目的:评估新型含铜避孕复合材料(聚乙烯醇,二氧化硅纳米颗粒高分子复合材料)在哺乳动物体内外遗传毒性及损伤修复能力。方法:采用彗星实验测定细胞DNA损伤程度,含铜复合材料50%,25%浸提液处理后以及继续培养3小时后检测细胞内活性氧类物质(Reactive Oxygen Species, ROS)荧光强度,测定染毒后小鼠血浆中超氧化物歧化酶活力(superoxidantase, SOD)。结果:① 细胞经两个不同含铜复合材料浸提液浓度处理3小时后,细胞DNA受损,继续培养3小时后,细胞受损程度有所增加,细胞内ROS含量在处理后和继续培养3小时平均荧光强度与阴性对照组相比有明显升高;② 雌性小鼠于染毒后第2、3、4天血细胞DNA损伤程度最严重,第5天DNA损伤有明显降低,血浆内SOD含量第3天达到高峰。雄性小鼠于染毒后第4天DNA损伤最严重,第6天明显降低,SOD含量于第4天和第7天显著升高。结论:虽然含铜材料在体外可以使细胞DNA受损,体内的损伤修复机制可以使受损细胞修复并抑制铜离子进一步对细胞的损伤,SOD在损伤修复中可能发挥一定的作用。 Objects: To evaluate the genotoxicity and damage repair ability of novel copper-containing con-traceptive composites (polyvinyl alcohol and silica nanoparticle composites) in mammals. Methods: The degree of DNA damage was estimated by comet assay. The fluorescence intensity of in-tracellular reactive oxygen species (ROS) was detected after treatment with 50% and 25% cop-per-containing composite leaching solution, and further cultured for 3 hours. The Superoxide dismutase activity (SOD) in plasma was measured by WST. Results: ① Cells DNA were damaged after treatment with three different concentrations of copper-containing composite extracts for 3 hours. After 3 hours of continuous culture, the degree of cell damage was increased and the intra-cellular ROS was significantly increased compared with the negative control group; ② In female mice, the DNA damage degree was the most serious on the 2nd, the 3rd and the 4th day after treatment and significantly reduced on the 5th day. The content of SOD in plasma reached its peak on the 3rd day. The DNA damage degree of male mice was the most on the 4th day after the infec-tion, and obviously decreased on the 6th day. The content of SOD increased significantly on the 4th day and the 7th day. Conclusions: Although copper-containing materials can damage cellular DNA in vitro, the mechanism of damage repair in vivo can repair part damaged cells and inhibit further copper damage on cells with SOD playing a role in injury repair.
