目的:对比研究欧洲药典(European Pharmacopeia, EP)和世界卫生组织(World Health Organization, WHO)低分子肝素分子量对照品(均为宽分布对照品,下称EP对照品和WHO对照品)测定依诺肝素钠分子量和分子量分布。方法:以TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)为色谱柱,分别以0.2 mol•L−1硫酸钠水溶液(硫酸调pH值5.0)为流动相和0.1 mol•L−1醋酸铵水溶液为流动相,流速为0.5 mL•min−1,柱温30℃,紫外检测波长234 nm,示差折光检测器温度为35℃,进样量25 μL。结果:分别在两种流动相体系下,用EP对照品和WHO对照品,对依诺肝素钠CRS (EP,重均分子量标示量为4480 Da)、依诺肝素钠注射液(克赛®)、依诺肝素钠原料药(国产)和依诺肝素钠注射液(国产),进行分子量和分子量分布检查,各样品重均分子量差值均小于100 Da,分子量分布差值均小于1%。结论:通过八批样品试验验证,EP对照品和WHO对照品用于依诺肝素钠分子量和分子量分布测定结果无显著性差异。 Objective: Comparative study on the European Pharmacopeia (EP) and the World Health Organi-zation (WHO) low molecular weight heparin reference substances (RS) (both broad distribution reference substance, hereinafter referred to as EP RS and WHO RS), in the determination of the molecular weight and molecular weight distribution of enoxaparin sodium. Methods: A high per-formance size exclusion chromatography was applied by TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm) column. The mobile phase was 0.2 mol•L−1 sodium sulfate aqueous solution adjusted the pH value of 5.0 with sulfuric acid and 0.1 mol•L−1 ammonium acetate aqueous solution, respectively. An iso-cratic elution was performed at a flow rate of 0.5 mL•min−1, and the column temperature was maintained at 30˚C. UV detection with the wavelength at 234 nm was applied. A differential refrac-tion detector and its temperature was kept at 35˚C, with an injection of 25 μl was used. Results: By using EP RS and WHO RS in two different mobile phase systems, the molecular weight and molec-ular weight distribution of enoxaparin sodium CRS (weight-average molecular weight labeled as 4480 Da), enoxaparin sodium injection (clexane), enoxaparin sodium drug substance and enoxaparin sodium injection (self-produced) were determined. And according to the results, the difference of the weight-average molecular weight between samples was less than 100 Da, mean-while, the difference of the molecular weight distribution was less than 1%. Conclusion: The results of eight batches of samples showed that there was no significant difference in the determination of the molecular weight and molecular weight distribution for enoxaparin sodium via employing EP RS and WHO RS.
徐勤娟,崔洪萌*
威海海洋职业学院,山东 荣成
收稿日期:2019年1月7日;录用日期:2019年1月21日;发布日期:2019年1月28日
目的:对比研究欧洲药典(European Pharmacopeia, EP)和世界卫生组织(World Health Organization, WHO)低分子肝素分子量对照品(均为宽分布对照品,下称EP对照品和WHO对照品)测定依诺肝素钠分子量和分子量分布。方法:以TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)为色谱柱,分别以0.2 mol·L−1硫酸钠水溶液(硫酸调pH值5.0)为流动相和0.1 mol·L−1醋酸铵水溶液为流动相,流速为0.5 mL·min−1,柱温30℃,紫外检测波长234 nm,示差折光检测器温度为35℃,进样量25 μL。结果:分别在两种流动相体系下,用EP对照品和WHO对照品,对依诺肝素钠CRS (EP,重均分子量标示量为4480 Da)、依诺肝素钠注射液(克赛®)、依诺肝素钠原料药(国产)和依诺肝素钠注射液(国产),进行分子量和分子量分布检查,各样品重均分子量差值均小于100 Da,分子量分布差值均小于1%。结论:通过八批样品试验验证,EP对照品和WHO对照品用于依诺肝素钠分子量和分子量分布测定结果无显著性差异。
