目的:检测柴胡中具有抗菌活性的柴胡皂苷单体d (Sd),研究该单体对支原体阿奇霉素耐药株的抑菌作用及其与阿奇霉素的相互作用。方法:采用棋盘微量稀释法,测定单用柴胡皂苷d,阿奇霉素及二者联用使用时,对20株阿奇霉素耐药支原体菌株的最低抑菌浓度MIC,计算部分抑菌浓度指数(FIC),判定二药相互作用。结果:单独用药时Sd及阿奇霉素,对耐阿奇霉素支原体株MIC的几何均数值GM值分别为1.008 ug/mL、1.941 ug/mL。联合用药时,Sd和阿奇霉素的GM值分别降低为0.346 ug/mL和1.189ug/mL。2种药物单用和联合用药时,MIC值差异均有统计学意义(P < 0.05)。联用时在20株耐药株均表现为协同或者相加作用。结论:柴胡皂苷单体Sd对解脲支原体耐阿奇霉素菌株有较强的抑制作用,与阿奇霉素有协同或者相加作用。 Objective: To detect the antibacterial activity of Saikosaponin monomer d (Sd) in Radix Bupleuri and to evaluatethe antibacterial activity of Sd against azithromycin-resistant Mycoplasma strains and its interaction with azithromycin. Methods: The minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 azithromycin-resistant Mycoplasma strains were determined by the chessboard microdilution method when using Saikosaponin d, azithromycin alone and in combination. Partial antibacterial concentration index (FIC) was calculated and interaction between these two drugs were determined. Results: When used alone, the geometric mean (GM) values of MIC of Sd and azithromycin against azithromycin-resistant Mycobacterium were 1.008 ug/mL and 1.941 ug/mL, respectively. When used in combination, the GM values of Sd and azithromycin decreased to 0.346 ug/mL and 1.189 ug/mL, respectively. The MIC values significantly differ between the two drugs used alone and in combination (P < 0.05). When used in combination, the two drugs showed synergistic or additive effect toward 20 resistant strains. Conclusion: Sd of Saikosaponin showed a strong inhibitory effect on azithromycin-resistant Ureaplasma urealyticum strains and has synergistic or additive effect with azithromycin.
贾亚利1*,刘珏2,吴黎明2,蔡莺莲1,吴盛海2
1杭州市肿瘤医院皮肤科,浙江 杭州
2杭州市第一人民医院皮肤科,浙江 杭州
收稿日期:2018年11月9日;录用日期:2018年11月23日;发布日期:2018年11月30日
