本研究运用微卫星标记分析亲本云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼与云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1的遗传关系,使用13对微卫星引物对3种石斑鱼群体进行微卫星分析,计算等位基因数、基因杂合度、多态信息含量、相似指数和Nei氏遗传距离,并采用UPGMA法构建聚类分析图。结果显示,云纹石斑鱼的平均等位基因数(Ao)最大(5.2900),鞍带石斑鱼最小(2.6200);杂交F1的平均观测杂合度(Ho)最高(0.7108),鞍带石斑鱼最低(0.4167);13对微卫星引物在云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1 3个群体中的平均多态信息含量(PIC)分别为0.4661、0.3392、0.4818;鞍带石斑鱼和杂交F1遗传相似率最高(0.7616),云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼相似率最低(0.4296)。根据遗传距离采用UPGMA法构建聚类分析图,结果显示,鞍带石斑鱼和杂交F1先聚为一支,云纹石斑鱼位于最外支。研究表明,杂交F1群体的遗传多样性水平高于2个亲本群体;杂交F1与鞍带石斑鱼的亲缘关系较近。 In this study, the genetic relationship among E. moara, E. lanceolatus and hybrid F1 were analyzed by using 13 microsatellite loci. The allele’s number, observed heterozygosity, expected heterozy gosity, polymorphism information content, genetic similarity index and Nei genetic distances were calculated, and the cluster analysis graph was constructed by UPGMA method. The results showed that the average alleles number of E. moara was the highest (5.2900) and E. lanceolatus was the lowest (2.6200); the average observed heterozy gosity of hybrid F1 was the highest (0.7108) and E. lanceolatus was the lowest (0.4167). Average polymorphic information content by 13 microsatellite primers in the three populations of E. moara, E. lanceolatus and hybrid F1 were 0.4661, 0.3392, 0.4818, respectively. The genetic similarity rate between E. lanceolatus and hybrid F1 was the highest (0.7616), and the lowest was found in E. moara and E. lanceolatus (0.4296). The cluster analysis graph was constructed by UPGMA method according to the genetic distance. The results showed that E. lanceolatus and the hybrid F1 were grouped together, and E. moara was located on the outermost branch. This study showed that the hybrid F1 had a close relationship with E. lanceolatus.
李炎璐1,陈超1*,陈建国1,2,赵亭亭1,2,张清雯1,2,翟介明3
1中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业可持续发展重点实验室,青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室,山东 青岛
2上海海洋大学水产与生命学院,上海
3莱州明波水产有限公司,山东 烟台
收稿日期:2018年9月29日;录用日期:2018年10月10日;发布日期:2018年10月17日
本研究运用微卫星标记分析亲本云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼与云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1的遗传关系,使用13对微卫星引物对3种石斑鱼群体进行微卫星分析,计算等位基因数、基因杂合度、多态信息含量、相似指数和Nei氏遗传距离,并采用UPGMA法构建聚类分析图。结果显示,云纹石斑鱼的平均等位基因数(Ao)最大(5.2900),鞍带石斑鱼最小(2.6200);杂交F1的平均观测杂合度(Ho)最高(0.7108),鞍带石斑鱼最低(0.4167);13对微卫星引物在云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1 3个群体中的平均多态信息含量(PIC)分别为0.4661、0.3392、0.4818;鞍带石斑鱼和杂交F1遗传相似率最高(0.7616),云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼相似率最低(0.4296)。根据遗传距离采用UPGMA法构建聚类分析图,结果显示,鞍带石斑鱼和杂交F1先聚为一支,云纹石斑鱼位于最外支。研究表明,杂交F1群体的遗传多样性水平高于2个亲本群体;杂交F1与鞍带石斑鱼的亲缘关系较近。