关键词 :依诺肝素钠,分子量和分子量分布,低分子肝素分子量对照品,宽分布对照品,重均分子量
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依诺肝素钠是新一代肝素类抗血栓药物,其分子量和分子量分布是其重要的质量控制指标。目前美国药典(USP 42),欧洲药典(EP 9.7),英国药典(BP 2018)均有收录依诺肝素钠 [
在分子量测定过程中EP对照品通过特殊的解聚方法在每一分子上引入一个发色团,在234 nm波长处有最大吸收,检测时需串联紫外检测器和示差检测器,紫外检测器响应值和摩尔浓度成正比,而示差检测器响应值和质量浓度成正比,两者比值和依诺肝素钠分子量成正比,比例常数的确定使用了对照品的数均分子量(Mna = 3800),因此需通过复杂的计算和手工取点的方式才能得到校正曲线。而WHO对照品提供了宽分布标样表,即分子量与累积面积百分比的对应表,检测时仅使用示差检测器,且不用分离出寡糖峰,检测和计算过程比较简便 [
EP低分子肝素分子量对照品(Heparin Low-Molecular-Mass for Calibration CRS,EP对照品。数均分子量Mna = 3800)从欧洲药监局购买,批号为batch 3。
WHO低分子肝素分子量对照品(Low Molecular Weight Heparin for Molecular Weight Calibration,WHO对照品)从英国国家生物制品检定所购买,批号为05/112。
依诺肝素钠CRS (Enoxaparin Sodium CRS,重均分子量标示量为4480 Da)从欧洲药监局购买,批号为batch 5。
依诺肝素钠注射液(克赛®)购自赛诺菲安万特公司,批号为4SC98、5SA66、5SL48。
依诺肝素钠原料药为国内某公司生产,批号为150402、150403。
依诺肝素钠注射液为国内某公司生产,批号为160202、160203。
岛津高效液相色谱仪20 A (紫外检测器、示差检测器、ALS自动进样器、二元泵),MS205DU型电子分析天平(METTLER TOLEDO)。
D-(+)-葡萄糖为优级纯(百灵威科技);葡聚糖2000为优级纯(上海迈瑞尔化学技术有限公司);硫酸、硫酸钠、醋酸铵为分析纯(西陇化工股份有限公司);水为娃哈哈纯净水。
1) 色谱条件:色谱柱:TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm);柱温:30℃;紫外检测器和示差检测器联用,紫外检测波长:234 nm,示差检测器温度:35℃;流速:0.5 mL·min−1;进样量:25 μL;流动相:0.2 mol·L−1硫酸钠水溶液(硫酸调pH值5.0)。
2) 溶液的制备:供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量,分别加硫酸钠流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液,分别作为供试品溶液1。
系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解,作为系统适用性溶液1。
EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解,作为EP对照品溶液1。
WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解,作为WHO对照品溶液1。
3) 实验过程:
专属性和系统适用性试验
分别取空白溶剂(0.2 mol·L−1硫酸钠水溶液)、“1.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、系统适用性溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL,注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰;系统适用性溶液1示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为21379,葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为8.80;依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.196 min)和葡聚糖2000 (保留时间为12.035 min)的保留时间之间。色谱图见图1。
图1. 硫酸钠体系专属性和系统适用性试验色谱图1
样品测定精密量取“2.2.1”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL,注入液相色谱仪,记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800),采用手工取18个点,以logM对保留时间T作三阶校正曲线,计算各供试品溶液的分子量和分子量分布;根据WHO对照品宽分布标样表,以logM对保留时间T作三阶校正曲线,计算各供试品溶液的分子量和分子量分布;EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表1,样品测定结果见表2。
选点个数 | WHO对照品 | EP对照品 | ||
---|---|---|---|---|
保留时间(min) | 分子量 | 保留时间(min) | 分子量 | |
1 | 13.421 | 18,000 | 13.808 | 14,314 |
2 | 13.713 | 15,600 | 14.217 | 12,801 |