目的:检测柴胡中具有抗菌活性的柴胡皂苷单体d (Sd),研究该单体对支原体阿奇霉素耐药株的抑菌作用及其与阿奇霉素的相互作用。方法:采用棋盘微量稀释法,测定单用柴胡皂苷d,阿奇霉素及二者联用使用时,对20株阿奇霉素耐药支原体菌株的最低抑菌浓度MIC,计算部分抑菌浓度指数(FIC),判定二药相互作用。结果:单独用药时Sd及阿奇霉素,对耐阿奇霉素支原体株MIC的几何均数值GM值分别为1.008 ug/mL、1.941 ug/mL。联合用药时,Sd和阿奇霉素的GM值分别降低为0.346 ug/mL和1.189ug/mL。2种药物单用和联合用药时,MIC值差异均有统计学意义(P < 0.05)。联用时在20株耐药株均表现为协同或者相加作用。结论:柴胡皂苷单体Sd对解脲支原体耐阿奇霉素菌株有较强的抑制作用,与阿奇霉素有协同或者相加作用。
关键词 :柴胡皂苷单体,解脲支原体,阿奇霉素,体外抗菌活性
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支原体感染已经成了泌尿系感染中比较普遍的现象,当机体免疫力低下或者黏膜受损时,粘附于细胞表面的解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)导致细胞损伤,炎症上行,引起非淋球菌性尿道炎,进而引发前列腺炎、肾盂肾炎、女性盆腔炎、阴道宫颈感染等多种疾病,并可能与女性不孕、习惯性流产、胎儿宫内发育迟缓有关 [
阿奇霉素针剂,购自东北制药企业沈阳第一制药有限公司。支原体液体培养基珠海迪尔生物工程有限公司。受试菌株,阿奇霉素耐药支原体菌株分离株20株,源自市一医院妇产科及皮肤科。临床分离培养后经液体培养阿奇霉素药敏MIC ≥ 64 ug/ml。柴胡皂苷d购自中国药品生物制品鉴定所。
用无水乙醇将柴胡皂苷单体d (1 g)全部溶解,再加灭菌的双蒸水至需要的体积,稀释浓度为1280 ug/ml备用。阿奇霉素针剂同样用灭菌的双蒸水配成浓度为1280 ug/ml的备用液。将配置好的柴胡皂苷d及阿奇霉素药液置于4度冰箱备用。
受试菌株从临床分离后,平时贮存于−196℃液氮中。使用时室温解冻,再接种至支原体液体培养基,置于37℃恒温箱中48小时,至生长最佳状态(CFU > 104) [
棋盘微量稀释法能比较明确地检测出两种不同药物,当它们以不同浓度的比例混合时,抗菌的效果究竟是叠加还是拮抗会比较明确。测定两种药物共同作用的最低抑菌浓度,需要使两块96小孔板,每个孔中既含有各种浓度的阿奇霉素与Sd的混悬液,又含有不同浓度的阿奇霉素单药与不同浓度的Sd单药。
操作步骤:阿奇霉素的最高浓度为256 ug/ml,柴胡皂苷d的最高浓度为512 ug/ml,并在20根无菌小试管中对两种药物进行10级倍比稀释。在2块96孔板中,最上面的一排和最左边的一列的1~10小孔中分别加入50 ul两种不同浓度组合的阿奇霉素和柴胡皂苷d溶液,在100个孔中形成100个不同药物浓度组合,然后每个小孔中加入100 ul培养生长良好的支原体菌悬液。横向第11排测仅有阿奇霉素作用时的MIC值,纵向第11列测柴胡皂苷d单独作用时的MIC值。加200 ul支原体液小孔(不加其他抗菌液)作为支原体正常的对照,单单加200 ul液体支原体培养基(不加药物)作为空白对照。在37℃培养48小时,记录单独应用两药的MIC值,并选择最佳组合效应时两药各自的MIC。
两种抗菌药物相互作用方式判定:计算部分抑菌浓度指数(FIC),计算的公式为:FIC指数 = A药联合时MIC/A药单用时MIC + B药联合时MIC/B药单用时MIC。当FIC指数小于等于0.5时,为协同作用;当FIC指数在0.5和1之间时,为相加作用;当FIC指数在1和2之间,认为它们的相互作用无关;当FIC大于2,为拮抗作用。
最后结果的判读:将两块96孔板置于37℃恒温箱中放置48小时,采用宏观视觉判断结果。药物敏感终点判读参考M-27中对微量液体培养基稀释法的标准,抗生素类药物以80%抑菌作为观察终点,判断最低抑菌浓度(MIC)。柴胡单体的结果判断参照抗生素类药物进行。
采用SPSS11.0分析处理数据,这两种药物单独使用和和共同作用的MIC值转换成对数后,再进行配对资料t检验。如果P < 0.05,则认为有统计学意义。
单独用药时,阿奇霉素的最低抑菌浓度MIC值的范围为64~128 ug/mL,MIC的几何均数值(GM值)为1.941 ug/mL。联合用药时,阿奇霉素的MIC范围为8~32 ug/mL,GM值为1.189 ug/mL。将单独用药MIC值(C)和联合用药MIC值(D)转换成对数后,进行配对资料t检验,组别之间的差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
