeecheyanus (Munro) McClure var. pubescens P. F. Li或淡竹Phyllostachysnigra (Lodd.) Munro var. henonis (Mitf.) Stapf ex Rendle的茎秆的干燥中间层 [
竹茹为江西省樟树市庆仁中药饮片有限公司生产饮片,经九江学院刘可越教授鉴定为淡竹Phyllostachysnigra (Lodd.) Munro var. henonis (Mitf.) Stapf ex Rendle茎秆的干燥中间层。芦丁对照品购自大连美仑生物技术有限公司(含量≥98%),95%乙醇,亚硝酸钠,氢氧化钠,硝酸铝均为分析纯试剂。
SB25-12DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司);JSP-200型高速多功能粉碎机(浙江永康市金穗机械制造厂);GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);EV341旋转蒸发仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司);UV9100全自动紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器股份有限公司);BS224S电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。
精密称取芦丁对照品10.0 mg,置25 ml容量瓶中,加入80%乙醇溶液定容,得到400 µg/ml的芦丁母液。精密吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁标准液于10 ml容量瓶内,各加80%乙醇至5 ml,5%的NaNO2 0.5 mL,摇匀静置6 min,加入10%的Al(NO3)3 0.5 mL,摇匀静置6 min,加入4%的NaOH4 mL,摇匀静置15 min [
以料液比(1:10,1:15,1:20,1:25,1:30)、乙醇浓度(40%,50%,60%,70%,80%)、超声功率(120,180,240,300,360W)、超声时间(10,15,20,25,30 min)为因素进行单因素实验,考察各个因素分别对竹茹总黄酮得率的影响。
在单因素实验基础上,采用中心组合(Box-Behnken)试验设计方法,确定自变量,以竹茹总黄酮得率为响应值,采用响应面分析法安排实验以获取最佳提取条件,并用Design-Expert 8.0软件进行数据分析,实验设计因素水平见表1。
精密称取竹茹粉末3.00 g (平行3份),根据2.3所得最佳提取工艺条件下提取竹茹总黄酮,计算总黄酮提取率。
图1. 芦丁标准曲线
水平 | 因素 | |||
---|---|---|---|---|
A料液比(1:X) | B乙醇浓度(%) | C超声功率(W) | D超声时间(min) | |
−1 | 20 | 60 | 240 | 20 |
0 | 25 | 70 | 300 | 25 |
1 | 30 | 80 | 360 | 30 |
表1. 响应面分析试验设计因素和水平
在超声时间15 min、乙醇浓度60%、超声功率240 W的条件下,考察料液比(1:10,1:15,1:20,1:25,1:30)对竹茹总黄酮提取率的影响,实验结果见图2。由图2可见,随料液比的增加,竹茹总黄酮提取率明显升高,当料液比大于1:25 (g/mL)时,提取率增加趋于平缓。
在超声时间15 min,超声功率240 W,料液比1:20的条件下,考察乙醇浓度(40%,50%,60%,70%,80%)对竹茹总黄酮得率的影响,实验结果见图3。由图3可见,随着乙醇浓度的提高,竹茹总黄酮的提取率也随之升高,70%乙醇的提取率最高。
在乙醇浓度60%,超声时间15 min,料液比1:20的条件下,考察超声功率(120,180,240,300,360 W)对竹茹总黄酮提取率的影响,实验结果见图4。由图4可见,随超声功率的增加,竹茹总黄酮提取率明显升高,当超声功率大于300 W时,提取率增加趋于平缓。
图2. 料液比对竹茹总黄酮的提取影响
图3. 乙醇浓度对竹茹总黄酮的提取影响
图4. 超声功率对竹茹总黄酮的提取影响
在乙醇浓度60%,超声功率240 W,料液比1:20的条件下,考察超声时间(10,15,20,25,30 min)对总黄酮得率的影响,实验结果见图5。由图5可见,随着超声时间的增加,竹茹总黄酮提取率先升高后降低,提取时间为25 min时达到最高值。
响应面Box-Behnken实验设计及结果见表2,回归模型方差分析结果见表3。由表3的方差分析可知,模型的F检验结果P < 0.01,为差异有统计学意义;失拟度得出的F检验结果P > 0.05,为差异无统计学意义,这两者说明实验数据与模型相符,模型选择正确;各项的方差分析表明C,A2,B2,C2对总黄酮得率有显著的影响。各个因素对类黄酮提取率影响的程度大小的次序为超声功率>乙醇浓度>超声时间>料液比。
以竹茹总黄酮的提取率Y为响应值,各因素经回归拟合后的二次多项回归方程为:
根据回归方程作响应面和等值线图,见图6和图7。等高线图同一曲线上总黄酮得率相同,图形中心得率最高。两因素之间交互作用可以直观的通过中心区域的等值线圆形程度和位置来判断,等值线圆形形状越扁,且越偏离中心位置交互作用越大,对总黄酮得率的影响越显著。
对实验模型分析,得出最佳料液比为1:24.86,乙醇溶度为67.63%,超声功率为330.78 W,超声时间为25.86 min,求得理论总黄酮得率为3.495%。将条件修正料液比为1:25,乙醇溶度为68%,超声功率为330 W,超声时间为26 min,并在此条件下进行验证试验,平行三次,测得竹茹总黄酮提取率平均值为3.557%,与理论值相对误差为1.77% [
本研究采用响应面法优化超声辅助提取竹茹总黄酮的生产工艺。响应面法采用多元二次回归方法作为函数估算工具,利用多项式近似拟合多因子实验中因素和指标的相互关系,并对函数的等高线和响应面进行分析,研究响应面和因子,因子和因子之间的相互关系 [
