糖尿病是世界上发病率最高的疾病之一。目前,检测糖化血红蛋白已经成为糖尿病监控的标准诊断方法。血红蛋白在人体中承担着重要作用,是主要担负着运载氧的功能的大分子蛋白质,糖尿病患者过高的血糖会诱使葡萄糖和血红蛋白结合,生成没有功能的糖化血红蛋白,影响血液的输氧能力,因此血液中的糖化血红蛋白的检测意义重大。临床实验室常用的测定糖化血红蛋白的方法有30多种,根据反应原理的不同可分为两大类:第一类基于GHb与非GHb的电荷不同,包括离子交换色谱法、电泳法、等电聚焦法等;第二类基于GHb的结构特点,包括亲和色谱法、离子捕获法、免疫法等。本文主要对临床常用的糖化血红蛋白检测方法进行了综述。 Diabetes mellitus is one of the highest morbidity in the world. At present, the detection of glyco-sylated hemoglobin has become the standard diagnostic method of diabetes monitoring. Hemo-globin plays an important role in human body, as a macromolecular protein which is mainly re-sponsible for carrying oxygen. And the combination of high blood glucose in patients with diabetes will induce glucose and hemoglobin in HbA1c generation function, blood oxygen capacity, so the determination of glycosylated hemoglobin in blood shows great significance. There are more than 30 methods used for the determination of glycosylated hemoglobin in clinical laboratories. According to the principle of the reaction, which can be divided into two categories, the first category is based on the different charge of GHb and non GHb, including ion exchange chromatography, electrophoresis, isoelectric focusing, etc. The second category is based on the structural characteristics of GHb, including affinity chromatography, ion capture, immunization, etc. This article overviewed detection methods of glycosylated hemoglobin in clinical practice.
黄宗利,甘志荣,兰万,侯嘉婷,冯小珍,韩国成*
桂林电子科技大学生命与环境科学学院,广西 桂林
收稿日期:2017年7月3日;录用日期:2017年7月28日;发布日期:2017年7月31日
糖尿病是世界上发病率最高的疾病之一。目前,检测糖化血红蛋白已经成为糖尿病监控的标准诊断方法。血红蛋白在人体中承担着重要作用,是主要担负着运载氧的功能的大分子蛋白质,糖尿病患者过高的血糖会诱使葡萄糖和血红蛋白结合,生成没有功能的糖化血红蛋白,影响血液的输氧能力,因此血液中的糖化血红蛋白的检测意义重大。临床实验室常用的测定糖化血红蛋白的方法有30多种,根据反应原理的不同可分为两大类:第一类基于GHb与非GHb的电荷不同,包括离子交换色谱法、电泳法、等电聚焦法等;第二类基于GHb的结构特点,包括亲和色谱法、离子捕获法、免疫法等。本文主要对临床常用的糖化血红蛋白检测方法进行了综述。
关键词 :糖尿病,标准诊断,血红蛋白,糖化血红蛋白,检测
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糖尿病是世界上发病率最高的疾病之一,仅次于心脑血管疾病和肿瘤,并且其发病率还在不断的上升,它是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致的以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官受损,特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭,是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。血糖、葡萄糖耐量实验(OGTT)是国际公认的诊断糖尿病的指标,2010年美国糖尿病协会(ADA)又将糖化血红蛋白(HbA1c)纳入了糖尿病的诊断标准 [
