本文采用PCR技术从魔芋中克隆了番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,该片段长度450 bp,分析表明该基因片段与烟草中PDS序列同源性为77%。经过双酶切构建了p TRV-PDS的VIGS载体,转入农杆菌浸染魔芋,感染的组培苗魔芋植株叶片出现白化表型,定量PCR结果表明魔芋PDS基因的mRNA丰度出现下调且下调了10%。 Phtyoene desaturase (PDS) gene fragment is cloned from Amorphophallus konjac into tobacco tattle virus vector (TRV) to obtain p TRV-PDS. The construction is transformed into Agrobacterium CV3101 and then infected N. benthamiana. Silencing of the PDS gene in N. benthamiana can result in the white leaf due to photo-bleaching, indicating successful establishment of the VIGS system. The albino phenotype of plant leaves appeared, and the expression of PDS gene in konjak was down regulated and the gene expression was down regulated by 10%.
王自布1,2*,黄燕芬1,曹剑峰1,2
1贵州师范学院,贵州 贵阳
2贵州师范学院药用植物生物技术研究所,贵州 贵阳
收稿日期:2018年4月7日;录用日期:2018年4月21日;发布日期:2018年4月28日
本文采用PCR技术从魔芋中克隆了番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,该片段长度450 bp,分析表明该基因片段与烟草中PDS序列同源性为77%。经过双酶切构建了p TRV-PDS的VIGS载体,转入农杆菌浸染魔芋,感染的组培苗魔芋植株叶片出现白化表型,定量PCR结果表明魔芋PDS基因的mRNA丰度出现下调且下调了10%。
关键词 :病毒诱导基因沉默(VIGS),烟草脆裂病毒,番茄红素脱氢酶
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病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制,目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大的潜力。与其它导致基因功能缺失的研究方法(如反义抑制、基因突变等)相比,VIGS技术不仅优于传统的植物转基因技术,方法简便,高效耐用,而且具有高通量特性 [
随着分子生物学研究的进展,几乎所有重要的基因或者基因片段都已经被克隆,对其功能也有了一些了解。但是,不同的基因的互作研究,特别是在小经济作物中还只是刚刚开始起步。这些分子生物学研究尚未很好的与植物品质研究和改良结合起来,对品质育种的指导意义还是十分有限,魔芋中更是如此,此技术的应用有望解决魔芋中品质改良因周期长而效率低下的育种瓶颈。本文根据已报道的烟草中PDS基因序列,克隆得到魔芋中其部分基因PDS片段命名为NbPDS。构建病毒载体(TRV)体系并利用携带目的基因的TRV重组载体病毒感染魔芋幼苗叶片,分析并鉴定魔芋PDS基因的功能。
本实验的研究材料为魔芋(Amorphophallus konjac)组培幼苗,TRV载体p TRV1、p TRV2及农杆菌GC3103实验室保存。
依据RNA试剂盒(天根)的方法提取魔芋总的RNA,再依据反转录试剂盒(天根)合成cDNA第一链。根据已报道的NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因序列(登录号ABE99707),选取部分编码区片段为目标片段,设计上游引物F1(5-CGATCCCGGATAGGGTGACAGATGA-3',下画线为BamH I酶切位点)和下游引物R1(5'-CGGAATTCACACACTGAGCAGCGCAACT-3',下画线为EcoR I酶切位点),引物由上海生工公司合成。以cDNA为模板,进行OCR扩增,扩增条件:PCR反应体系为E × Taq 0.2 μL、10 × Taq buffer 2 μL、Mg2+ (25 mmol/L) 2 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 2 μL、DFR-1F/DFR-2F (10 μmol/L) 0.5 μL、DFR-1R/DFR-2R (10 μmol/L) 0.5 μL、cDNA 模版2 μL、ddH2O 15.8 μL,总体积为25 μL。PCR反应条件:预变性94℃ 3 min,94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后回收和纯化。