关键词 :云纹石斑鱼,鞍带石斑鱼,杂交F1,微卫星标记
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云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)同属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、石斑鱼属(Epinephelus),均为暖温性礁栖鱼类,均属于经济价值较高的鱼类。云纹石斑鱼主要分布于日本、韩国以及我国的东海和南海,具有个体大、生长快、肉质鲜美的特性 [
云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和云纹石斑鱼(♀) × 鞍带石斑鱼(♂)杂交F1均取自莱州明波水产有限公司。选择体色和形态正常、性腺发育成熟的健康亲鱼用于种间远缘杂交,将亲鱼用MS-222麻醉,轻压亲鱼腹部,采集成熟卵子和精液进行人工授精。将受精卵放入孵化槽中进行孵化,孵化水温为24℃~25℃、盐度为30,微充气,流水孵化;再将其转入水温为25℃~27℃、盐度为29~31、溶解氧 ≥ 5 mg/L的方形水泥池中培育。每种样本取17个个体,杂交F1为6月龄幼鱼,分别剪取鳍条保存于95%的乙醇中。
将乙醇保存的鳍条样品采用酚-氯仿法提取DNA,以1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性与纯度,用紫外分光光度计检测质量浓度。
从云纹石斑鱼及石斑鱼属的其它种开发的引物中选取13对引物,引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
PCR扩增反应体积为15 μl,反应体系包括DNA模板1 µl,10 × PCR Buffer 1.5 µl,2.5 µM dNTP混合液1.2 µl,25 µM MgCl2 0.9 µl,Taq DNA聚合酶0.3 µl,10 µM上下游引物各0.5 µl,双蒸水9.1 µl。PCR循环为94℃预变性5 min后进入循环体系,94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,最后72℃终延伸5 min,4℃保存。在ABI 3730 XL sequencer测序仪上进行毛细管电泳。使用Data Collection和Genemapper软件进行数据收集和分析,输出电泳图谱,计算各等位基因大小。
使用GENPOP Version 3.4软件计算等位基因数(alleles number, Ao)、等位基因频率(allele frequency)、观测杂合度(observedheterozygosity, Ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity, He),并依据Botstein等 [
使用DISPAN软件计算Nei氏遗传距离(geneticdistances)和遗传相似度(genetic similarity)。采用算术平均数的非加权成组配对法(unweightd pair group witharithmetic average, UPGMA),使用Mega 4.0软件 [
从25对微卫星引物中筛选出13对,在3种石斑鱼群体中均可得到稳定清晰的产物。13对引物信息见表1。
使用13对微卫星引物对云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1的基因组DNA进行检测。结果显示,引物Ese26扩增的片段大小在云纹石斑鱼群体中为190 bp,在鞍带石斑鱼群体中为200~202 bp;引物RH_CA_001扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为386~422 bp,在鞍带石斑鱼群体为372~384 bp;引物RH_CA_004扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为199~213 bp,在鞍带石斑鱼群体为183~197 bp;引物RH_CA_007扩增的片段大小在云纹石斑鱼群体中为306 bp,在鞍带石斑鱼群体为318~320 bp;引物RH_CA_008扩增的片段大小范围在云纹石斑鱼群体中为198~200 bp,在鞍带石斑鱼群体为206~214 bp。结果表明,引物Ese26、RH_CA_001、RH_CA_004、RH_CA_007和RH_CA_008均能区分云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体。
引物Ese26中,母本云纹石斑鱼群体均为纯合型,只有一条带190 bp,父本鞍带石斑鱼群体有杂合型,而杂交F1均为杂合型,均有一条190 bp的条带,父、母本条带同时出现(图1),是鉴别杂交F1的最佳分子标记。引物RH_CA_007中,母本云纹石斑鱼群体均为纯合型,只有一条带306 bp,父本鞍带石斑鱼群体有杂合型,而杂交F1均为杂合型,均有一条306 bp的条带,父、母本条带同时出现(图2),也是鉴别杂交F1的最佳分子标记。
3种石斑鱼13对微卫星位点的平均等位基因数、平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量见表2。结果显示,云纹石斑鱼的平均等位基因数(Ao)最大(5.2900),其次为杂交F1 (4.2100),鞍带石斑鱼最小(2.6200);在平均观测杂合度(Ho)中,杂交F1最高(0.7108),其次为云纹石斑鱼(0.4510),鞍带石斑鱼最低(0.4167);平均期望杂合度(He)中,杂交F1最高(0.5461),其次为云纹石斑鱼(0.5105),鞍带石斑鱼最低(0.4012)。从位点来看,多态信息含量(PIC)最高的为云纹石斑鱼的RH_CA_001位点(0.8975);从
