目的:研究大蒜素在体外对金黄色葡萄球菌的增殖以及毒力因子的分泌是否存在抑制作用。方法:将大蒜素稀释至不同浓度后,分别作用于处于生长对数前期的金黄色葡萄球菌,采用试管法测定大蒜素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用生长曲线测定法分析大蒜素对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用;采用凝固酶,a-溶血素实验测定大蒜素对金黄色葡萄球菌毒力因子分泌的影响,采用测序技术以及Blast比对的方法测定大蒜素作用下a-溶血素基因的变化。结果:大蒜素对金黄色葡萄球的MIC为15.625 μg/mL,MBC为62.5 μg/mL;大蒜素可以抑制金黄色葡萄球菌的生长,并呈浓度依赖性;凝固酶的效价和a-溶血素的活性明显降低(P < 0.01);a-溶血素的DNA序列无明显改变。结论:大蒜素对金黄色葡萄球菌的增殖和毒力因子分泌具有明显的抑制作用。 Objective: To study the inhibitory effects of allicin on the proliferation of Staphylococcus aureus and the secretion of virulence factors in vitro. Methods: The allicin is diluted to different concen-trations to act on Staphylococcus aureus at early stage of growth logarithm. The MIC and the MBC of allicin against Staphylococcus aureus were determined by tube method; the growth curves were measured to analyze the growth inhibition effect of allicin on Staphylococcus aureus; the effects of allicin on the secretion of virulence factors of Staphylococcus aureus were determined by coagulase and a-hemolysin assaies, the changes of a-hemolysin gene under allicin were determined by sequencing technique and Blast-matched. Results: The MIC is15.625 μg/mL; the MBC is 62.5 μg/mL; the titers of coagulase and the a-hemolysin activities decreased significantly (P < 0.05); The DNA sequence has no significant change. Conclusion: Allicin has significant inhibitory effects on the proliferation and the secretion of virulence factors of Staphylococcus aureus.
朱琳琦,邵世和
江苏大学医学院,江苏 镇江
收稿日期:2018年5月31日;录用日期:2018年6月14日;发布日期:2018年6月21日
目的:研究大蒜素在体外对金黄色葡萄球菌的增殖以及毒力因子的分泌是否存在抑制作用。方法:将大蒜素稀释至不同浓度后,分别作用于处于生长对数前期的金黄色葡萄球菌,采用试管法测定大蒜素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用生长曲线测定法分析大蒜素对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用;采用凝固酶,a-溶血素实验测定大蒜素对金黄色葡萄球菌毒力因子分泌的影响,采用测序技术以及Blast比对的方法测定大蒜素作用下a-溶血素基因的变化。结果:大蒜素对金黄色葡萄球的MIC为15.625 μg/mL,MBC为62.5 μg/mL;大蒜素可以抑制金黄色葡萄球菌的生长,并呈浓度依赖性;凝固酶的效价和a-溶血素的活性明显降低(P < 0.01);a-溶血素的DNA序列无明显改变。结论:大蒜素对金黄色葡萄球菌的增殖和毒力因子分泌具有明显的抑制作用。
关键词 :大蒜素,金黄色葡萄球菌,生长曲线,凝固酶,a-溶血素