糖化血红蛋白(Glycated Hemoglobin,简称GHb)是由红细胞中血红蛋白与葡萄糖经非酶促糖化缓慢形成的,该反应持续且不可逆,形成两周后不易分开。GHb的体内合成受红细胞中葡萄糖浓度的影响,在正常的生理条件下,非酶促糖化反应产物生成量与反应物浓度成正比,当血液中葡萄糖浓度较高时,人体所形成糖化血红蛋白的含量也会相对较高。由于蛋白质浓度相对稳定,糖化水平主要取决于葡萄糖的浓度,同时与蛋白质和葡萄糖接触的时间长短也有关。人体内红细胞的生命周期一般为120天,在红细胞死亡之前,血液中糖化血红蛋白含量是保持相对不变的,因此糖化血红蛋白水平可以反映前120天内的平均血糖水平,而与病人抽血时间,是否空腹,是否使用胰岛素等因素无关,是判定糖尿病长期控制的重要指标。HbA1c是评价血糖控制好坏的重要标准,它是血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白,约占糖化血红蛋白的65%左右,结构稳定。因此,糖化血红蛋白的检测对于糖尿病的监测来说具有一定的说服力、稳定性也较好,它能反映糖尿病患者2到3个月以内血糖的控制情况,在糖尿病学上有很大的临床参考价值 [
糖化血红蛋白的增高会对人体有多方面影响,它会加剧心、脑血管疾病、导致肾病等 [
糖化血红蛋白是红细胞中血红蛋白与葡萄糖经非酶促的不可逆反映的产物,主要是通过血红蛋白β链N-末端的撷氨酸被糖化而形成的,因此血红蛋白的测定是一个重要内容。目前,随着检验技术的飞速发展和医疗器械的不断改进,血红蛋白含量检测方法主要有以下几种测定方法。
1) 比重法 [
2) 比色法 [
3) 分光光度法 [
4) 库尔特电阻抗法:该法较比重法、比色法测定结果精确可靠,而比分光光度法等在实验室技术成本、难度高、安全无创伤,适用于大型医院。它的操作简单易行,对儿童、老人、病人等测定血红蛋白更为实用。缺点:一般家庭不能普遍使用,试剂条费用比较高,应用仍有局限性。
5) 电化学分析检测法:此法具有快速、不破坏样品、易于自动化等优点,主要包括① 裸银电极 [
以各种染料作为媒介体的修饰电极对血红蛋白的电化学性质进行了研究。这些染料主要起到在电极上与血红蛋白之间传递电子的作用,多具有氧化还原活性,其在电极上的固定方法有吸附、共价桥联、聚合或电沉积,已用的基体电极有玻碳、石墨、碳糊、碳纤维、铂、银电极等。Brett [
上世纪50年代以来,二茂铁(Ferrocene, Fc)的稳定性、结构和成键状况的独特性引发了科学家们的浓厚兴趣,有关二茂铁及其衍生物的合成、结构及性能的研究成为现代化学中的一个热点。二茂铁具有夹心结构和芳香性的高度富电子特性,具有易受环境影响的可逆氧化还原特点。利用二茂铁基团可逆的氧化还原性,使得控制其衍生物的电光学性成为可能,从而实现氧化还原的开关效应,这类氧化还原开关材料在电致变色、光电记忆和光通讯领域具有良好的应用前景;而且随着生物医药技术的发展,二茂铁及其衍生物被广泛应用在生物学、医学、微生物学等领域。已有报道称二茂铁可标记DNA [
在上述工作的基础上,通过电沉积法和溶液挥发法将含有巯基的二茂铁衍生物通过Au-S固定在金电极上,通过DPV法和EIS法获得电流差值与血红蛋白浓度满足的线性方程,计算相关系数和检测限,实现未知浓度血红蛋白的电化学方法检测。在此过程中,通过自组装 [
目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类:一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子交换层析法、电泳法等方法;另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。
此法主要包含有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC) [
检测原理根据血红蛋白的不同结构所带的电荷情况不同,在琼脂糖凝胶上的电泳迁移速度也不同,Hb及HbA1带正电荷,电泳时向负极移动。因为HbA的β链N-末端所带电荷被糖基消除,带电量少,等电点低,迁移速度慢,HbA1本身带红色,可直接比色或扫描,从而达到分离的目的。普通电泳法对HbA和HbA1分离效果不理想,而毛细管电泳能够分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。目前还没有具有批量样本通过能力的仪器,在一定程度限制了该方法的临床应用。