通过PCR反应扩增得到目的基因PDS片段。将此片段根据pMD19-T载体试剂盒(TaKaRa)操作说明书将目的基因片段PDS与T载体连接一起,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆后送华大基因公司测序确认片段序列。将含有正确插入片段的T载体用BamH I和EcoR I对pMD19-T载体进行酶切,与经BamHI和EcoR I双酶切的p TRV2载体通过T4-DNA连接酶连接, 转化大肠杆菌,经PCR以及用双酶切鉴定重组质粒,将其命名为p TRV2-DFR。然后通过冻融法转化农杆菌菌株GV3101,阳性克隆筛选,保存菌种待用。
VIGS浸染实验参考侯巧明等 [
图1. 植株表型变化。(a) 病毒浸染后的植株;(b) 对照
选取被农杆菌侵染20 d的魔芋叶片提取总RNA,提取RNA的方法以及合成cDNA的方法参考1.2.1。使用实时荧光定量PCR检测DFR基因沉默的效果。内参基因Actin (登录号:DN551593;F:5'-ggaaaagtgcagagagacacg-3', R:5'-tacagtgtctggatcggtggt-3', 150bp)。实时荧光定量PCR检测引物DFR(登录号 GU324979,DFR-F:5'-atgtctgttgtacatgagaga-3' DFR-R:5'-acgctagagatacgcactcaa-3')。实时荧光定量PCR反应采用天根(TIANGEN)试剂(RealMasterMix (SYBR Green)),每个反应重复3次,反应体系20 μl,含cDNA模板1. 6 μl,2. 5 × RealMasterMix 8 μl,20 × SYBR solution1 μl,Primer F 0. 4 μl,Primer R 0. 4 μl,ddH2O 8. 6 μl。荧光定量PCR仪(Smart CyclerII型,USA)上完成测定。扩增程序50℃温育2 min,(94℃,1 min→退火温度,30 s) × 1;(94℃,10 s→60℃,30 s) × 40。并按PfafflM W [
从魔芋叶片中利用PCR扩增得到PDS部分基因序列,1%的琼脂糖检测大约在453 bp出有扩增出目的条带(图2),将该扩增片段利用回收试剂盒(天根)回收并连接到pMDl9-T载体种并测序。测序结果表明和目的基因片段大小一致450 bp,与已知的烟草PDS序列(登录号ABE99707)同源性到达77%。
将成功构建的重组质粒pTRV2-PDS转化大肠杆菌top 10,提取质粒pDNA经PCR鉴定为阳性,将质粒置于37℃水浴中经双酶切。酶切结果表明条带大小与目的基因片段一致,约453 bp左右(图3),说明pTRV2-PDS构建成功。将成功构建的病毒载体pTRV2-PDS转化农杆菌GV3101,挑取阳性克隆提取质粒并送华大基因公司测序,结果与已知的基因序列一致,可以用于浸染植株叶片。
采用叶片注射法浸染魔芋叶片,接种病毒20 d后观察发现,浸染重组病毒p TRV2-PDS的植株新长出的叶片出现白化现象,而且出现整棵植株叶片发育变慢,而对照植株叶片没有此现象(见图1)。株型变化推测成因可能是诱导的结果,取浸染20 d的植株叶片进行实时荧光定量PCR技术检测,发现PDS基因表达确实出现下调现象(图4),VIGS病毒诱导载体是否可以成功的沉默魔芋中的PDS基因还需进一步的实验验证。
图2. PCR扩增产物。M. DL2000; 1~4. PCR产物
图3. 酶切图谱。M. DL2000; 1. 酶切产物
图4. 叶片中PDS 基因表达的q RT-PCR分析。图中的TRV2表示浸染TRV2的空白对照植株,p TRV2-PDS 表示浸染的植株
本研究利用PCR方法从魔芋中克隆了PDS基因的部分序列, 该基因片段与NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因序列(登录号ABE99707)同源性为77%,原因可能是由于品种间存在多态性基因导致的 [
本实验还发现采用农杆菌叶片注射法浸染魔芋叶片,接种病毒20 d植株新长出的叶片出现植株叶片白化,生长缓慢现象,而对照植株叶片没有此现象。侯巧明等 [
本研究使用VIGS法,使魔芋PDS基因的表达下调,通过qRT-PCR法检测到DFR基因表达出现下调且基因表达下调了10%,该基因下调后,植株表型发生变化。但是下调未达到显著性变化,VIGS病毒诱导载体是否可以成功的沉默魔芋中的PDS基因还需进一步的实验验证。
本实验构建的VIGS病毒诱导体系可应用于魔芋基因功能的分析,根据前人研究结果VIGS在逆境抗性相关基因中的应用 [
贵州省科学技术厅项目:黔科合J字[
王自布,黄燕芬,曹剑峰. 魔芋PDS基因VIGS载体的构建及其功能鉴定 Construction and Functional Identification of VIGS Vector of PDS Gene from Amorphophallus konjac[J]. 农业科学, 2018, 08(04): 384-389. https://doi.org/10.12677/HJAS.2018.84060