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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为革兰阳性的球菌,呈葡萄串状排列,是人类化脓性感染最常见的病菌,通过毒力因子引起食物中毒,烫伤样皮肤综合症,中毒性休克综合症等毒素性疾病 [
大蒜素(Allicin)为三硫代烯丙醚类化合物,是从大蒜的球形鳞茎中提取出来的挥发性油状物,具有强烈的辛辣刺激味。大蒜素是大蒜中主要生物活性物质的总称,具有抗菌,抗肿瘤,降低胆固醇,抗血小板聚集等多种生理学作用,并且在人和动物体内无残留,不产生耐药性,不造成污染,价格低廉等优点,备受国内外研究者关注 [
本研究主要采用检测凝固酶和a-溶血素的分泌探讨了大蒜素对金黄色球菌的增殖及毒力因子分泌的抑制作用。
金黄色葡萄球菌(ATCC25923)由本江苏大学医学院保存;大蒜素(汇林生物有限公司);血浆(江苏省溧阳市中医院);M-H固体培养基(河南美凯生物有限公司);去纤维兔血红细胞(南京茂捷微生物科技有限公司)。
37℃恒温培养箱、超净工作台(苏州安泰空气有限公司);紫外可见分光光度计(Biochrom公司);摇床(德国Thermo Forma公司);Biosceen全自动生长曲线分析仪(上海谓载商贸发展有限公司)
将待测菌种接种于LB平板上置于37℃孵箱培养24 h,挑取新鲜单个菌落至无菌生理盐水中研磨制成菌悬液,利用分光光度计调整至OD600 = 0.1,即0.5麦氏比浊度。取12支无菌试管,第一管加入2 mL的LB培养液,其余试管加入1 mL。在第一支试管中加入大蒜素4 μL,即药物浓度为1 mg/mL,然后倍比稀释至第十管。在含药的试管中加入5 μL调整后的菌液使得菌液浓度为5 × 105 CFU/mL。剩下的两支试管分别做阴阳性对照,其中阴性对照不加菌,阳性对照不加药 [
取单个菌落至3 mL培养液中,放至摇床37℃ 200 r/min过夜,次日取菌液50 μL加入5 mL的LB中扩大培养至OD600 nm = 0.3。通过倍比稀释使药的终浓度分别为125,62.5,31.25,15.625,7.8125,3.9025,0 μg/mL,在96孔板中加入含有不同浓度大蒜素的菌液400 μL,放入生长曲线仪,每1 h测量一次,共检测24 h。
金黄色葡萄球菌扩大培养至OD600 nm = 0.3后,加入不同含量的药物,使药的浓度分别为500,125,62.5,31.25,15.625,7.8125,0 μg/mL,继续扩大培养至OD600 nm = 2.5,10,000 g离心10 min,分离上清和菌体。用无菌的LB将收集的上清进行倍比稀释,每个Ep管中100 μL,用PBS将血浆做4倍稀释,每个Ep管中加入稀释后的血浆0.5 mL,混匀后置于温箱中6 h,以产生凝集的最高稀释倍数作为凝固酶的效价。
在Ep管中加入875 μL的PBS,100 μL菌上清,25 μL兔红细胞,将Ep管放入37℃水浴箱中30 min,5500 g离心1 min,取上清,在波长543 nm处测量OD值 [
合成16s rRNA、溶血素的引物(具体引物见表1),对分泌出的菌体进行总DNA的提取,再利用普通PCR得到相应的条带,胶回收后,进行基因测序 [
采用SPSS22.0软件处理实验数据,金黄色葡萄球菌的生长曲线组间比较采用重复测量方差分析,经过对数转换后的凝固酶效价和溶血素活性实验数据组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Dunnet-t和S-N-K检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
大蒜素对金黄色葡萄球菌的MIC为15.625 μg/mL,MBC为62.5 μg/mL。
根据生长曲线可知(见图1),加入大蒜素后金黄色葡萄球菌的生长受到明显的抑制。当药物浓度达到MIC时,加入药物后金黄色葡萄球菌的生长相对于对照组明显缓慢,在4~8 h后恢复生长但总体生长比对照组慢很多。同时间点不同浓度组之间的增殖抑制作用的差异存在统计学意义(P < 0.01),处理组与对照组分别进行两两比较,增殖抑制作用的差异均有统计学意义(P < 0.05),处理组之间进行两两比较,增殖抑制作用的差异仍有统计学意义(P < 0.05)。并且,根据生长曲线可知,大蒜素浓度越高,抑制作用越强,这表明大蒜素在体外以浓度依赖性的形式抑制金黄色葡萄球菌的生长。
不同浓度的大蒜素处理金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌分泌蛋白的浓度无明显改变,差别无统计学意义。