检测原理是在含有载体的两性介质的薄板上形成连续稳定的pH线性梯度中进行电泳,血红蛋白中各组份将移动到各自的等电点pH位置上,然后通过分辨率高的微量光密度进行仪扫描分析,便可以精确的对各组份进行定量测定。由于它的分辨能力好,准确度高,可以很好的避开各种物质的干扰,是一种理想的方法,但仪器非常昂贵,难于用作常规检测。
检测原理利用硼酸衍生物与HbA1c分子上的葡萄糖顺位二醇进行可逆性反应,HbA1c通过共价结合凝胶柱,而非糖化血红蛋白会被洗脱下来,分离过后,再用高浓度含糖或含顺位二醇基的多经基复合物将所结合的糖化血红蛋白置换下来。但是除了HbA1c外,血液中的其他氨基酸的糖基化血红蛋白也会与凝胶柱结合,因此亲和色谱法检测的是总糖化血红蛋白的量,并不是单一组份的含量。优点:操作过程简单、快速、准确、价格低廉、无需特殊仪器设备,其特异性强,不受异常血红蛋白的干扰。
又称化学发光法 [
该方法运用的是单克隆抗体技术,是由英国DAKO公司最早研究发现的,针对血红蛋白的β链N-末端8个氨基酸糖基化的抗原位点,所研发出来的单克隆抗体,用酶免疫的原理来检测。随着不断研究已有很多种检测方法。
1) 胶乳凝集法 [
检测原理:样本中HbA1c的与特异性的单克隆抗体和胶乳结合后,形复合物,并发生凝集,凝集量会由于胶乳表明所固化的HbA1c量的不同而不同。凝集量可用全自动生化分析仪来检测吸光度变化,求出样品中的百分含量。该糖化血红蛋白检测方法不会受异常Hb干扰,其特异性好,操作简便。
2) 免疫比浊法 [
检测原理主要运用抗原、抗体反应的原理来测定。规范取血清标本后,将配制好的HbA1c抗体缓冲液混入受检标本内,使抗HbA1c抗体结合HbA1c产生抗原抗体复合物,之后继续加入多聚半抗原缓冲液以结合反应液中的残余抗HbA1c抗体产生不溶的抗原抗体复合物,以比浊法检测标本中HbA1c水平,并通过另一通道检测Hb含量,根据公式计算得出HbA1c的百分含量 [
3) 其他免疫法
放射免疫法不会受到任何因素干扰,因而检测得出的HbA1c水平更加接近真实水平,且此种检测方法适用于批量检测,可节省成本,有更好的特异性,但受高效价抗体制备限制难以推广;金标免疫渗滤法可配合床边血清检测共同完成,准确度和特异性好,可在短时间内得出检测结果,方便医生和护士随时了解患者HbA1c水平和病情变化。
该方法利用果糖基缬氨酸氧化酶的反应特性,它能够特异性的作用于糖基化的缬氨酸或其小肽,产生H2O2;然后利用辣根过氧化物酶与H2O2的反应使特定的色原显色。根据这一原理,血液样品中的血红蛋白首先被蛋白酶水解,产生糖基化的缬氨酸或小肽,然后在果糖基缬氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶的作用下,与特定的色原产生显色反应。酶法检测糖化血红蛋白操作方便、简单、不受变异血红蛋白的干扰,还可应用于自动生化分析仪,具有良好的重复性和特异性。另外,利用酶法可以直接测定样品中的HbA1c的百分含量,而不像别的方法,还要同时测定样品的血红蛋白总量。该方法与HPLC法和免疫法相比呈良好的相关性。
血红蛋白是一种十分重要的生命物质,糖化血红蛋白是血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白,糖化血红蛋白的增高对人体有多方面影响,因此准确测定血红蛋白的含量和糖化血红蛋白的含量具有至关重要的作用。综上所述,糖化血红蛋白含量测定方法到目前来说比较多,从精确度上考虑,HPLC是最理想的方法,但因其价格十分昂贵,基层医院商不能推广。目前我国多采用手工微柱法,但是易受到诸多干扰因素的影响,误差也较大,该方法也不理想。而从性价比的角度来评价,则为亲和色谱微柱法。该法精确度高,价格也比HPLC低,不容易受其他因素干扰,还有酶法和电化学法也被广泛使用。有研究指出HbA1c会因年龄与种族的不同而不同,并且年龄每增长10岁,用HPLC法所测得的HbA1c百分值将增加0.11%~0.15%。所有的检测方法都不是十分完美的,都有着自己的缺点,相信随着对实验HbA1c方法不断改进,HbA1c检测可以在临床上广泛应用。
大学生创新创业计划项目(201510595044, 201510595207, 201510595057)资助,国家自然科学基金项目(61301038, 61661014)资助。
黄宗利,甘志荣,兰 万,侯嘉婷,冯小珍,韩国成. 糖化血红蛋白的检测方法Methods for Detection of Glycosylated Hemoglobin[J]. 分析化学进展, 2017, 07(03): 163-170. http://dx.doi.org/10.12677/AAC.2017.73022