位点Loci | 引物序列(5’-3’) Primer sequence | 退火温度(℃) Annealing temperature | 登录号Accession no. |
---|---|---|---|
Ese06 | CATGTAAGCTCCACCACGACTG TTGATGAAAGGGAACAATAGCTG | 57 | EU374,814.1 |
Ese26 | CACTCATTCTCTTCGTCGTTTTCA CCAGTTCTGTTCCGCTTGTTCA | 57 | EU374,834.1 |
ELMS013 | TCATGTCAGGAGGGAGAAGAG CATACTGTTAGCTGGGGGTGA | 56 | EF607,134.1 |
ELMS015 | AAGCTGAGCCGAATTTTTCA GCTCCTCGTGTTTCCGATTA | 56 | EF607,136.1 |
RH_GATA_003 | GGGCAATTTGGTTCTTCACA TGTCAATGCCACAGGATACA | 57 | DQ223,790.1 |
RH_CA_001 | CGAGATAAGCCCTGGTGAAA AGTCCCGATGTGGTAACGAG | 60 | DQ223,785.1 |
RH_CA_002 | CTCGTTACCACATCGGGACT AACACTGGCTGGTTTGCACT | 60 | DQ223,785 |
RH_CA_004 | GAGAACGACATTCCAGCACA TGTGTGACCAGAAACCAGGA | 57 | DQ223,784 |
RH_CA_007 | CAGAAACATCTCCCCCAAAA CTGGCAGAGCAATTAGAGGC | 60 | DQ223,786 |
RH_CA_008 | AGTTGCCCAGGTTACACGAG TTGGGTCCTGGCATTTAGAG | 57 | DQ223,787 |
D161 | TAGTTCCAGAAAGCAA CCAGGGGATAATGTCA | 51 | DQ914,895 |
D493 | TAATTGGGGATATGTGAC CATTTCTTCTTGCTTCG | 48 | DQ914,901 |
D548 | ACCAGATAACAAGATGCC GTAAAATGAAATACAGCTCA | 53 | DQ914,910 |
表1. 13对微卫星引物的特征
图1. 引物Ese26的毛细管电泳峰值图;(a) 云纹石斑鱼个体,条带大小为190 bp;(b) 杂交F1个体,条带大小为190和202 bp;(c) 鞍带石斑鱼个体,条带大小为202 bp
图2. 引物RH_CA_007的毛细管电泳峰值图;(a) 云纹石斑鱼个体,条带大小为306 bp;(b) 杂交F1个体,条带大小为306和320 bp;(c) 鞍带石斑鱼个体,条带大小为320 bp
群体来看,3个群体的平均PIC为0.4290,杂交F1的平均PIC最高为0.4818,云纹石斑鱼为0.4661,鞍带石斑鱼最低为0.3392。
3种石斑鱼群体的遗传相似指数和遗传距离结果显示(表3),鞍带石斑鱼与杂交F1遗传相似率最高(0.7616),其次为云纹石斑鱼和杂交F1 (0.7247),云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼相似率最低(0.4296);云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼遗传距离最大(0.8449),其次为云纹石斑鱼和杂交F1 (0.3220),鞍带石斑鱼与杂交F1遗传距离最小(0.2724)。结果表明,杂交F1偏向父本鞍带石斑鱼。
根据遗传距离采用UPGMA法构建聚类分析图(图3),结果显示,鞍带石斑鱼和杂交F1先聚为一支,
位点 Loci | 参数 Parameter | 云纹石斑鱼 E. moara | 鞍带石斑鱼 E. lanceolatus | 杂交F1 hybrid F1 |
---|---|---|---|---|
Ese06 | Ao | 5.0000 | 1.0000 | 3.0000 |
Ho | 0.4706 | 0.0000 | 0.6471 | |
He | 0.5098 | 0.0000 | 0.6078 | |
PIC | 0.4508 | 0.0000 | 0.5242 | |
Ese26 | Ao | 1.0000 | 2.0000 | 2.0000 |
Ho | 0.0000 | 0.0000 | 1.0000 | |
He | 0.0000 | 0.1141 | 0.5152 | |
PIC | 0.0000 | 0.1046 | 0.3750 | |
ELMS013 | Ao | 6.0000 | 2.0000 | 7.0000 |
Ho | 0.5294 | 0.2941 | 0.7059 | |
He | 0.7469 | 0.4866 | 0.7326 | |
PIC | 0.6829 | 0.3608 | 0.6787 | |
ELMS015 | Ao | 12.0000 | 4.0000 | 7.0000 |
Ho | 0.7059 | 0.2353 | 0.5882 | |
He | 0.9127 | 0.4421 | 0.8271 | |
PIC | 0.8755 | 0.3959 | 0.7749 | |
RH_GATA_003 | Ao | 12.0000 | 4.0000 | 10.0000 |
Ho | 0.7647 | 0.8824 | 0.8824 | |
He | 0.8770 | 0.7576 | 0.8431 | |
PIC | 0.8361 | 0.6874 | 0.7980 | |
RH_CA_001 | Ao | 16.0000 | 2.0000 | 4.0000 |