——含铜材料遗传学毒性
王兴刚1,方纳1,曹聪聪1,谢世明1,索进平2,黄勋彬1,3*
1华中科技大学同济医学院生殖医学中心,湖北 武汉
2华中科技大学材料科学与工程学院,湖北 武汉
3华中科技大学同济医学院计划生育研究所,湖北 武汉
收稿日期:2018年12月18日;录用日期:2019年1月2日;发布日期:2019年1月9日
目的:评估新型含铜避孕复合材料(聚乙烯醇,二氧化硅纳米颗粒高分子复合材料)在哺乳动物体内外遗传毒性及损伤修复能力。方法:采用彗星实验测定细胞DNA损伤程度,含铜复合材料50%,25%浸提液处理后以及继续培养3小时后检测细胞内活性氧类物质(Reactive Oxygen Species, ROS)荧光强度,测定染毒后小鼠血浆中超氧化物歧化酶活力(superoxidantase, SOD)。结果:① 细胞经两个不同含铜复合材料浸提液浓度处理3小时后,细胞DNA受损,继续培养3小时后,细胞受损程度有所增加,细胞内ROS含量在处理后和继续培养3小时平均荧光强度与阴性对照组相比有明显升高;② 雌性小鼠于染毒后第2、3、4天血细胞DNA损伤程度最严重,第5天DNA损伤有明显降低,血浆内SOD含量第3天达到高峰。雄性小鼠于染毒后第4天DNA损伤最严重,第6天明显降低,SOD含量于第4天和第7天显著升高。结论:虽然含铜材料在体外可以使细胞DNA受损,体内的损伤修复机制可以使受损细胞修复并抑制铜离子进一步对细胞的损伤,SOD在损伤修复中可能发挥一定的作用。
关键词 :复合物,铜,DNA损伤,修复
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含铜宫内节育器(Intrauterine device, IUD)是一种避孕效果好、可复性强、经济方便的长效避孕方法,主要通过铜离子释放引起局部免疫反应起避孕作用 [
机体对于铜离子刺激产生的过量ROS首先出现的是抗氧化酶的活性增加,以清除过量的ROS从而维持细胞内的氧化还原平衡,降低ROS的损伤。体内抗氧化酶主要包括:超氧化物歧化酶(superoxidantase, SOD)、过氧化氢过氧化物酶、谷胱甘肽酶等。细胞内的O2-可以被超氧化物歧化酶(SOD)还原为H2O2,然后通过过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶催化下转化为无毒的H2O。机体内存在许多代谢系统,铜离子被吸收入血,在体内再分布,经过一系列的代谢反应,能否将过量离子造成的损伤降低,同时,机体对已受损细胞能否进行修复这仍然值得我们去探讨。Saleha Banu等 [
本研究采用连续染毒小鼠的方式检测小鼠体内在连续较高浓度铜离子浸提液注射的条件下,通过血细胞检测机体DNA损伤程度,通过检测体内ROS含量推断机体对铜离子造成的DNA损伤修复能力。同时,通过WST法检测染毒后血浆中SOD含量的变化,从而对体内损伤修复机制进行研究。
所用新型复合材料由华中科技大学材料科学与工程学院模具技术国家重点实验室制作。小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y/tk+/− 3. 7.2 C)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(中国上海)。昆明小鼠(Kunming Mouse),20只,雌雄各半,体重25~30 g,购买于华中科技大学同济医学院动物中心。动物实验方案严格按照华中科技大学同济医学院伦理委员会的规定执行。
按照ISO 10993-12:2007指南制备样品的要求,将材料称量后装入洁净干燥玻璃瓶中,高压蒸汽灭菌30分钟。按照材料重量/体积0.2 g/ml浸提比例加入浸提液——无血清的RMPI 1640培养基用于小鼠淋巴瘤测定和彗星测定,生理盐水用于微核试验。密封瓶口,37℃培养箱中浸提24小时,将浸提液转入无菌玻璃瓶中,4℃保存。
用含铜高分子复合材料50%和25%浸提液浓度处理细胞3小时,将处理3小时后的细胞用PBS洗涤3遍后,R-10调整密度至2 × 105/ml,制胶、裂解、解旋、电泳和染色分析尾部DNA含量(Tail DNA%)和Olive尾距(Olive Tail Moment, OTM)。
用高浓度金属铜离子浸提液(100%)染毒动物,腹腔注射连续染毒七天,染毒剂量为1.5 ml/100g体重。染毒前和每次染毒后24小时断尾取血6 µl加入至94 µl 37℃预热的PBS中,吹散混匀,置于37℃水浴锅中,用于彗星实验检测。按照染毒时间标记,分别标记为0D、1D、2D、3D、4D、5D、6D、7D组,分别代表染毒前,第一次染毒后24小时(染毒1次)、48小时(染毒2次)、3天(染毒3次)……直至第一次染毒后7天(染毒7次)。
