旨在了解海产品墨鱼干表面白斑的微生物区系,并从中分离耐盐的微生物资源。以市售表面带白斑的墨鱼干为样品,利用含5% NaCl牛肉膏蛋白胨平板分离纯化出一株耐盐细菌NYJ2,检测了菌株的菌落和细胞形态特征、部分生理生化特性,进行16S rDNA部分序列测序和系统发育分析。结果表明从白斑分离出一种枝芽胞杆菌,在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中可生长,最适1%~10% NaCl,是中度嗜盐菌;生长酸碱度范围是pH 5~8;生长温度范围是10℃~46℃,最适25℃~42℃;可利用10℃以下低温,或者用0.05%乳酸链球菌素抑制菌株NYJ2的生长繁殖。 This paper is aimed to investigate the microflora of the white plaque existing at the surface of dried cuttlefish, and to isolate salt-tolerated microbial resources. The commercially available dried cuttlefish with white plaque were sampled, and a salt-tolerated bacterium, strain NYJ2, was isolated and purified on the Beef-extract-peptone Plate containing 5% of NaCl. The morphological characteristics of the colonies and cells, and several biochemical and physiological characteristics of the strain were detected, and partial sequence of the 16S rDNA was sequenced and phylogenetic analysis was performed. The results showed that a Virgibacillus sp. NYJ2 was isolated and identified from the white plaque, and it can grow in Beef-extract-peptone broth containing 0.5%~15% of NaCl, and optimum at 1%~10% of NaCl, belonging to moderately halophilic bacteria. Its growth occurs at pH 5~pH 8, 10˚C~46˚C and the optimum temperature ranges from 25˚C to 42˚C. Low-temperature below 10˚C, or 0.05% of Nisin could be used to inhibit the growth and reproduction of the strain NYJ2.
伏靖1,陈盼1,陈茂华1,许爱清1,2*
1湖南科技大学生命科学学院,湖南 湘潭
2重金属污染土壤生态修复与安全利用湖南省普通高等学校重点实验室,湖南 湘潭
收稿日期:2019年1月4日;录用日期:2019年1月16日;发布日期:2019年1月23日
旨在了解海产品墨鱼干表面白斑的微生物区系,并从中分离耐盐的微生物资源。以市售表面带白斑的墨鱼干为样品,利用含5% NaCl牛肉膏蛋白胨平板分离纯化出一株耐盐细菌NYJ2,检测了菌株的菌落和细胞形态特征、部分生理生化特性,进行16S rDNA部分序列测序和系统发育分析。结果表明从白斑分离出一种枝芽胞杆菌,在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中可生长,最适1%~10% NaCl,是中度嗜盐菌;生长酸碱度范围是pH 5~8;生长温度范围是10℃~46℃,最适25℃~42℃;可利用10℃以下低温,或者用0.05%乳酸链球菌素抑制菌株NYJ2的生长繁殖。
关键词 :墨鱼干,中度嗜盐菌,枝芽胞杆菌,生长特性
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墨鱼干是新鲜墨鱼经过剖割、除内脏、洗涤、出晒、整形、罨蒸发花和包装等工序制成的墨鱼制品。在超市销售的袋装或散装墨鱼干表面都常见有白色斑块。通常认为白斑形成是罨蒸发花工序的结果,它使七成干的鱼肉内部水分向外扩张,体内甜菜碱等氮素化合物析出干燥而成白粉状附着物 [
实验采样:市售袋装墨鱼干,表面有白斑;牛肉膏蛋白胨培养基(含5% NaCl):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 50 g、去离子水1000 mL,pH 7.2~7.4,115℃灭菌30 min。
磁珠法细菌基因组DNA抽提试剂盒,Taq DNA多聚酶(含Taq DNA Polymerase、10× PCR Buffer和MgCl2),细菌通用引物27F和1492R,dNTPs Mixture Solution:生工生物工程(上海)股份有限公司;稳压稳流电泳仪(SCR-600A,中国上海康华生化仪器制造厂); PCR扩增仪(Eppendorf AG 22331 Hamburg,德国Eppendorf AG公司);倒置荧光显微镜(Leica DMi8,德国Leica 公司)。
取袋装的墨鱼干一片,用无菌手术刀刮取表面白斑碎屑约1 g,转接到牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中,于25℃恒温振荡箱中150 r/min培养24 h,富集培养耐盐细菌;适度稀释菌悬液,涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板(5% NaCl),28℃恒温箱中倒置培养48 h;继续用接种环挑取单菌落划线分离纯化,得到耐盐细菌NYJ2。