Ho | 0.6471 | 0.5294 | 0.2941 | |
He | 0.9323 | 0.5152 | 0.2727 | |
PIC | 0.8975 | 0.3750 | 0.2533 | |
RH_CA_002 | Ao | 5.0000 | 5.0000 | 5.0000 |
Ho | 0.7647 | 0.9412 | 0.6471 | |
He | 0.7005 | 0.7772 | 0.7469 | |
PIC | 0.6265 | 0.7116 | 0.6754 | |
RH_CA_004 | Ao | 6.0000 | 3.0000 | 9.0000 |
Ho | 0.5294 | 0.6471 | 0.9412 | |
He | 0.7861 | 0.6132 | 0.7932 | |
PIC | 0.7305 | 0.5092 | 0.7469 | |
RH_CA_007 | Ao | 1.0000 | 2.0000 | 3.0000 |
Ho | 0.0000 | 0.4118 | 1.0000 | |
He | 0.0000 | 0.451 | 0.5900 | |
PIC | 0.0000 | 0.3419 | 0.4814 | |
RH_CA_008 | Ao | 2.0000 | 4.0000 | 4.0000 |
Ho | 0.5882 | 1.0000 | 1.0000 | |
He | 0.5134 | 0.7005 | 0.6720 | |
PIC | 0.3741 | 0.6190 | 0.5883 |
D161 | Ao | 2.0000 | 2.0000 | 2.0000 |
---|---|---|---|---|
Ho | 0.1176 | 0.0588 | 0.8235 | |
He | 0.1141 | 0.0588 | 0.4991 | |
PIC | 0.1046 | 0.0555 | 0.3671 | |
D493 | Ao | 4.0000 | 1.0000 | 1.0000 |
Ho | 0.2941 | 0.0000 | 0.0000 | |
He | 0.5437 | 0.0000 | 0.0000 | |
PIC | 0.4813 | 0.0000 | 0.0000 | |
D548 | Ao | 1.0000 | 2.0000 | 1.0000 |
Ho | 0.0000 | 0.0000 | 0.0000 | |
He | 0.0000 | 0.2995 | 0.0000 | |
PIC | 0.0000 | 0.2484 | 0.0000 | |
平均值 Mean value | Ao | 5.2900 | 2.6200 | 4.2100 |
Ho | 0.4510 | 0.4167 | 0.7108 | |
He | 0.5105 | 0.4012 | 0.5461 | |
PIC | 0.4661 | 0.3392 | 0.4818 |
表2. 3种石斑鱼群体的遗传变异参数
云纹石斑鱼 E. moara | 鞍带石斑鱼 E. lanceolatus | 杂交F1 Hybrid F1 | |
---|---|---|---|
云纹石斑鱼 | 0.4296 | 0.7247 | |
鞍带石斑鱼 | 0.8449 | 0.7616 | |
杂交F1 | 0.3220 | 0.2724 |
表3. 云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1间的遗传相似指数(上三角)和Nei氏遗传距离(下三角)
图3. 云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼和杂交F1的UPGMA聚类分析图
云纹石斑鱼位于最外支。结果表明,杂交F1与父本鞍带石斑鱼的亲缘关系较近。
微卫星标记遵循孟德尔的分离规律,是一种共显性的分子标记,亲本微卫星位点的等位基因在繁殖时发生分离,真正的杂交F1的遗传物质一方来自父本而另一方来自母本,因而在鱼类远缘杂交育种上,微卫星标记适用于亲本与杂交F1亲缘关系的鉴定。在本研究中,杂交F1的等位基因基本来自父母本群体,总体上符合孟德尔的分离规律,属两性融合生殖,是真正意义上的杂交种。本研究使用的13对微卫星位点可以作为云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体的有效分子标记,分析两种石斑鱼群体的遗传多样性,其中,引物Ese26、RH_CA_001、RH_CA_004、RH_CA_007和RH_CA_008可将云纹石斑鱼和鞍带石斑鱼两个群体进行区分,引物Ese26和RH_CA_007是鉴别杂交F1的最佳分子标记。
多态信息含量(PIC)是指后代所获得的某个等位基因标记来源于其亲本同一个等位基因标记的可能性大小,是衡量等位基因多态性的理想指标,值越大,群体杂合个体的比例越高,显示的遗传信息越多。据Botstein等 [
基因杂合度能够表明群体中个体遗传变异的程度,是评估群体遗传变异的理想指标之一 [
遗传距离是研究群体遗传多样性的基础,是反映遗传多样性高低的主要指标之一,遗传距离越小,表明群体分化时间越短、亲缘关系越近、遗传多样性越低,反之,遗传距离越大则遗传多样性越高。杂种优势是指不同基因型的亲本杂交产生的杂交子代在生长、成活、抗逆性和品质等方面均优于双亲的现象。现代杂种优势理论认为,亲本之间的遗传距离越大,杂合位点数目越多,杂交子代的杂种优势就越强 [
山东省自然科学基金(ZR2015PC015)。
李炎璐,陈 超,陈建国,赵亭亭,张清雯,翟介明. 云纹石斑鱼、鞍带石斑鱼与杂交F1的微卫星分析 Microsatellite Analysis of Epinephelus moara, Epinephelus lanceolatus and Hybrid FF1[J]. 农业科学, 2018, 08(10): 1149-1157. https://doi.org/10.12677/HJAS.2018.810169