3 | 14.063 | 13,600 | 14.617 | 11,069 |
4 | 14.404 | 12,000 | 15.008 | 9859 |
5 | 15.079 | 9600 | 15.400 | 8943 |
6 | 15.529 | 8400 | 15.775 | 7841 |
7 | 16.063 | 7200 | 16.133 | 7007 |
8 | 16.354 | 6600 | 16.343 | 6661 |
9 | 16.671 | 6000 | 16.628 | 6071 |
10 | 17.012 | 5400 | 16.961 | 5559 |
11 | 17.363 | 4800 | 17.437 | 4841 |
12 | 17.746 | 4200 | 17.726 | 4128 |
13 | 18.154 | 3600 | 18.240 | 3482 |
14 | 18.588 | 3000 | 18.605 | 3053 |
15 | 19.063 | 2400 | 19.101 | 2421 |
16 | 19.604 | 1800 | 19.664 | 1860 |
17 | 20.271 | 1200 | 20.298 | 1247 |
18 | 21.246 | 600 | 21.254 | 583 |
校正曲线 | logM = −0.00275648T3 + 0.1320164T2 − 2.238323T + 17.17206 | logM = − 0.002832371T3 + 0.1349939T2 − 2.269252T + 17.21699 | ||
相关系数R | 0.99995 | 0.99978 | ||
离差 | 0.0038896 | 0.0074436 |
表1. 硫酸钠体系对照品校正曲线
EP对照品计算结果 | WHO对照品计算结果 | 差值 | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
批号 | 重均分 子量(Da) | 小于 2000 Da (%) | 2000 Da~ 8000 Da (%) | 重均分子量(Da) | 小于 2000 Da (%) | 2000 Da ~8000 Da (%) | 重均分子量(Da) | 小于2000 Da (%) | 2000 Da~ 8000 Da (%) |
依诺肝素钠CRS | 4447 | 16.58 | 74.04 | 4393 | 16.52 | 73.75 | 54 | 0.06 | 0.29 |
5SL48 | 4265 | 17.55 | 74.46 | 4221 | 17.37 | 74.34 | 44 | 0.18 | 0.12 |
5SA66 | 4263 | 17.57 | 74.43 | 4220 | 17.29 | 74.44 | 43 | 0.28 | 0.01 |
4SC98 | 4277 | 17.33 | 74.59 | 4233 | 17.35 | 74.23 | 44 | 0.02 | 0.36 |
160202 | 4271 | 17.94 | 73.75 | 4220 | 17.82 | 73.62 | 51 | 0.12 | 0.13 |
160203 | 4347 | 17.99 | 73.02 | 4299 | 17.49 | 73.3 | 48 | 0.50 | 0.28 |
150402 | 4272 | 18.22 | 73.39 | 4228 | 17.66 | 73.76 | 44 | 0.56 | 0.37 |
150403 | 4327 | 17.54 | 73.78 | 4279 | 17.74 | 73.17 | 48 | 0.20 | 0.61 |
表2. 硫酸钠体系样品测定结果
1) 色谱条件:色谱柱:TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm);柱温:30℃;紫外检测器和示差检测器联用,紫外检测波长:234 nm,示差检测器温度:35℃;流速:0.5 mL·min−1;进样量:25 μL;流动相:0.1 mol·L−1醋酸铵水溶液。
2) 溶液的制备:
供试品溶液的制备供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量,分别加醋酸铵流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液,分别作为供试品溶液2。
系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解,作为系统适用性溶液2。
EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解,作为EP对照品溶液2。
WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg,置1.5 mL离心管中,精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解,作为WHO对照品溶液2。
3) 实验过程:
专属性和系统适用性试验
分别取空白溶剂(0.1 mol·L−1醋酸铵水溶液)、“2.2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、系统适用性溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL,注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰;系统适用性溶液2示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为22077,葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为9.22;依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.200 min)和葡聚糖2000 (保留时间为11.964 min)的保留时间之间。色谱图见图2。