仅仅使用一种药物时,Sd的MIC范围是2~32 ug/mL,MIC的几何均数值(GM值)为1.008 ug/mL。当两种药共同作用时,Sd的MIC范围为0.5~8 ug/mL,GM值为0.346 ug/mL。将使用一种药物的MIC值(A)和共同作用时的MIC值(B)转换成对数后,再进行配对资料t检验,结果显示两组差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
编号 | Sd MIC | Azi MIC | FIC | 作用方式 | ||
---|---|---|---|---|---|---|
单用药A | 联合用药B | 单用药C | 联合用药D | |||
M1 | 8 | 1 | 64 | 16 | 0.375 | 协同 |
M2 | 8 | 2 | 64 | 16 | 0.500 | 相加 |
M3 | 16 | 4 | 128 | 16 | 0.375 | 协同 |
M4 | 8 | 0.5 | 64 | 8 | 0.375 | 协同 |
M5 | 32 | 8 | 128 | 16 | 0.375 | 协同 |
M6 | 16 | 4 | 64 | 8 | 0.375 | 协同 |
M7 | 16 | 2 | 64 | 16 | 0.375 | 协同 |
M8 | 16 | 8 | 128 | 16 | 0.375 | 协同 |
M9 | 32 | 8 | 128 | 32 | 0.500 | 相加 |
M10 | 16 | 2 | 64 | 16 | 0.375 | 协同 |
M11 | 16 | 4 | 128 | 32 | 0.375 | 协同 |
M12 | 8 | 2 | 64 | 16 | 0.500 | 相加 |
M13 | 4 | 2 | 64 | 32 | 0.750 | 相加 |
M14 | 16 | 4 | 128 | 32 | 0.500 | 相加 |
M15 | 2 | 0.5 | 64 | 8 | 0.500 | 相加 |
M16 | 4 | 1 | 64 | 16 | 0.500 | 相加 |
M17 | 16 | 4 | 128 | 16 | 0.375 | 协同 |
M18 | 8 | 2 | 128 | 32 | 0.500 | 相加 |
M19 | 16 | 2 | 128 | 32 | 0.375 | 协同 |
M20 | 2 | 0.5 | 64 | 16 | 0.500 | 相加 |
ATCC27813 | 0.5 | 0.5 | 64 | 16 | 0.750 | 相加 |
表1. Sd与Azi对支原体耐药株的MIC值(ug/ml)及相互作用方式判定
阿奇霉素与Sd联合用药时,体外的相互作用关系在11株表现为协同作用方式,在9株表现为相加作用方式。见表1。
柴胡皂苷d在体外对耐阿奇霉素的解脲支原体耐药株有明显的抑制作用,与阿奇霉素的作用表现为协同作用或者相加作用。
阿奇霉素属于大环内酯类抗生素,它作为指南推荐的抗支原体一线治疗药物,在临床使用中,胃肠道的副作用发生率很高,多数患者都会出现恶心、食欲不振等肠胃不适,严重者呕吐。并且在近几年的研究中发现,它的耐药率比例也较高,导致临床治疗失败案例逐渐增多,导致感染的病情迁延不愈 [
为了克服这些合成化合物存在的诸多弊端,一些医药科技工作者逐渐将研究重点转向了天然药物,在全球范围内掀起了研制和开发天然药物的热潮。柴胡皂苷d在我们的实验中也显示了很强的抑菌活性。那么它的抑菌作用机理还没有一个准确的认识。陈志宝(文献)等人研究了柴胡皂苷a对金黄色葡萄球菌的抑菌作用 [
阿奇霉素是大环内酯类抗生素,通过与细菌核糖体50s亚基结合,阻碍细菌转肽过程,抑制依赖于RNA的蛋白质合成从而达到抗菌作用。支原体对它的耐药产生机制主要是生物膜的形成,生物膜增强了Uu对大环内酯类、四环素等多种常用抗生素的抵抗力 [
一个新的化合物或者中药的某种成分成为一种新的抗菌药物,是一个漫长的过程,这其中最开始的前期研究就是发现它在体外的抗菌活性,利用较为简便的实验方法,例如液体微量稀释法,来测试它对致病菌的抑制作用或者杀菌作用,为后续的深入研究打下基础。就柴胡皂苷d而言,朴英兰沈亮亮 [
贾亚利,刘珏,吴黎明,蔡莺莲,吴盛海. 柴胡皂苷d与阿奇霉素抗耐药支原体活性的对比研究A Comparative Study on the Activity of Saikosaponin d and Azithromycin against Mycoplasma[J]. 医学诊断, 2018, 08(03): 49-54. https://doi.org/10.12677/MD.2018.83008