鲤春病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV)是一种弹状病毒,主要发生于春季,它能引起鲤科鱼类的鱼苗或成鱼大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)。体外扩增的SVCV经人工方法感染健康鲤鱼,运用原位杂交技术(ISH),对感染后出现明显症状并经PCR鉴定阳性的病鱼,取其头部、内脏等组织切片进行SVCV分子定位和检测。结果显示,病鱼体内检出病毒,其中脑部和内脏含量较高。本文建立的SVCV原位杂交法,可初步确定SVCV在病鱼体内不同组织的分布情况。 Spring Viremia of Carp Virus (SVCV) is a rhabdovirus that occurs mainly in the spring, which can cause large-scale outbreaks of Cyprinus carpio (falciparum) in fishes or adult fish. In vitro expansion of SVCV infected healthy carp by artificial infection. In situ hybridization (ISH) was used to identify and detect SVCV molecules in the head, viscera of diseased fish that with obvious symptoms of carp spring virulence and identified as positive by PCR. The results showed that there was a high level of virus in brain and viscera of diseased fish. In this study, SVCV in situ hybridization detection method was established, which can initially identify the distribution of SVCV in different tissues of diseased fish.
吴斌1,王红2,张琳1,肇慧君1
1辽宁出入境检验检疫局,辽宁 大连
2大连医科大学附属第一医院,辽宁 大连
收稿日期:2017年8月14日;录用日期:2017年8月28日;发布日期:2017年9月11日
鲤春病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV)是一种弹状病毒,主要发生于春季,它能引起鲤科鱼类的鱼苗或成鱼大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)。体外扩增的SVCV经人工方法感染健康鲤鱼,运用原位杂交技术(ISH),对感染后出现明显症状并经PCR鉴定阳性的病鱼,取其头部、内脏等组织切片进行SVCV分子定位和检测。结果显示,病鱼体内检出病毒,其中脑部和内脏含量较高。本文建立的SVCV原位杂交法,可初步确定SVCV在病鱼体内不同组织的分布情况。
关键词 :鲤春病毒(SVCV),鲤春病毒血症(SVC),鲤鱼,人工感染,原位杂交(ISH)
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鲤春病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV)是一种弹状病毒,主要发生于春季,它可以引起鲤科鱼类的鱼苗或成鱼大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)。SVC又称鲤鱼传染性腹水症,是一种急性、出血性传染性败血病。该病可以危害鲤鱼,鲶鱼,鲫鱼,鲢鱼,鳙鱼等,在欧、亚两洲均有流行。SVCV是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象,世界动物卫生组织(OIE)将其列为需要向申报的疫病,我国农业部定为一类动物疫病 [
SVCV传统检测方法是根据典型症状进行初步诊断,再通过细胞分离病毒进行确认,最后采用免疫学方法,如中和试验和ELISA,或者分子生物学方法,如PCR和DNA探针等进行鉴定 [
传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、鲤春病毒(SVCV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)等毒株由本实验室保存。
人工感染的鲤鱼鱼苗为市场购买。
显微镜:德国蔡氏AXIOPHOT显微镜。
试剂盒:Roche生产的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I,DIG Wash and Block Buffer。
利用FHM细胞对SVCV病毒的敏感性体外扩增SVCV病毒,并用Karber法测定病毒滴度为10−6.127/0.1 mL。
购买的鲤鱼鱼苗经过一周饲养确定没有病变症状,将20条鱼分成2组(对照组和实验组各10条)。将2组鱼饲养在10℃水箱中,将病毒液按1:1000比例投入实验组,适应性感染3 d。用滴度为105左右的SVCV病毒液5 μL对实验组斑马鱼进行背鳍基部肌肉注射,进一步强化。注射后每天观察记录染毒鱼的状态,并持续饲养直至实验组出现明显的病变症状。
根据文献设计引物并合成(见表1)。
对出现典型症状的病鱼提取病毒RNA,进行PCR鉴定。
1) 制作模板DNA:病毒液提取病毒RNA,利用设计的引物扩增出一条714 bp的片段。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照凝胶回收试剂盒说明对PCR扩增出的714 bp片段进行回收。
2) DIG标记:按照DIGDNA高效标记检测试剂盒说明,将回收的714 bp片段标记成DIG-714探针。
3) 探针浓度的选择:按照DIGDNA高效标记检测试剂盒说明,选择适合的探针浓度。
实验组病鱼经10%甲醛固定24 h后,分成头部、内脏和尾臀三部分。经过梯度酒精脱水,二甲苯透明,最后石蜡包埋。切片待检。头部取脑、眼处横切片,内脏部取内脏部分中间处切片,尾臀取有最大横切面积的切片。
将载有病鱼切片的玻片60℃恒温45 min水化,随后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;加入含100 mg/L蛋白酶K的PBS,37℃消化15 min;预冷的0.4%甲醛室温固定5 min;2 × SSC (0.3 M NaCl,0.03 M枸橼酸钠,pH7.0)室温漂洗5 min;500 μL预杂交液(4 × SSC,50%甲酰胺,0.02% BSA,0.02%聚蔗糖,0.02% PVP,5%硫酸葡聚糖) 37℃预杂交30 min;DIG-714探针溶液稀释到1 ng/μL 42 ℃ 杂交2 h。依次 37 ℃ ,2 × SSC漂洗30 min,1 × SSC漂洗5 min,0.5 × SSC漂洗5 min;室温Buffer I (0.1 MTris-HCl,0.15 M NaCl,pH 7.5)洗片5 min;37℃加入500 μL含5% 阻断剂的Buffer II阻断15 min;37℃加入500 μL含有1/1000