图5. 超声时间对竹茹总黄酮的提取影响
序号 | 料液比(A) | 乙醇浓度(B) | 超声功率(C) | 超声时间(D) | 总黄酮提取率(%) (Y) |
---|---|---|---|---|---|
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.338 |
2 | 0 | −1 | −1 | 0 | 2.729 |
3 | −1 | −1 | 0 | 0 | 2.723 |
4 | −1 | 0 | 0 | −1 | 2.645 |
5 | 0 | 1 | 0 | −1 | 3.243 |
6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.296 |
7 | −1 | 0 | −1 | 0 | 2.205 |
8 | 1 | 1 | 0 | 0 | 2.507 |
9 | 1 | −1 | 0 | 0 | 2.588 |
10 | 0 | 0 | −1 | −1 | 2.500 |
11 | 0 | 0 | −1 | 1 | 2.784 |
12 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3.113 |
13 | 0 | 1 | −1 | 0 | 2.286 |
14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.338 |
15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.478 |
16 | 0 | 0 | 1 | −1 | 2.928 |
17 | −1 | 0 | 0 | 1 | 2.886 |
18 | −1 | 0 | 1 | 0 | 3.302 |
19 | 1 | 0 | −1 | 0 | 2.450 |
20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.529 |
21 | 1 | 0 | 0 | 1 | 2.775 |
22 | 0 | −1 | 0 | 1 | 3.244 |
23 | 1 | 0 | 0 | −1 | 2.642 |
24 | −1 | 1 | 0 | 0 | 2.282 |
25 | 0 | 1 | 0 | 1 | 2.931 |
26 | 0 | 1 | 1 | 0 | 2.785 |
27 | 0 | −1 | 1 | 0 | 3.172 |
28 | 1 | 0 | 1 | 0 | 3.343 |
29 | 0 | −1 | 0 | −1 | 3.200 |
表2. 响应面Box-Behnken实验设计及结果
变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | |
---|---|---|---|---|---|---|
模型 | 3.2901 | 10 | 0.3290 | 6.7663 | 0.0002 | 显著 |
A-料液比 | 0.0057 | 1 | 0.0057 | 0.1176 | 0.7356 | |
B-乙醇浓度 | 0.2192 | 1 | 0.2192 | 4.5088 | 0.0478 | 显著 |
C-超声功率 | 1.1340 | 1 | 1.1340 | 23.322 | 0.0001 | 显著 |
D-超声时间 | 0.0275 | 1 | 0.0275 | 0.5666 | 0.4613 | |
AB | 0.0324 | 1 | 0.0324 | 0.6663 | 0.4250 | |
AC | 0.0104 | 1 | 0.0104 | 0.2139 | 0.6492 | |
A2 | 1.3548 | 1 | 1.3548 | 27.863 | <0.0001 | 显著 |
B2 | 0.5427 | 1 | 0.5427 | 11.162 | 0.0036 | 显著 |
C2 | 0.5872 | 1 | 0.5872 | 12.078 | 0.0027 | 显著 |
D2 | 0.1255 | 1 | 0.1255 | 2.5829 | 0.1254 | |
残差 | 0.8752 | 18 | 0.0486 | |||
失拟项 | 0.8341 | 14 | 0.0595 | 5.7926 | 0.0512 | 不显著 |
纯误差 | 0.0411 | 4 | 0.0102 | |||
总变异 | 4.1653 | 28 |
表3. 回归模型方差分析结果
图6. 料液比和乙醇浓度对竹茹总黄酮提取率交互作用的响应面图和等高线
图7. 料液比和超声功率对竹茹总黄酮提取率交互作用的响应面图和等高线
设计可以评价指标和因素间的非线性关系,对实验影响因素的研究更为全面,能够精确反映提取工艺的最佳条件,并能从图形分析寻求最优实验考察因素值,具有周期短,回归方程精度高,条件预测性好等优点,对于非线性影响因素的预测指导性更强,因此具备更好的推广应用价值 [
本研究采用4因素3水平响应面法对竹茹总黄酮的提取工艺进行优化,最终确定了最佳提取条件,验证实验测得竹茹总黄酮提取率平均值为3.557%,与理论值相对误差为1.77%,充分验证了所建立的模型的正确性。实验表明超声辅助提取竹茹总黄酮效率高、操作简便,可为其生产及进一步研究提供参考。
管红梅,吴 冲,姜登钊. 响应面法优化超声辅助竹茹总黄酮提取工艺研究Optimizing of Ultrasonic-Assisted Extraction Technology of Total Flavonoids from Bambusae caulis in Taenias Based on Response Surface Methodology[J]. 药物资讯, 2017, 06(03): 63-71. http://dx.doi.org/10.12677/PI.2017.63011