研究冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用。MTT法检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用,RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达。研究结果表明冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h,Bcl-2的mRNA表达显著降低,Bax的mRNA表达显著增加(p < 0.05)。 To investigate the effects of oridonin on Bcap-37 cells, MTT was used to measure the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells and RT-PCR was used to measure the Bcl-2 and Bax mRNA expression. Our results showed the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells by time- and dose-dependent manner. Bcl-2 mRNA expression decreased and Bax mRNA expression increased by oridonin treatment for 24 hours (p < 0.05).
于洋1,刘彦隆2,王小芳2,钱国3,尤伟1
1河南省人民医院乳腺外科,河南 郑州
2温州医科大学,浙江 温州
3宁波市第四医院,浙江 宁波
收稿日期:2017年9月29日;录用日期:2017年10月13日;发布日期:2017年10月19日
研究冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用。MTT法检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用,RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达。研究结果表明冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h,Bcl-2的mRNA表达显著降低,Bax的mRNA表达显著增加(p < 0.05)。
关键词 :冬凌草甲素,Bcap-37细胞
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冬凌草甲素(oridonin, ORI)是从冬凌草中提取的一类四环二萜类化合物,具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性 [
乳腺癌细胞株Bcap-37购自中科院上海细胞生物学研究所。冬凌草甲素购自成都普思生物科技有限公司。RPMI1640购于Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。
细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液, 37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。
将生长状态良好的Bcap-37细胞以1.0 × 104个/孔的密度传代培养于96孔板中,待细胞贴壁后,每板按照分组加入含不同浓度冬凌草甲素的完全培养液,使其终浓度为0、10、20、40 μM,每组5个复孔,并设置调零孔,继续分别培养12、24和48小时。并于培养后12、24、48 h时,取出培养板,每孔加入20 μL浓度为5 mg∙mL−1的MTT溶液,培养箱中继续孵育4 h,弃去培养液,每孔加入100 μl DMSO,震荡溶解沉积在孔底的蓝紫色结晶,并在10 min内于570 nm波长处检测各孔吸光度值(A570),并计算细胞活力:细胞活力(%) = (加药组A570 − 空白组A570)/(对照组A570 − 空白组A570) × 100%。实验独立重复3次。
用Trizol法提取总RNA,A260/A280比值为1.8~2.0,经逆转录反应合成cDNA。然后利用SYBR荧光实时PCR法检测Bcl-2和Bax mRNA相对表达量。实验所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以β-actin为内参照基因,β-actin引物序列:上游,5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3';下游,5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。Bcl-2引物序列:上游, 5'-ATCGCCCTGTGGATGACTGAG-3';下游,5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG -3'。Bax引物序列:上游,5'-GGACGAACTGGACAGTAACATGG-3';下游,5'-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC-3'。反应体系为10 μl,包含Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl,上游引物0.2 μl,下游引物0.2 μl,cDNA 模板0.5 μl,ddH2O 4.1 μl。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,58℃退火45 s,40个循环。每个样本设3个复孔,同时设无模板阴性对照。反应结束后,各个样本的Ct值分别取平均数。以对照组的靶基因表达量为1,2-ΔΔCt即为实验组相对对照组靶基因表达的倍数。
采用SPSS13.0 统计软件处理实验数据,数据均以−x + s表示,组间均值比较采用单因素方差分析。P < 0.05 认为统计学有显著差异。
观察10,20,40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞存活的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板,调节细胞密度为10,000个每孔,5%CO2, 37 ℃ 孵育过夜。移除培养基,每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl,每个药物浓度设置5复孔。5%CO2, 37 ℃ 孵育24小时,倒置显微镜下观察。避光条件下,每孔加入20 μl MTT溶液,5%CO2, 37 ℃ 孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,在570 nm波长处测量各孔吸光值,计算细胞增殖活力。结果显示,冬凌草甲素作用24小时可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖,且呈现明显的剂量依赖性(图1)。
观察40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板,调节细胞密度为10,000个每孔,5%CO2,37℃孵育过夜。移除培养基,每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl,每个药物浓度设置5复孔。5%CO2, 37 ℃ 分别孵育12,24和48小时,
图1. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈剂量依赖性(*P < 0.05)
倒置显微镜下观察。避光条件下,每孔加入20 μl MTT溶液,5%CO2,37℃孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,在570 nm波长处测量各孔吸光值,计算细胞活力。结果显示,作用12,24和48小时后,冬凌草甲素可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖,且呈现明显的时间依赖性(图2)。
取对数生长期的乳腺癌细胞,消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后,收集细胞,用ABI PRISM® 6100 Nucleic Acid PrepStation试剂盒提取细胞总RNA。总RNA的质量和完整性用分光亮度计在260 nm/280 nm下分析。等量的RNA用SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System在Gene Amp® PCR System 9700反转录为cDNA。扩增反应在PCR扩增仪上进行。用β-actin作为内参定量。检测Bcl-2 mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时,随药物浓度的升高,Bcl-2 mRNA的表达逐渐下降(图3)。
取对数生长期的乳腺癌细胞,消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后,收集细胞,检测Bax mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时,随药物浓度的升高,Bax mRNA的表达上调。由此可推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡(图4)。
图2. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈时间依赖性(*P < 0.05)
图3. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bcl-2 mRNA的调节作用(*P < 0.05)
图4. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bax mRNA的调节作用(*P < 0.05)
本研究发现冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h,Bcl-2的mRNA表达显著降低,Bax的mRNA表达显著增加。由此推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞生长的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡。
冬凌草甲素在抗乳腺癌方面的作用已有大量报道。崔桥等发现,冬凌草甲素诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡 [
余越美等研究发现冬凌草甲素可以诱导乳腺癌细胞Bcap-37发生凋亡,其可能与Survivin和GADD34的调控相关 [
浙江省自然科学基金项目(LQ13H280002),河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410388,132300410048),宁波市自然科学基金( 2015A 610234)。
于 洋,刘彦隆,王小芳,钱 国,尤 伟. 冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用The Inhibition Effects of Oridonin on Bcap-37 Cells[J]. 生物医学, 2017, 07(04): 79-84. http://dx.doi.org/10.12677/HJBM.2017.74013