挑取牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中NYJ2培养物制作细菌涂片,石炭酸复红染料染色后,使用倒置荧光显微镜观察菌体细胞形态。
用牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中25℃恒温150 r/min振荡培养24 h的NYJ2培养物,按1%接种量(V/V)接种于100 ml含NaCl浓度(W/V)为0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%和32%的牛肉膏蛋白胨培养液,25℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h,观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况,评判菌体细胞的生长耐盐性。
用牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中25℃恒温150 r/min振荡培养24 h的NYJ2培养物,按1%接种量(V/V)接种于100 ml牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中,分别在10℃、25℃、37℃、42℃、46℃和55℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h,观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况,评判菌体细胞的生长温度适应性。
用NaOH(或HCl)试剂调整牛肉膏蛋白胨液体培养液(含5% NaCl)的pH值。将新鲜NYJ2培养物按1%接种量(V/V)接种于100 ml pH值为4、5、6、7、8、9的牛肉膏蛋白胨培养液中,25℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h,观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况,评判菌体细胞的生长pH适应性。
移取菌株NYJ2的牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)培养物,离心(10,000×g, 10 min)收集菌体细胞。用磁珠法细菌DNA抽提试剂盒提取基因组DNA,以1.0%琼脂糖电泳检测所提取的基因组DNA质量。以合适的PCR反应体系和反应条件 [
利用LPSN数据库检索枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)和芽胞杆菌属(Bacillus)的菌种名和模式菌株,查找到部分菌株的16S rDNA序列在Genbank中的登录号,用于菌株NYJ2的系统发育分析。选择建树用枝芽胞杆菌的特征是:1) 分离自中国的盐湖海洋等自然环境;2) 分离自传统发酵食品基质;或3) 在含0%~20%的NaCl盐度下能生长的耐盐菌。分析菌株NYJ2的系统发育地位时,首先运用ClustalW 1.8.3程序将所选模式菌株与待测菌株NYJ2的16S rDNA序列进行多序列比对;其次运用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0.26构建N-J系统发育树。系统发育树的可靠性检测的自举值设定为1000次,以枯草芽胞杆菌做外群。
参照国家标准 [
从墨鱼干样品中分离纯化到耐盐菌株NYJ2,它在牛肉膏蛋白胨培养基(5% NaCl)平板上,28℃培养48 h生长形成的菌落呈乳白色、隆起、边缘整齐。在牛肉膏蛋白胨培养液(5% NaCl)中28℃恒温振荡培养48 h,在室温下静置半小时可见培养液底部出现絮凝状物。显微镜镜检细菌涂片观察到菌体细胞呈杆状或短杆状。
耐盐度测定结果是菌株NYJ2在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液均可生长繁殖,其中1%~10% NaCl生长良好。在无NaCl和高于15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中未见生长。表明菌株NYJ2是一种中度嗜盐菌。
生长温度范围试验结果是菌株NYJ2在10℃、25℃、37℃、42℃、46℃试验点下可生长繁殖,其中25℃~42℃生长最好,55℃未见生长。
生长pH范围试验结果是菌株NYJ2在pH 5~8范围内均可生长繁殖,而在pH 4和pH 9时未见生长。
提取NYJ2的基因组DNA后,进行16S rDNA部分序列PCR扩增,PCR产物测序得1490 bp核苷酸片段,在Genbank中提交的登录号是KT149393。序列在Genbank中进行BLAST搜索比对,结果表明它与枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)和芽胞杆菌属(Bacillus)中的部分菌株的16S rRNA基因序列的一致性高达98%。选择枝芽胞杆菌属中的一些模式菌株与待测菌株NYJ2的16S rRNA基因序列构建系统发育树(见图1),菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属的模式株盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)聚类在同一分枝,表明两者之间的亲缘关系最近。因此,鉴定NYJ2是一种枝芽胞杆菌,暂定名为Virgibacillus sp. NYJ2。
试验结果见表1。在最大容许剂量下,山梨酸钠(0.1%)、苯甲酸钠(0.1%)、双乙酸钠(0.1%)、脱氢乙酸钠(0.05%)和焦亚硫酸钠(0.01%)都不能抑制菌株NYJ2生长繁殖。只有0.05%的乳酸链球菌素有抑制该菌生长繁殖的效果。
本研究表明枝芽胞杆菌与墨鱼干表面白斑的形成有一定关系,它对产品安全性或品质影响应引人关注。根据文献资料 [
研究人员对枝芽胞杆菌属在食品中的生态分布持乐观的评价。枝芽胞杆菌属能够促进食品发酵的进程以及改善发酵食品的风味,如韩国的发酵酱(Jeotgal) [