用含铜高分子复合材料50%和25%浸提液浓度处理细胞,用不含血清培养基洗涤细胞3次,将DCFH-DA按照1:1000用无血清培养基稀释,是最终浓度为10 µmol/L,加入适当的体积重悬细胞,密度约为1 × 106/ml,37℃避光震荡孵育20分钟。用无血清培养基洗涤3次,以充分洗去多余DCFH-DA。检测、拍照和分析。
染毒前以及每次染毒后24小时分别断尾取血,用柠檬酸钠抗凝EP管收集血液,WST法检测血浆内SOD活力单位。
对Tail DNA%,Olive尾距运用SPSS13.0软件进行统计学分析,ANOVA检验将各实验组与阴性对照组进行比较,P < 0.05为具有统计学意义。
细胞经两个浓度处理3小时后,细胞DNA出现不同程度的损伤,去除培养物后细胞DNA损伤出现差异,而有些细胞损伤明显增加,与处理组比较有显着性差异(P < 0.05)。相反,培养6小时后,大部分细胞恢复正常。(如图1(A)所示) ROS也显示了类似的趋势,彗星图像将CASP分析后,分析结果见表1,图1(B)。可以看出,ROS在细胞内产生的越多,DNA损伤程度越高。
检测的各时间点,细胞内均可观察到不同强度的荧光,经含铜复合材料25% (铜离子浓度为3.18 mg/L)处理3小时后,细胞荧光强度明显增加,去除培养物继续培养3小时后,细胞荧光强度仍增加。但是,培养6小时后,荧光强度有所减弱(如图1(C)所示)。
结果显示雌性小鼠于染毒后第2、3、4天DNA损伤程度最严重,雄性小鼠于染毒后第4天DNA损伤最严重。雌性小鼠第5天DNA损伤有明显降低,雄性小鼠第6天明显降低。(图2(A),图2(B),表2)
雌性小鼠体内SOD活力第3天达到高峰,雄性小鼠体内SOD含量第4天、第7天显著升高,同时结果表明雌性小鼠体内SOD含量普遍较雄性小鼠体内含量高(图2(C))。
图1. 体外DNA损伤修复能力和不同时间点的ROS浓度。(A) 是两组材料浸提液处理细胞后DNA损伤水平数字1~3表示含铜复合材料50%再培养0、3、6小时组,4~6表示含铜复合材料25%组再培养0、3、6小时组;7为阴性对照组;*表示与未再培养组相比,DNA损伤显着增加。(B) 是不同组在不同时间点的典型彗星图像。(C) 是ROS的结果。图中0小时表示细胞被新的复合物处理而没有重新培养,3小时表示细胞再培养3小时,6小时表示细胞再培养6小时。a~c表示含铜复合材料50%组,d~f含铜复合材料25%组
图2. 体内DNA损伤修复能力和随时间变化的SOD活性趋势。(A) 是不同染毒时间后血细胞彗星实验的典型彗星图像。a,c,e,g,i,k,m和n是雌性小鼠的图像,其余的是雄性小鼠的图像。同时,a和b是染毒前,c和d是染毒后24小时,e和f是染毒后48小时,o和p是染毒后7天。(B) 是不同染毒时间后的DNA损伤程度。(C) 是雌雄小鼠体内不同染毒时间血浆SOD活性单位变化趋势
分组(铜离子浓度:mg/L) | Tail DNA% (Mean ± SD) | OTM (Mean ± SD) |
---|---|---|
1含铜复合材料50% (6.37) | 20.29 ± 11.22Δ | 38.52 ± 27.79Δ |
2含铜复合材料50%培养3小时 | 35.79 ± 30.2*Δ | 74.63 ± 57.52*Δ |
3含铜复合材料50%培养6小时 | 3.93 ± 3.98 | 6.35 ± 5.31 |
4含铜复合材料25% (3.18) | 15.72 ± 6.04Δ | 30.46 ± 14.31Δ |
5含铜复合材料25%培养3小时 | 24.97 ± 17.83*Δ | 55.11 ± 43.63*Δ |
6含铜复合材料25%培养6小时 | 3.93 ± 3.99 | 6.25 ± 6.13 |
7阴性对照 | 6.88 ± 4.29 | 2.42 ± 2.11 |
表1. 两组材料浸提液处理细胞3小时与继续培养0,3,6小时彗星实验结果
*表示与同浓度处理3小时后相比具有统计学差异(P < 0.05);Δ表示与阴性对照组相比具有统计学意义(P < 0.05)。
时间 | Tail DNA% | OTM | ||
---|---|---|---|---|
雄性 (Mean ± SD) | 雌性 (Mean ± SD) | 雄性 (Mean ± SD) | 雌性 (Mean ± SD) | |