图2. 醋酸铵体系专属性和系统适用性试验色谱图2
样品测定精密量取“2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL,注入液相色谱仪,记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800),采用手工取18个点,以logM对保留时间T作三阶校正曲线,计算各供试品溶液的分子量和分子量分布;根据WHO对照品宽分布标样表,以logM对保留时间T作三阶校正曲线,计算各供试品溶液的分子量和分子量分布;EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表3,样品测定结果见表4。
选点个数 | WHO对照品 | EP对照品 | ||
---|---|---|---|---|
保留时间(min) | 分子量 | 保留时间(min) | 分子量 | |
1 | 12.571 | 18,000 | 12.605 | 16,285 |
2 | 12.779 | 15,600 | 12.842 | 14,480 |
3 | 13.046 | 13,600 | 13.208 | 12,509 |
4 | 13.304 | 12,000 | 13.600 | 10,634 |
5 | 13.829 | 9600 | 13.950 | 9407 |
6 | 14.139 | 8400 | 14.300 | 8020 |
7 | 14.629 | 7200 | 14.503 | 7533 |
8 | 14.888 | 6600 | 14.742 | 6956 |
9 | 15.154 | 6000 | 15.010 | 6228 |
10 | 15.454 | 5400 | 15.311 | 5502 |
11 | 15.771 | 4800 | 15.642 | 4811 |
12 | 16.121 | 4200 | 16.012 | 4209 |
13 | 16.496 | 3600 | 16.413 | 3403 |
14 | 16.913 | 3000 | 16.851 | 2912 |
15 | 17.371 | 2400 | 17.345 | 2409 |
16 | 17.938 | 1800 | 17.934 | 1906 |
17 | 18.663 | 1200 | 18.614 | 1185 |
18 | 19.821 | 600 | 19.749 | 584 |
校正曲线 | logM = −0.002409928T3 + 0.1095525T2 − 1.823136T + 14.62927 | logM = −0.002151357T3 + 0.09614305T2 − 1.59638T + 13.36678 | ||
相关系数R | 0.99964 | 0.99964 | ||
离差 | 0.0103785 | 0.0100719 |
表3. 醋酸铵体系校正曲线
EP对照品计算结果 | WHO对照品计算结果 | 差值 | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
批号 | 重均分子量(Da) | 小于 2000 Da (%) | 2000 Da ~8000 Da (%) | 重均分子量(Da) | 小于 2000 Da (%) | 2000 Da ~8000 Da (%) | 重均分子量(Da) | 小于 2000 Da (%) | 2000 Da ~8000 Da (%) | ||
依诺肝素钠CRS | 4388 | 16.24 | 73.97 | 4381 | 16.17 | 73.78 | 7 | 0.07 | 0.19 | ||
5SL48 | 4242 | 17.54 | 73.75 | 4236 | 16.77 | 74.38 | 6 | 0.77 | 0.63 | ||
5SA66 | 4224 | 17.55 | 73.91 | 4252 | 16.95 | 74.02 | 28 | 0.60 | 0.11 | ||
4SC98 | 4236 | 17.32 | 74.10 | 4252 | 16.93 | 74.02 | 16 | 0.39 | 0.08 | ||
160202 | 4265 | 17.50 | 73.46 | 4259 | 17.20 | 73.55 | 6 | 0.30 | 0.09 | ||
160203 | 4294 | 17.48 | 73.19 | 4294 | 17.15 | 73.27 | 0 | 0.33 | 0.08 | ||
150402 | 4245 | 17.61 | 73.50 | 4250 | 17.42 | 73.36 | 5 | 0.19 | 0.14 | ||
150403 | 4294 | 17.55 | 73.11 | 4289 | 17.22 | 73.25 | 5 | 0.33 | 0.14 | ||
表4. 醋酸铵体系样品测定结果
伯小霞等 [
从计算过程中不难发现,EP对照品需串联紫外检测器和示差检测器,并计算两个检测器的延迟时间,且取点过程非常复杂,还需应用EXCEL协助计算;而WHO对照品只需根据宽分布标表即可计算,相对简单,易于操作。目前,中国药典2015年版二部仅收录了肝素钠,其分子量对照品为类似于WHO的宽分布对照品并提供了分子量表。包括依诺肝素钠在内的低分子量肝素还没有分子量测定国家对照品,本文研究结果对该品种国家对照品的研制有重要意义。
本文在研究过程中得到校企合作单位鲁南制药集团大力支持,在此表示感谢。
徐勤娟,崔洪萌. 对比研究宽分布对照品测定依诺肝素钠分子量Comparative Study on the Determination of Molecular Weight of Enoxaparin Sodium by Broad Distribution Reference Substance[J]. 分析化学进展, 2019, 09(01): 30-37. https://doi.org/10.12677/AAC.2019.91005