在组间比较时,效价差异存在统计学意义,而在处理组与对照组两两比较时,除了7.8125组以外,其余各组与对照组的差异存在统计学意义(P < 0.01,见表2)。
金黄色葡萄球菌在血平板中生长时,出现了明显的溶血环,故有a-溶血素产生。加入大蒜素作用后,金黄色葡萄球菌的溶血活性受到抑制,且呈浓度依赖性(见图2)。群组之间差异具有统计学意义(P < 0.01)在与对照组两两比较的结果中,除7.8125组外,差异均有统计学意义(P < 0.01)。
测序结果经过Blast比对,加药前后的金黄色葡萄球菌16s rRNA与基因库中覆盖度均为99%,加药前金黄色葡萄球菌hla基因序列覆盖率为99%,加药后hla基因序列覆盖率为98%。说明大蒜素不能引起hla基因的变化,不易产生基因突变从而产生耐药性 [
基因 | 引物序列(5’-3’) | 产物长度(bp) |
---|---|---|
16s rDNA-F | GGCGTTGCTCCGTCAGGCTT | 420 |
16s rDNA-R | CGCTGGCGGCGTGCCTAAT | |
hla-F | GAAGTCTGGTGAAAACCCTGA | 704 |
hla-R | TGAATCCTGTCGCTAATGCC |
表1. 普通PCR引物
图1. 不同浓度大蒜素作用下金葡菌的生长曲线
大蒜素浓度(μg/mL) | 分泌蛋白浓度(mg/mL) | 效价 |
---|---|---|
500 | 12.40 | 1:16* |
250 | 12.52 | 1:32* |
125 | 12.14 | 1:32* |
62.5 | 11.84 | 1:64* |
31.25 | 11.81 | 1:256* |
15.625 | 12.00 | 1:256* |
7.8125 | 12.11 | 1:512 |
对照组 | 12.17 | 1:512 |
表2. 大蒜素作用后金葡菌分泌蛋白浓度以及凝固酶效价的变化
*与对照组比较,P < 0.01。
图2. 不同浓度大蒜素作用下溶血活力的变化
金黄色葡萄球菌的致病物质分为三大类:① 菌体:荚膜,SPA,胞壁肽聚糖等;② 酶类:血浆凝固酶,纤维蛋白溶酶,酯酶,耐热核酸酶,透明质酸酶等;③ 毒素:细胞毒素(溶血素,杀白细胞素),肠毒素,毒性休克综合症毒素,表皮剥脱毒素等。a-溶血素是金黄色葡萄球菌分泌的溶血素之一,是一种具有细胞裂解、溶血和皮肤坏死活性的成孔毒素,是金黄色葡萄球菌所分泌的毒素因子中最要的毒力因子之一。凝固酶能够阻碍吞噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬及杀灭作用,纤维蛋白还可沉积在病灶周围,阻止药物及机体内杀菌物质与金黄色葡萄球菌接触,利于其繁殖,纤维蛋白的大量形成能限制金黄色葡萄球菌扩散,并易使局部毛细血管栓塞,导致组织坏死,故葡萄球菌引起的化脓感染多为局限性 [
大蒜素主要含有大蒜辣素,大蒜新素及多种烯丙基硫醚化合物等。是目前国内外较为热门的中草药。我们将大蒜素作用于金黄色葡萄球菌中,通过生长曲线观察金黄色葡萄球菌增殖的抑制情况;测定凝固酶的效价和溶血素的活性的变化分析大蒜素对金黄色葡萄球菌毒力因子分泌的影响;并利用测序技术,比较药物作用前后hla基因的变化从而判定大蒜素对金黄色葡萄球菌的基因序列是否存在影响 [
本研究表明,大蒜素对于金黄色葡萄球菌具有抑制作用,且呈浓度依赖性。经过以上实验,我们证实了低浓度的大蒜素具有抑菌作用,而高浓度的大蒜素具有杀菌效果。根据多种报道,我们已知金黄色葡萄球菌的毒力因子可引起种特异性疾病,其中凝固酶和溶血素是金黄色葡萄球菌最为重要的毒力因子。在大蒜素发挥作用后,我们发现菌外分泌的蛋白总量没有明显变化,但是凝固酶的效价明显受到抑制,并且呈浓度依赖性,说明大蒜素能够减少金黄色葡萄球菌纤维蛋白原凝集因子的产量,而凝集因子的减少能够更好的抑制金黄色葡萄球菌的进一步感染和传染,具有重要的临床价值。溶血素的分泌也受到了显著抑制,且呈浓度依赖性,说明大蒜素能够减少溶血素的生成,具有重要的临床意义 [
而在作用机制的研究中,我们对溶血素的基因序列扩增后进行测序,随后与Genbank内的序列进行Blast比对。我们发现,基因无明显变化,故大蒜素并不能直接导致基因突变,作用机制需进一步研究 [
朱琳琦,邵世和. 大蒜素对金黄色葡萄球菌毒力因子分泌的抑制作用 Inhibitory Effect of Allicin on the Secretion of Staphylococcus aureus Virulence Factors[J]. 微生物前沿, 2018, 07(02): 73-78. https://doi.org/10.12677/AMB.2018.72009