目的:高效液相色谱法测定二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的稳定性以及血浆蛋白结合率,以期为二氢齐墩果酸的临床药物开发研究提供依据并建立出相应检测方法。方法:以高效液相为检测手段,采用超滤法考察二氢齐墩果酸与大鼠血浆蛋白的结合情况。结果:二氢齐墩果酸在大鼠血浆中质量浓度为1~20 μg/ml时,血浆稳定性好,大鼠血浆蛋白结合率较高且无浓度依赖性。结论:建立的超滤法能够满足血浆蛋白结合率测定的要求,建立的高效液相检测方法满足二氢齐墩果酸的体外试验检测。 Objective: To determine the stability of dihydrogen oleanolic acid in rat plasma as well as the plasma protein binding rate in order to provide the basis for the development of clinical research on dihydro oleanolic acid. Methods: The HPLC method was used to detect the binding of dihydrogen oleanolic acid to rat plasma proteins by ultrafiltration. Results: Dihydro-oleanolic acid showed good plasma stability when the concentration of dihydroxyaluminum in rat plasma was 1 - 20 μg/ml, while plasma protein binding rate was high and concentration-independent in rats. Conclusion: The established ultrafiltration method can meet the requirement of determination of plasma protein binding rate. The established HPLC method meets the requirement of dihydromyric acid assay in vitro.
陈瑞,糜玲,蔡进,朱高峰,汤磊,黄静*
贵州医科大学,贵阳 贵州
收稿日期:2018年2月28日;录用日期:2018年3月14日;发布日期:2018年3月21日
目的:高效液相色谱法测定二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的稳定性以及血浆蛋白结合率,以期为二氢齐墩果酸的临床药物开发研究提供依据并建立出相应检测方法。方法:以高效液相为检测手段,采用超滤法考察二氢齐墩果酸与大鼠血浆蛋白的结合情况。结果:二氢齐墩果酸在大鼠血浆中质量浓度为1~20 μg/ml时,血浆稳定性好,大鼠血浆蛋白结合率较高且无浓度依赖性。结论:建立的超滤法能够满足血浆蛋白结合率测定的要求,建立的高效液相检测方法满足二氢齐墩果酸的体外试验检测。
关键词 :二氢齐墩果酸,血浆稳定性,血浆蛋白结合率,超滤法
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齐墩果酸(Oleanolic acid, OA)是具有保肝护肾、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、抗癌、抗应激、抗微生物等作用的一类五环三萜类化合物 [
高效液相色谱仪(型号Waters e2695,美国沃特世公司);漩涡混合器(型号XH-B,江苏康健医疗用品有限公司);氮气吹扫仪(型号JN300-2,苏州吉米诺仪器有限公司)高速离心机(GENESPEED型号X1, Gene Company Limited)超声波清洗器(型号KH-600E,昆山禾创超声仪器有限公司);十万分之一电子天平(型号FA805N,上海菁海仪器有限公司)超低温保存箱(型号:DW-86L486, Haier)。
二氢齐墩果酸(贵州医科大学药物化学重点实验室制备,经高效液相色谱鉴定纯度大于98%);乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均购自德国Merck公司;水为屈臣氏超纯水 [
清洁级SD大鼠6只,♂,体质量200~250 g,鼠龄:12~14周,大鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司,合格证号:SCXK(渝)2012-0011 [
色谱柱:Waters Symmetry C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 μm)柱;保护柱:Waters Symmetry C18 (5 μm Van Guard Cartidge 3.9 mm × 5 mm) [
精密称取10.0 mg二氢齐墩果酸对照品以甲醇溶解并定容至5 ml,制备成质量浓度为2 mg/ml的二氢齐墩果酸对照品贮备液,4℃贮藏。
取清洁级SD雄性大鼠6只股动脉采血分别置于以肝素钠溶液涂抹过的离心管中,3000 *g离心10 min离心温度4℃,取上层血浆−80℃冷冻保存。
图1. (A) 空白血浆;(B) 空白血浆与二氢齐墩果酸
取100 μl血浆样品,加入400 μl甲醇,涡旋混合5 min,12,000 *g离心10 min离心温度4℃,吸取上层有机层,氮气吹干,残渣加入100 μl甲醇溶解,12,000 *g离心10 min离心温度4℃,取上层清液待测。
在空白血浆加入二氢齐墩果酸对照储备液,配制成1、2、5、10、20、40 μg/ml的系列溶液,按“血浆样品处理”方法操作。以样品质量浓度为横坐标(X),样品峰面积比值为纵坐标(Y),用加权最小二乘法加权进行回归计算 [
制备高中低3个不同浓度的二氢齐墩果酸对照品血浆溶液(其中含二氢齐墩果酸质量浓度分别为2、10、20 μg/ml),按“2.3.1”项下方法处理后,同日内进样5次以测定日内精密度,连续进样3 d以测定日间精密度 [
向EP管中加入大鼠空白血浆100 μl,分别加入质控样品工作液1 μl使二氢齐墩果酸质量浓度分别为5、10和20 μg/ml (重复3份,含醇量为1%),振荡混合后在室温下放置0、15、30、60、120、180 min,加甲醇终止反应,按“血浆样品处理”项处理后进行HPLC分析,用随行标准曲线计算相应的药物浓度 [
图2. 二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的稳定性
检测物 | 低质量浓度蛋白结合率% | 中质量浓度蛋白结合率% | 高质量浓度蛋白结合率% |
---|---|---|---|
二氢齐墩果酸 | 72.86 ± 3.43 | 75.83 ± 5.31 | 77.31 ± 4.56 |
表1. 3种质量浓度二氢齐墩果酸在大鼠血浆中的蛋白结合率(n = 5)
取SD大鼠血浆分别加入适量二氢齐墩果酸对照品溶液,涡旋混匀,制备成质量浓度为5,10,20 μg/ml的二氢齐墩果酸血浆样品,在恒温振荡器中37℃温育30 min。将500 μl血浆样品装入Millipore 10 K超滤管中,2000 *g离心25 min制备超滤液,测定游离的二氢齐墩果酸含量,离心过程控制温度在4℃条件下。另外吸取100 μl的二氢齐墩果酸血浆样品,按“2.4”项下方法前处理血浆样品液和超滤液,按上述色谱条件进样测定,记录色谱图,测定其中药物总量。计算血浆样品液和超滤液中二氢齐墩果酸的含量:总浓度为Dt,游离浓度Df,蛋白结合率(%) = [(Dt − Df)/Dt] × 100% [
通过在体外与血浆一起孵化,能够快速确定一种化合物在血浆中是否易降解及其降解程度。本试验确定了二氢齐墩果酸在血浆中稳定性良好,保证了该化合物在进入血液循环后的稳定性。测定快速是超滤法的优点,通常几十分钟即可收集到足够供测定的血浆超滤液。理论上,高血浆蛋白结合率的药物临床使用容易产生安全性问题。而本研究显示二氢齐墩果酸的血浆蛋白结合率不超过80%,说明其由于血浆白结合率改变而导致游离浓度急剧升高所产生不良反应的可能性不大。
贵州省普通高等学校药物化学工程研究中心建设项目(黔教合KY字[
陈 瑞,糜 玲,蔡 进,朱高峰,汤 磊,黄 静. 高效液相色谱法研究二氢齐墩果酸的血浆稳定性与蛋白结合率Study on Plasma Stability and Protein Binding of Dihydro Oleanolic Acid by High Performance Liquid Chromatography[J]. 自然科学, 2018, 06(02): 126-131. https://doi.org/10.12677/OJNS.2018.62019