图1. 基于16S rRNA基因构建的N-J系统发育树
食品防腐添加剂 | 添加量(%) | 生长状况 | 食品防腐添加剂 | 添加量(%) | 生长状况 |
---|---|---|---|---|---|
山梨酸钠 | 0.1 | + | 双乙酸钠 | 0.1 | + |
0.05 | + | 0.05 | + | ||
0.025 | + | 0.025 | + | ||
0.0125 | ++ | 0.0125 | ++ | ||
苯甲酸钠 | 0.1 | + | 脱氢乙酸钠 | 0.05 | + |
0.05 | + | 0.025 | + | ||
0.025 | + | 焦亚硫酸钠 | 0.01 | + | |
0.0125 | ++ | 0.0005 | ++ | ||
乳酸链球菌素 | 0.05 | - |
表1. 食品防腐添加剂对菌株NYJ2生长繁殖的影响
注:“-”表示培养液澄清,无菌生长;“+”表示培养液微浑浊菌已生长;“++”表示培养液浑浊,菌明显生长。
序号 | 名称 | 耐盐度(%) | 生长温度(℃) | 生长酸碱度 | 分离环境 |
---|---|---|---|---|---|
1 | V. halodenitrificans | 2~23 (3~7) | 10~45 (35~40) | 5.8~9.6 (ND) | 法国盐田 |
2 | V. byunsanensis | 0~20 (8) | 4~40 (ND) | 6.0~ND (7.0~8.0) | 韩国盐田 |
3 | V. campisalis | 0.5~20 (4~5) | 15~40 (37) | 6.0~9.0 (7.5~8.0) | 韩国盐田 |
4 | V. koreensis | 0~20 (5~10) | 10~45 (25) | 5.5~9.0 (7.0) | 韩国盐田 |
5 | V. halophilus | 0~18 (ND) | 5~45 (ND) | 5.0~10.0 (ND) | 日本挂川(Kakegawa)野外土样 |
6 | V. sediminis | 1~20 (5~10) | 10~55 (35~40) | 6.0~10.5 (7.5~8.0) | 柯柯盐湖沉积物(中国西北) |
7 | V. kekensis | 0~25 (10) | 10~50 (37) | 6.0~10.0 (7.0) | 柯柯盐湖水(中国西北) |
8 | V. albus | 1~17 (5~10) | 15~45 (25~30) | 4.0~9.0 (7.0) | 中国罗布泊盐湖土样 |
9 | V. xinjiangensis | 0~20 (5~7) | 8~52 (32~35) | 6.5~9.5 (7.5~8.0) | 中国新疆盐湖 |
10 | V. subterraneus | 0~25 (9) | 10~50 (30) | 6.0~9.0 (7.5) | 柴达木盆地盐碱土样(中国) |
11 | V. salinus | 3~20 (10) | 15~40 (37) | 6.0~10.0 (7.5) | 锡林浩特附近盐湖沉积物(中国内蒙古) |
12 | V. zhanjiangensis | 1~15 (4~7) | 10~45 (30) | 6.0~10.0 (6.5) | 硇洲岛潮滩海水(中国南海) |
13 | V. litoralis | 2~25 (5~10) | 10~45 (30) | 6.0~10.0 (8.0) | 硇洲岛盐渍土(中国南海) |
14 | V. chiguensis | 0~30 (5~10) | 15~50 (40) | 5.0~9.0 (7.5) | 台南七股地区废弃盐场 |
15 | V. soli | 3~20 (10) | 15~40 (37) | 6.0~10.0 (7.5) | 台湾阳明山土样 |
16 | V. halotolerans | 0.5~16.5 (3~5) | 8~35 (27~30) | 6.5~8.5 (7.0~8.0) | 德国牛奶制品 |
---|---|---|---|---|---|
17 | V. alimentarius | 0~30 (9~10) | 4~40 (37) | 7.0~11.0 (10.0) | 韩国高盐发酵斑鰶(gizzard shad)食品 |
18 | V. siamensis | 1~20 (5~10) | 10~55 (35~40) | 6.0~10.5 (7.5~8.0) | 泰国发酵鱼(Pla-Ra) |
19 | Virgibacillus sp. NYJ2 | 0.5~15 (1~10) | 10~46 (25~42) | 5~8 | 墨鱼干 |
表2. 菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属部分模式菌株的生长特性的比较
从市售墨鱼干表面白斑分离纯化出一株耐盐细菌NYJ2。通过细胞形态特征、部分生理生化特性、16S rDNA测序和系统发育分析表明它是一种枝芽胞杆菌(Virgibacillus sp. NYJ2),是一种中度嗜盐菌,在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中可生长,最适1%~10% NaCl;生长酸碱度范围是pH 5~8;生长温度范围是10℃~46℃,最适25℃~42℃;可利用10℃以下低温,或者用0.05%乳酸链球菌素抑制其生长繁殖。
湖南省教育厅资助科研项目(16B095);湖南科技大学大学生科研创新计划项目(SYZ2015081, SYZ2018065)。
伏 靖,陈 盼,陈茂华,许爱清. 一株墨鱼干源枝芽胞杆菌的分离鉴定与生长特性Isolation Identification of a Virgibacillus sp. from Dried Cuttlefish and Its Growth Characteristics[J]. 食品与营养科学, 2019, 08(01): 45-51. https://doi.org/10.12677/HJFNS.2019.81006