0 D | 1.19 ± 1.94 | 1.61 ± 1.49 | 0.93 ± 1.87 | 1.14 ± 1.06 |
1 D | 35.32 ± 15.06* | 33.80 ± 15.51* | 33.23 ± 21.87* | 35.25 ± 28.65* |
2 D | 36.03 ± 17.91* | 55.41 ± 15.01* | 28.05 ± 16.96* | 28.58 ± 16.97* |
3 D | 47.14 ± 18.33* | 51.05 ± 20.22* | 37.64 ± 21.93* | 40.03 ± 29.01* |
4 D | 57.20 ± 15.93* | 51.99 ± 18.94* | 42.62 ± 23.69* | 41.13 ± 32.04* |
5 D | 44.65 ± 17.01* | 35.29 ± 13.37* | 45.26 ± 31.14* | 28.26 ± 22.58* |
6 D | 30.89 ± 15.91* | 18.91 ± 14.37* | 18.56 ± 17.47* | 15.71 ± 15.79* |
7 D | 10.81 ± 6.81* | 11.25 ± 7.89* | 2.67 ± 3.59 | 5.16 ± 5.95 |
表2. 不同染毒时间后血细胞彗星实验分析结果
*表示:与阴性对照组相比具有统计学意义,P < 0.05。
许多研究表明,金属铜释放的铜离子通过体内的氧化还原反应,生成ROS [
本研究用两种不同浓度浸提液处理细胞3小时后去除处理物继续培养3小时和6小时,经彗星实验检测发现继续培养3小时后,虽然发现平均细胞DNA损伤增加,但损伤较小细胞DNA已经开始修复,虽不能完全解释DNA修复程度,但具有一定的意义。而继续培养6小时后,损伤恢复正常。为更好的检测体外实验结果,应进行更长时间修复。由于小鼠淋巴瘤生长周期为10小时,细胞体外培养超过10小时后细胞进行分裂,无形之中即会降低DNA损伤程度。因此,为了更好的研究DNA损伤修复能力,我们进行了体内连续染毒实验,检测不同时间点DNA损伤程度,以此作为判断机体对DNA损伤修复的能力。结果表明,染毒后血细胞DNA损伤程度先逐渐增加(Tail DNA%逐渐增加),染毒24小时后雄性、雌性小鼠尾DNA含量分别为35.32%、33.80%,48小时后为:36.03%、55.41%,3天后为:47.14%、51.05%,第4天为:57.20%、51.99%。虽然期间有一定的波动性(雌性小鼠第二三四天尾DNA含量基本相同),但随着染毒次数的增加,小鼠血细胞DNA损伤呈递增关系。但从第五天开始,尾DNA含量逐渐降低,表明细胞损伤得到了一定的修复。染毒后第6天,第7天尾DNA含量虽然与染毒前统计学分析后仍有统计学差异,但与损伤最严重时相比有大幅降低。
体内对于由过量ROS而造成的DNA损伤主要存在三种修复途径。首先是抗氧化体系来清除过量的ROS,主要包括SOD、过氧化氢酶等;其次是DNA损伤的修复体系,通过碱基修复、核酸修复、同源重组修复等修复轻度受损的DNA;最后是DNA损伤检验点修复,通过基因表达调控使细胞对于损伤进行反应,使受损细胞恢复正常或促进细胞发生凋亡。这三种途径相互作用,使受损后的细胞恢复或凋亡,降低其对机体的影响。虽然体内彗星实验检测到铜离子可以对DNA造成损伤,但也有学者通过Ecoli检测到过量铜离子并未对其造成损伤,这可能是由于体内剩余的铜离子可以与配体结合,从而抑制ROS的生成或者使形成的ROS远离DNA [
虽然含铜复合材料和金属铜在体内外均可导致一定的遗传毒性,可以使细胞DNA发生不同程度的损伤。但是,机体对于由铜离子造成的DNA损伤具有一定的修复能力,因此,铜离子对组织细胞的遗传毒性取决于局部铜离子浓度、接触时间以及机体自身修复功能的相互作用。
本研究获得武汉科学技术局科研资助,项目(201706201010213),在此表示诚挚的感谢。
王兴刚,方 纳,曹聪聪,谢世明,索进平,黄勋彬. 新型含铜避孕复合材料的遗传毒性评估及体内DNA损伤修复——含铜材料遗传学毒性Evaluation of Genotoxicity and Repair of DNA Damage in a Novel Copper-Containing Contraceptive Composites—Genotoxicity of Copper-Containing Composite[J]. 材料科学, 2019, 09(01): 9-17. https://doi.org/10.12677/MS.2019.91002